CN108603879B - 样品多重循环和原位成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法，该方法能够以快速、高灵敏和可靠的方式通过同一样品上的多分子读数对各种分子靶标进行成像。本发明还涉及防止样品和成像试剂降解的成像缓冲液，其特别适用于本发明通过多重循环对样品进行原位成像的方法。

Description

样品多重循环和原位成像的方法
发明领域
本发明一般涉及通过多重循环(cycle multiplexing)对样品，特别是生物样品进行原位成像的领域。
发明背景
基于图像的样品分析测量技术受到可以在单个样品(例如组织样品)中同时观察到的分子测量数量(多重化程度)的限制。到目前为止，与其他高度多重技术相比，如单细胞测序或质量细胞计数法，这已经限制了大规模“组学”的这种分析方法的使用。因此，目前只有基于图像的方法可以揭示的基本空间细节正在被丢失。使用免疫荧光而不是经典免疫组化可以部分克服这个问题，但测量仍然限于最多4-5个同时分子读数。基于图像的多重(multiplexed)样品分析测量的主要限制是在单个样品中分离不同的信号，没有信号之间的串扰。例如，在荧光成像的情况下，在高度多重的多色标记实验中，光谱的重叠阻止了发射信号的清晰分离。此外，荧光团可能在高标记密度下表现出自猝灭行为，进一步限制了多个标记的同时应用。对基于免疫的方法的多重能力的另一个限制是要求每种第一抗体必须来自不同的动物物种，以确保用第二抗体进行特异性扩增和检测。这原则上可以通过直接免疫荧光克服，换句话说直接标记第一抗体，但是这种方法引起了其他问题，例如由于缺乏扩增而降低的特异性和较低的信号输出。
使用WO 2007/047450中所示的抗体混合方法，使用已经实现的免疫荧光进行多分子读数。尽管这种方法具有基于图像的优点，适用于组织切片并且能够在含有非特异性核酸酶的环境中使用，但同时检测的最大数量是有限的。将可量化的参考标准包括在测量过程中，如WO 2008/005464中所述，同时提高某些应用，如生物标志物蛋白的半定量评分中定量免疫组化读数的精确度，例如当应用于乳腺癌组织中人表皮生长因子2(HER2)表达的半定量评分时，由于将输出信号分成特定条带，可进一步限制多个同时读数的可能性。通过进行多重光谱可以实现具有原位成像的多重样品，其包括在同一样品上施加不同的染料，并从成像结果中提取单个染色图像，如EP 1131631中所述。该技术涉及从样品的每个像素收集光谱数据，计算生成来自每个单独染色的光谱并且在校正的色谱中显示各个结果。在允许多标记量化的同时，由于每个信号之间可能存在串扰，因此器件性能与平行染色的数量成反比。
在克服上述限制方面，免疫染色技术的最新进展是非常有希望的。这些技术利用多循环原位成像，其包括在通常的染色/成像步骤之后的染料灭活和/或抗体洗脱，以实现额外轮次的染色和成像。
这些方法包括每次图像采集后荧光染料的化学灭活(Gerdes等，2013，PNAS，110(29)，11982-11987)，通过依次使用特制的酸化高锰酸盐溶液用于连续染色循环的抗体-抗原键的非破坏性解离(WO2010/115089)，用各种不同的缓冲液进行连续抗体洗脱(Pirici等，2009，J.Histochem.Cytochem.，57(6)，567-575)，连续循环的肽探针接触和高温变性用于连续多靶检测(WO2009/11714)，使用变性和洗脱技术的结合进行反复染色和成像循环(Wahlby等，2002，细胞检测(Cytometry)，47(1)，32-41)，在每个重染色步骤之前用漂白进行多次连续染色循环(Friedenberger，2007，自然实验手册，2，2285-2294)，使用生物共轭量子点作为用于分子生物标志物的多重分析的生物标记(Schubert等，2006，自然生物技术24,1270-1278)，使用水溶性聚合物与多个目标靶分子形成键(Xing，2007，自然实验手册2，1552-1165)。
所有这些多循环原位成像方法都是重复的并具有以下优点：允许随后利用在相同物种中产生的第一抗体以及用于不同分子靶标的相同化学试剂或荧光团，并且理论上能够在同一组织切片上识别无限数量的不同目标。
虽然很有希望，但将多循环原位成像技术转化为样品(例如肿瘤切片)的高通量的多重分子谱分析并不简单。首先，长时间温育和洗涤循环(通常长达数小时)导致极长的总流程持续时间，其在波动的环境条件下引起组织抗原的降解。其次，重复安装/拆卸样品盖玻片的成像步骤会进一步降低组织的完整性。因此，这种循环的手动处理影响再现性并且实际上阻碍了高通量的组织样品的可靠分子谱分析，并且使得多循环技术的使用在诸如需要高通量、可靠性和相对低成本实施特性的诊断目的的应用中不实用。
可用于样品原位成像的现有方法的进一步限制也源于用于实现多循环测定的大面积成像要求。由于从成像系统中取出样品以在每个循环之间实现手动处理，并且在手动处理之后，将样品恢复到成像系统用于大面积成像后续分子标记，并且覆盖从所有循环的样品中获得的图像，在每个循环的成像系统上的定位的样品的细微差异引入在整个样品中分子信号定位的误差。这阻碍了分子信号的真正定位，特别是那些只能用高分辨率或超分辨率显微镜系统观察到的亚细胞特征。
还引入了垂直微流体系统作为用于免疫测定或遗传分析中可能使用的工具。已开发出一种由宽腔室和垂直通道孔组成的微流体探针，用于对样品上的小区域斑点进行染色(WO 2014/001935)。每个循环中染色区域的尺寸约为100μm。因此，用许多染色步骤扫描样品表面以获得更大的图像是有必要的。由扫描过程引起的可能的定位误差和分析时间增加的问题也存在于该方法中。最近已经提出了一种开放式微流体装置，有助于在顺序染色和成像步骤之间更容易地转换(WO2014/035917)。该方法旨在克服了在每次连续运行之间不得不去除样品盖玻片的几个缺点，比如，通过消除对此步骤的需要，额外时间消耗、组织损失和片到片的图像变化，而没有解决成像区域和处理时间要求。
最后，已经观察到涉及样品的顺序和重复荧光团暴露的原位成像导致样品的诱导损伤。具体地，荧光标记的抗体通常在成像期间与样品或组织交联，并且之后不能从样品或组织中除去，这进一步限制了通过多重循环的原位成像的使用。
因此，需要新技术、仪器和工具用于通过多重循环的样品的原位成像，这将允许在同一样品上进行多分子读数，对分子信号的真正定位具有高通量、高灵敏度、可靠性和精确性，特别应用于诊断或治疗过程监测领域，目前其需求正在大幅增加。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种用于多重循环的样品的原位成像的方法，该方法能够以高效、准确和可靠的方式通过同一样品上的多分子读数对各种分子靶标进行成像。
提供一种用于多重循环的样品的原位成像的方法是有利的，该方法能够以快速和灵敏的方式对同一样品上的各种分子靶标进行成像。
提供一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法是有利的，其中，通过避免在多重过程的每个循环之间从样品支架上卸下样品来维持样品的完整性。
提供一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法是有利的，其中，通过避免需要在多重过程的每个循环之间从样品支架上卸下样品来减少总分析时间，并且通过防止因卸载而导致的再现性降低。
提供一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法是有利的，其中固定在微流体通道内的样品支架上的样品直接在样品表面经受完全可控的成像探针流，该样品以特定顺序直接在样品表面流动，用于进行样品标记和成像的完整循环并以高通量方式重复这种循环。
提供一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法是有利的，其中通过使用成像缓冲液在成像循环期间保持样品完整性，防止样品降解和在多重过程中通过氧自由基的形成降解成像探针。
提供一种防止成像试剂在高强度荧光下交联的成像缓冲剂是有利的，当在本发明的多重循环的原位成像方法中使用时，减少了每个后续循环所需的试剂洗脱时间，并增加了可能的样品标记循环的次数，而不降低所测量的成像信号的再现性和/或灵敏度。
通过提供权利要求1的方法实现了本发明的目的。
根据本发明的第一方面，本文公开了一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法，包括以下步骤：
(i)提供固定在样品支架上的样品；
(ii)提供微流体装置，其包括微流体室，将在所述微流体室的一端的至少一个流体入口和在所述微流体室的另一端的至少一个流体出口配置成在压力下通过微流体室传导从流体供给系统供应的流体，用于以均匀的方式在所述微流体室内平流输送流体物质和试剂，其中微流体室的至少一个壁由样品支架形成，并且其中微流体室的体积为约2.5μl至200μl；
(iii)将所述样品支架安装在所述微流体室上，样品面向微流体室的内部；
(iv)依次注入多种试剂，包括至少一个成像探针，通过流体入口进入微流体室，流速范围为约1μl/s至约100μl/s；
(v)对由与所述至少一个成像探针反应的样品的组分发射的信号成像；
(vi)用不同的成像探针重复步骤(iv)和(v)；
其中所述依次注入多种试剂包括：
-洗脱步骤，向其中注入洗脱缓冲液以除去可能残留在样品上的标记探针(例如抗体或标记物)等不需要的物质；
-非特异性结合阻断步骤，向其中注入封闭液；
-样品标记步骤，向其中注入成像探针；和
-任选的预成像步骤，向其中注入成像缓冲液，其中这些步骤中的每一步之前和/或之后可包括任选的洗涤步骤，所述洗涤步骤中注入洗涤缓冲液。
附图简要说明
图1是实施例1中所述的实施本发明方法的装置的示例性设置的说明。
图2显示了在该方法的成像循环中使用的试剂顺序(reagent sequence)(2A)，同时省略每个主要流程步骤(SI到S4)之间的任选的洗涤缓冲液步骤，以及使用针对样品上的各种目标组分(T1，T2，Tn)的抗体作为标记探针的多样品标记和成像过程的流程图，所述标记探针显示注入的试剂的顺序(sequence)和顺序的重复，使用不同的试剂n次(2B)。
图3是如实施例2中所述的本发明的方法中所用的样品的通过共聚焦荧光显微镜在40倍放大倍数下获得的图像。A：PBS用作本发明多重方案的成像缓冲液，并发生抗原和抗体之间的交联；B：将由补充有自由基清除剂(10mM水溶性维生素E(Trolox))的PBS组成的成像缓冲液用作本发明多重方案的成像缓冲液，并防止抗原和抗体之间的交联。
图4显示了在单个乳腺癌组织切片上的各种生物标记物的多重共定位染色的实施例3期间获得的连续图像。图像顺序A至G对应于手册中所示的获取顺序。
发明详述
参考附图，特别是首先参考图1和2，提供了通过多重循环对样品进行原位成像的方法的说明，包括以下步骤：
(i)提供固定在样品支架(2)上的样品(1)；
(ii)提供微流体装置(3)，其包括微流体室(4)，将在所述微流体室的一端的至少一个流体入口(6)和所述微流体室的另一端的至少一个流体出口(7)配置成在压力(8)下通过微流体室传导从流体供给系统供应的流体，用于以均匀的方式在所述微流体室内(10)平流输送流体物质和试剂，其中微流体室(5a)的至少一个壁由样品支架(2)形成，并通过支持装置(11)以可拆卸的方式安装到微流体室(5b)的另一个壁上，其中微流体室的体积为约2.5μl至200μl；
(iii)将所述样品支架安装在所述微流体室上，样品(1)面向微流体室(12)的内部；
(iv)依次注入多种试剂，包括至少一个成像探针，通过流体入口(6)进入微流体室，流速范围为约1μl/s至约100μl/s；
(v)对由与所述至少一个成像探针反应的样品的组分发射的信号成像；
(vi)用不同的成像探针重复步骤(iv)和(v)；
其中所述依次注入多种试剂包括：
-任选的洗脱步骤(S1)，注入洗脱缓冲液以除去可能残留在样品上的标记探针(例如抗体或标记物)等不需要的物质；
-非特异性结合阻断步骤(S2)，注入封闭液；
-样品标记步骤，注入成像探针(S3包括S3'和S3”')；和
-预成像步骤(S4)，注入成像缓冲液，这些步骤中的每一步之前和/或之后可包括任选的洗涤步骤，所述洗涤步骤中注入洗涤缓冲液。
在另一个实施方式中，成像探针是适合与样品上的特定分子实体相互作用的标记探针。例如，成像探针可以是标记的RNA或DNA序列，其可用于与来自样品的RNA或DNA序列原位杂交(互补序列)。在另一个实例中，成像探针是直接结合靶抗原的标记的第一抗体(例如荧光)。
在另一个实施方式中，成像探针由注入标记探针序列(例如特异性抗体和色原体或荧光检测分子)产生，靶向样品内待分析的分子实体。在一个实施方式中，成像探针由在第一抗体后注入的标记的第二(例如荧光)抗体产生。
根据一个具体实施方式，注入的多种试剂的流速为约1μl/s至约30μl/s，例如约5μl/s至约30μl/s(例如约25μl/s)。
根据另一具体实施方式，所定义的微流体室的高度是从样品支撑壁到微流体室的相对壁的距离，范围为约10μm至约300μm，微流体室的对角线或直径在约100μm和约56mm的范围内，形成浅且宽的几何形状。
在另一个实施方式中，注入的多种试剂的顺序的每个步骤进行一段必要的时间，以冲洗来自微流体室的溶液流动步骤顺序中的之前的溶液，其中冲洗对应于先前溶液的浓度降低至先前注入浓度的1％。
在另一个实施方式中，注入的多种试剂的顺序的每个步骤进行一段必要的时间，将注入溶液的浓度增加高达微流体室内预期方案浓度的99％。
在一个实施方式中，注入的多种试剂的顺序中的每个步骤持续约1s至约120s，例如约5s至约20s(例如约10s)。
在另一个具体实施方式中，依次注入多种试剂的步骤包括：
-洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SO)；
-非特异性结合阻断步骤(S2)，注入封闭液；
-任选的温育步骤，将先前注入的封闭缓冲液在有或没有任何流动的条件下温育；
-任选的洗涤步骤，注入洗涤缓冲液；
-样品标记步骤，注入成像探针(S3)；
-任选的温育步骤，将先前注入的成像探针在有或没有任何流动的条件下温育；
-洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(S3a)；
-可选的预成像步骤(S4)，注入成像缓冲液；
其中样品标记步骤包括直接注入标记的探针或导向成像探针的标记探针序列。
根据一个具体实施方式，样品标记步骤包括注入导向成像探针的标记探针序列，其包括注入第一抗体的第一步(S3')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(S3”)，和另一步骤，其中注入标记的第二抗体(S3””)。
在一个具体实施方式中，样品标记步骤包括第一步，其中注入第一抗体(SB3')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SB3”)，第二步，其中注入酶联的第二抗体(SB3”')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SB3””)，和另一步骤，注入与连接到第二抗体的酶反应的色原或荧光检测分子SB3””'。
在另一个具体实施方式中，样品标记步骤包括第一步，其中注入第一抗体(SB3')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SC3”)，第二步注入一抗后抗体，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SC3”)，第三步，其中注入酶联的第二抗体(SC3”')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(SC3"")，和另一步骤，注入与连接到第二抗体的酶反应的色原或荧光检测分子SB3””'。
在另一个具体实施方式中，样品标记步骤包括注入至少一种标记的探针，这样可以与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交，例如标记的RNA或DNA探针。
在另一个具体实施方式中，当样品标记步骤包括注入至少一种标记的探针时，这样可以与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交，本发明的方法还包括在所需的微流体室内施加温度循环，用于样品中的一些DNA/RNA物质与RNA或DNA探针(互补序列)杂交和去杂交的步骤。例如，微流体室或样品支架外部的加热器可以应用这样的温度循环。例如，如现代病理学，2011,24,613-623；DOI：10.1038/modpathol.2010.228中所定义的，可以实现原位杂交)。然后在固定的杂交探针上实现成像，用于RNA和DNA序列检测(标记的互补序列探针)。
在一个具体实施方式中，当样品标记步骤包括注入至少一种标记探针时，这样可以与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交，在注入标记探针之后注入成像缓冲液，特别是例如包含至少一种如本文所述的抗氧化剂和/或自由基清除剂的成像缓冲液。
在另一个具体实施方式中，当样品标记步骤包括注入至少一种标记的探针时，这样用于与样品内所用的一些DNA/RNA物质进行原位杂交，在施加温度循环(例如，在约10℃至约100℃的温度范围内)下进行洗脱步骤，以确保在用另一个样品标记步骤重复该方法之前去除可能残留在样品上的不需要的原位杂交探针或标记物。在这种情况下，洗脱缓冲液可以包含如Zhang等，2011,17(10)：2867-2873中所述的碱性去杂交(dehybriziation)缓冲液(例如pH 11.2)，，在进行新的样品标记步骤之前，洗脱步骤之后用洗涤缓冲液在去杂交温度(例如，在约10℃至约100℃的温度范围内)下进行洗涤步骤。
在一个具体实施方式中，注入的多种试剂的顺序中的每个步骤包括针对每种试剂的两个流速步骤：
-第一流速步骤，以约1μl/s至约100μl/s的范围的初始流速注入试剂；
-第二流速步骤，在注入顺序中的下一个试剂之前，在较低流量下(通常约0.001-约1.0μl/s)注入相同的试剂以确保所述试剂与样品的充分通量。
在另一个具体实施方式中，试剂的第二流速步骤持续约1分钟至约30分钟(例如约2至约15分钟)。
根据具体实施方式，第二流速步骤的持续时间取决于所用的微流体通道的体积和试剂与样品温育所需的时间。小于100μm的腔室高度所需的计算出的温育时间约为1分钟。
在一个实施方式中，成像步骤(v)通过共聚焦荧光显微镜进行。
在一个实施方式中，成像步骤(v)通过荧光显微镜进行。
在一个实施方式中，成像步骤(v)通过明视显微镜进行。
根据一具体实施方式，洗涤缓冲液选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris缓冲盐水(TBS)。
根据一个具体实施方式，洗脱缓冲液选自含有添加有去污剂(TritonX)的低pH(例如pH 2)的溶液。洗脱缓冲溶液还可含有高离子盐浓度(例如约0.001M NaCl至约1M NaCl)、离液剂和/或还原/氧化剂。
根据一个具体实施方式，封闭缓冲液选自柠檬酸钠缓冲液和含有蛋白质(例如牛血清白蛋白或血清)和/或去污剂(例如吐温)的PBS。
根据一个具体的实施方式，非特异性结合阻断步骤(S2)是任选的。
根据一个具体实施方式，样品标记步骤包括第一步，其中注入第一抗体(S3')，洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(S3”)，和另一步骤，其中注入第二抗体(S3””)。
根据一个具体实施方式，本发明的第一抗体可以是用于任何免疫组织化学和免疫荧光测定的任何合适的抗体，例如在Dabbs，诊断免疫组织化学：治疗诊断学和诊断应用，第4版，2014，ISBN 978-1-4557-4461-9中所述。例如，合适的抗体是针对临床相关表位的小鼠或兔抗人免疫球蛋白G或Y抗体。
根据另一个具体实施方式，成像缓冲液包含至少一种抗氧化剂和/或自由基清除剂。抗氧化剂和/或自由基清除剂的实例选自抗坏血酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(水溶性维生素E，Trolox)、环辛四烯、硫辛酸和4-硝基苄醇。
根据另一具体实施方式，成像缓冲液选自蒸馏水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris缓冲盐水(TBS)。
根据另一具体实施例，本发明的成像缓冲液包含至少一种抗氧化剂和/或自由基清除剂，其中所述至少一种抗氧化剂和/或自由基清除剂是可溶形式的，即成像缓冲溶液的形式(Altman等，2011，Nat Methods，9(1)，68-71)。
在另一个实施方式中，流量以连续的方式施加。
根据一个具体实施方式，本发明的方法包括步骤(iv)至(vi)的至少约2至80个循环，特别是步骤(iv)至(vi)的至少约20至80个循环。
根据一个具体实施方式，本发明的方法包括步骤(iv)至(vi)的2至约达到200个循环，特别是2至约20个循环或2至约100个循环。
根据本发明的另一个方面，本文公开了一种成像缓冲液，其包含至少一种抗氧化剂和/或自由基清除剂，具体地，所述至少一种抗氧化剂和/或自由基清除剂的浓度包括在1mM至约1000mM之间(例如，约10至约1000mM或约1至约10mM)。
根据进一步的实施方式，提供了本发明的成像缓冲液，其包含约10至约1000mM的抗坏血酸(例如约100mM)或约1至约10mM的水溶性维生素E(Trolox)或硫辛酸。
在另一个实施方式中，提供了一种通过如上所述的多重循环对样品进行原位成像的方法，其中本发明的成像缓冲液在预成像步骤中注入。
根据一个方面，本发明的方法允许对各种样品，特别是生物样品，包括组织切片、细胞培养物、蛋白质或核酸制剂进行多重循环的分子谱分析，对样品进行原位成像。
根据另一方面，提供通过不同类型的技术固定，包括福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品、低温固定的组织样品、细胞涂片、针吸活组织检查样品和固定细胞制剂的用于本发明方法分析的样品，根据样品类型和所需应用，可以实现不同类型的样品制备步骤。
根据另一方面，标记探针包括化学染料、抗体和抗体片段，或导向成像探针，例如原位杂交或扩增探针的寡核苷酸。
可以以任何适当的方式组合上述特征。
本发明的一个有利特征是提供一种方法，在该方法中，温育、洗涤和洗脱循环时间减少到几分钟，防止样品抗原在波动的环境条件下和暴露于苛刻的(harsh)缓冲液期间的降解。
本发明的一个有利特征是提供一种方法，该方法允许进行常规样品标记，例如与常规检测系统结合的常规第一抗体和第二抗体，而不需要用于多重标记的专用或定制的试剂、缓冲液或检测系统。
本发明方法的显著优点是无需在每个成像循环中重复安装和拆卸样品盖玻片，这可能会影响样品的完整性并导致重现性降低，并妨碍这种过程的完全自动化，这对于可重复标记也是必不可少的。
本发明方法的另一个显著优点是使用100％的样品区域进行多重分析。
本发明的另一个有利特征是提供一种方法，其通过在成像步骤期间使用特定的成像缓冲液组合物，可以进一步改善多循环性能，以在进行下一个分析步骤之前，在洗脱步骤中从分析物中有效地去除标记探针如荧光分子，并防止样品标记步骤中使用的样品或标记分子的光诱导改变。
除样品分析外，本发明的方法可用于多重基因序列检测，例如通过原位杂交进行检测。
本发明的其他特征和优点将从权利要求、详细描述和附图中显而易见。已经描述了本发明，以下实施例是以说明而非限制的方式给出的。
实施例
实施例1：用于进行连续样品标记循环的多重流程的实例
通过多重循环对样品进行原位成像的本发明的方法在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品上的装置中实施，如图1所示。
a)样品制备例
不同类型的样品制备步骤的实现取决于样品类型和所需的应用。在本实施例中，将这里描述的在多染色过程之前进行的FFPE组织样品的样品制备步骤作为典型实例。
首先将生物样品在65℃下脱水10分钟。冷却5分钟后，将组织切片在脱蜡剂(Histoclear)溶液(例如二甲苯)中脱蜡10分钟，然后分别在100％、95％、70％和40％(体积/体积)乙醇中再水合(rehydration)。最后，热诱导的抗原修复过程用柠檬酸钠缓冲液(约pH6)或EDTA缓冲液(约pH9)在95℃水浴或电压力锅中进行约20分钟。确切的方案取决于使用的标记探针。然后准备好样品进行本发明的方法，如以下示例性装置中所示。
b)用于实施本发明方法的装置的实例
图1显示了用于实施本发明方法的示例性装置(3)的横截面，其中样品(1)，例如在a)下制备的样品固定在样品支架(2)上，其中所述样品支架保持在面向所述微流体室的流体进料入口的微流体室(5b)的壁上，使得样品(1)面向微流体室的内部。
c)成像试剂顺序的实例
本发明的多重方法的初始循环可以在组织和试剂制备后开始。在图2A中概述了用于进行连续样品标记和成像循环的本发明的多重方法中使用的成像试剂顺序(包括洗涤/洗脱液、封闭液、标记的探针溶液等)。这种成像试剂顺序通过给液系统(8)，通过流体入口(6)连续地引入微流体室(4)中。
步骤0：洗涤步骤
每个循环从首先通过使缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris缓冲盐水(TBS)流过系统来清洗组织样品开始。
步骤1：洗脱步骤
在成像试剂的顺序中，洗涤缓冲液之后为洗脱缓冲液，其组成和pH条件可以根据分析的样品而变化，以去除可能残留在样品上的不需要的物质(例如标记探针，例如抗体或标记物)。例如，含有0.05％TritonX去污剂的pH2的0.1M甘氨酸缓冲液可用作洗脱缓冲液。
步骤2：非特异性结合阻断步骤
然后将封闭缓冲液(例如柠檬酸钠缓冲液或含有牛血清白蛋白的PBS-吐温)以成像试剂序列的顺序通过微流体室，以降低后续步骤中蛋白质的非特异性结合。
步骤3(3'，3”和3”')：样品标记步骤
然后将成像探针或导向成像探针的标记探针引入在微流体通道中流动的成像试剂的顺序中。例如，导向标记探针的标记探针序列包括将第一抗体和第二抗体(标记探针)流过并温育的序列，同时在每个步骤之间用洗涤缓冲液洗涤样品。标记探针的稀释比例取决于优化的方案或供应商说明书。或者，样品标记步骤的另一个实例包括注入RNA或DNA标记的探针用于原位杂交。在这种情况下，该方法还包括应用合适的温度循环以确保样品中RNA或DNA物质与RNA或DNA标记探针的互补序列杂交。
第4步：成像步骤
在循环结束后进行成像，最终在成像缓冲液已经在微流体通道中流动之后进行成像。
使用不同的成像探针可以将整个循环过程重复多达约50次。在根据原位杂交实现样品标记的一个循环的情况下，该方法还可以包括施加温度循环以确保在用另一个样品标记步骤，例如，在洗脱步骤中重复该方法之前去除可能残留在样品上的不需要的原位杂交探针或标记物。
图2B显示了多样品标记和成像过程的流程图的示例，其中作为靶向样品上的各种靶标(T1、T2、Tn)的标记探针的第一(a)和第二(b)抗体显示如图2A所示的成像试剂顺序的不同步骤的顺序重复，并重复顺序n次。下表1显示了典型应用的一个样品标记循环的示例时序图。每个循环可以减少到大约10分钟以内，从而导致在该特定情况下进行约50个循环的样品标记所需的样品标记时间约为5小时。成像时间取决于荧光通道的数量、成像区域和每个循环所需的分辨率，每步的变化范围为1分钟至120分钟。因此，成像和样品标记所需的总时间可以低至约6小时，以完成50个样品标记的循环和成像。
表1
Figure GDA0002894516590000131
d)样品测量的实例
用本发明的方法进行的连续样品标记循环的成像结果如下所述。
细胞培养
HeLa Kyoto细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)中于37℃和5％CO2培养。在胰蛋白酶消化和重悬后，在洁净室清洁的无菌条件下移液细胞悬液，将超薄硼硅酸盐玻璃载玻片(25×75mm，厚度170μm)置于10cm培养皿内，并生长2-3天直至它们达到约80％的覆盖率(confluence)。
固定
将含有在顶部生长的细胞的载玻片从培养皿中取出并在含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)的玻璃罐中洗涤，然后浸没在含有4％多聚甲醛(PFA)的PBS中30分钟。
透化作用
用PBS再次洗涤载玻片，然后浸没在添加有0.25％Triton-X去垢剂的PBS中15分钟。然后，将载玻片插入如本文所述的用于实施本发明方法的装置中。
多重步骤
在装置中进行样品标记、成像和洗脱的反复循环并进行成像。
洗涤：以25μl/s的流速施加PBS 10秒。(S0)
封闭：以15μl/s的流速施加添加有5％山羊血清的PBS 10秒，然后在0.015μl/s的连续流速下温育2分钟。(S2)
一抗结合：将含有5％山羊血清和抗原特异性鼠抗人、兔抗人一抗(用于任何免疫组织化学和免疫荧光测定的一抗，如Dabbs，2014，同上所述)(稀释度为1：10-1：1000，取决于一抗溶液的浓度和抗体的亲和力)的PBS以15μl/s的流速施用10秒，然后在0.015μl/s的连续流速下温育15分钟。(S3')
洗涤：以25μl/s的流速施加PBS 10秒。(S3")
二抗结合：以15μl/s的流速施加分别用Alexa荧光团568和647标记的含有5％山羊血清、DAPI和山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(稀释度1：250,8μg/ml)的PBS 10秒，然后在0.015μl/s的连续流速下温育15分钟。(S3'")
洗涤：以25μl/s的流速施加PBS 10秒。(S3a)
成像：以25μl/s的流速施加成像缓冲液(补充有100mM抗坏血酸的PBS)10s，然后在整个成像过程中以0.015μl/s连续施加。(S4)
然后在共聚焦旋转盘显微镜上以40x放大倍数在三个单独的通道中获取图像用于DAPI(4'，6-二脒-2-苯基吲哚)染色(暴露于405nm)和两种免疫荧光染色，Alexa荧光团488和568(分别在488和561nm处曝光)。扫描大面积约500-1,000个采集点，每个采集点每个通道采集10个焦平面。在每个循环中获取DAPI通道，因此可以作为参考跨循环，用于在循环之间转换的情况下计算比对在不同循环中获取的图像。
洗涤：以25μl/s的流速施加PBS 10秒。
洗脱：以15μl/s的流速施加洗脱缓冲液(pH2的含有0.05％TritonX去污剂的0.1M甘氨酸溶液)10秒，然后在0.015μl/s的连续流速下温育1分钟。该步骤进行两次。
实施例2：在本发明的方法中使用本发明的成像缓冲液的实例
本实施例说明了本发明的成像缓冲液的使用，其用于提高在高强度光下从样品中去除荧光分子的效率，这在本发明的方法中特别有用。
根据如实施例1所述的多重方案，将福尔马林固定的HeLa细胞应用于一个样品标记循环。然后，单独使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与自由基清除剂组合作为成像缓冲液进行成像。然后，如实施例1所述进行洗脱步骤，并进行第二次样品标记循环，省略第一抗体结合步骤，并且当与第一轮成像相比时扫描更大的成像区域，同时保持所有其他成像参数例如激光强度和曝光时间不变。在所示图像中，轮廓边框表示第一轮成像的获取区域。
图3A显示了仅存在PBS的情况下成像后抗原和抗体之间的光诱导交联。
图3B显示了在含有10mM Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)的PBS存在下成像时，暴露于相同的预标记和标记条件的类似的样品。
这些数据支持，向成像缓冲液中加入抗氧化剂和/或自由基清除剂可防止用于原位成像样品的方法中抗原和抗体之间的光诱导交联，从而提高了从经历多重循环的样品中去除荧光分子的效率，因此导致本发明方法的通量增加。
实施例3：乳腺肿瘤样品上ER、CK、PR和HER2的多重共定位染色
可以染色福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片，同时还使用本发明公开的方法在每个步骤之间对样品成像。作为说明性实例，对雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、细胞角蛋白(CK)和表皮生长因子受体2(HER2)呈阳性的FFPE乳腺肿瘤切片已使用本发明的顺序多重方法进行染色，依次使用根据从初步测试结果得到的数据确定的多个试剂和成像步骤。首先制备样品用于通过如前述实施例中所述的脱蜡、再水合和抗原修复过程进行染色，然后进行本发明的原位成像方法，总结于下表2中。使用具有不同波长的荧光检测探针(Alexa Fluor)的夹心测定法在成像步骤中检测每种标记物。为了有效洗脱抗体，洗脱缓冲液(EB)和十二烷基硫酸钠(SDS)的组合已用于洗脱步骤。在每次染色(成像步骤1至4)后拍摄对照图像，以验证靶向的生物标记物(ER、PR、CK和HER2)的特异性检测，并且在从下一个循环开始的每个洗脱步骤之后，在下一个成像步骤中染色待成像的下一个生物标记物之前，验证是否完全去除抗体。为了对同一载玻片成像和再染色，已经使用基于甘油的封固溶液(SlowFade Gold)。在该方法期间获得的连续图像在图4中示出，显示每次染色(A、C、E和G)和洗脱步骤(B、D和F)后的样品图像，以证明染色和洗脱效率。
表2
Figure GDA0002894516590000161
Figure GDA0002894516590000171
结果表明，本发明的多重方法有利地允许在具有高染色效率和对比度的相同生物样品上获得用于各种生物标记物的多重共定位染色，其中，在约40分钟的有限的总实验时间内，在目的生物标记物上选择性地进行染色，而不需要用于各种生物标记的不同成像试剂之间的相互作用。

Claims (13)

1.一种通过多重循环对样品进行原位成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(i)提供固定在样品支架上的样品；
(ii)提供微流体装置，其包括微流体室，将在所述微流体室的一端的至少一个流体入口和所述微流体室的另一端的至少一个流体出口配置成在压力下通过微流体室传导从给液系统供应的流体，用于以均匀的方式在所述微流体室内平流输送流体物质和试剂，其中所述微流体室的至少一个壁由样品支架形成，并且其中微流体室的体积为2.5μl至200μl；
(iii)将所述样品支架安装在所述微流体室上，样品面向微流体室的内部；
(iv)依次注入多种试剂，包括至少一个成像探针，通过流体入口进入微流体室，流速范围为1μl/s至100μl/s；
(v)对由与所述至少一个成像探针反应的样品的组分发射的信号成像；
(vi)用不同的成像探针重复步骤(iv)和(v)；
其中所述依次注入多种试剂包括：
-洗脱步骤(S1)，在该步骤中注入洗脱缓冲液以除去可能残留在样品上的不需要的物质；
-非特异性结合阻断步骤(S2)，在该步骤中注入封闭液；
-样品标记步骤(S3)，在该步骤中注入成像探针；和
-任选的预成像步骤(S4)，在该步骤中注入成像缓冲液，
其中这些步骤中的每一步之前和/或之后，包括任选的洗涤步骤，所述洗涤步骤中注入洗涤缓冲液，
其中所述至少一种成像探针是由注入特异性抗体序列作为标记探针和色原或荧光检测分子产生的，靶向在所述样品内待分析的分子实体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注入的多种试剂的顺序中的每个步骤包括针对每种试剂的两个流速步骤：
-第一流速步骤，在该步骤中以1μl/s至100μl/s的初始流速注入试剂；
-第二流速步骤，在该步骤中，在注入顺序中的下一个试剂之前，以较所述初始流速低的流速注射相同的试剂以确保将所述试剂与样品一起温育。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一流速步骤持续1s至120s。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，试剂的所述第二流速步骤持续1分钟至30分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品标记步骤包括第一步骤(S3')，其中注射第一抗体，洗涤步骤(S3”)，其中注射洗涤缓冲液和另一步骤(S3””)，其中注射第二抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，依次注入多种试剂，步骤包括：
-洗涤步骤(S0)，其中注入洗涤缓冲液；
-非特异性结合阻断步骤(S2)，其中注入封闭液；
-样品标记步骤(S3)，在该步骤中注入成像探针；
-洗涤步骤(S3a)，其中注入洗涤缓冲液；
-任选的预成像步骤(S4)，在该步骤中注入成像缓冲液，其中样品标记步骤包括第一步骤(S3')，其中注射第一抗体，洗涤步骤(S3”)，其中注射洗涤缓冲液和另一步骤(S3””)，其中注射第二抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品标记步骤包括注射至少一种标记的探针，这样可以与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标记的探针为标记的RNA或DNA探针。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品标记步骤还包括在所述微流体室内施加温度循环，用于使所述样品内的DNA/RNA物质与所述RNA或DNA探针杂交。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，成像步骤(v)通过荧光显微镜或明视显微镜进行。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(iv)至(v)的至少2-80个循环。
12.如权利要求7的方法，其特征在于，在步骤(vi)中所述洗脱步骤在施加温度循环的同时进行，以确保在用另一个样品标记步骤重复该方法之前去除可能残留在样品上的不需要的原位杂交探针或标记物。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，存在预成像步骤。
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