CN115856315A - 一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，涉及蛋白质检测领域，所述方法使用适配体作为样品检测探针，代替了使用抗体作为探针的传统检测方法，适配体探针体积仅1‑15kDa，扩散快，探针孵育时间更短，成像速度快，节省实验时间，降低人力时间成本，并且具有更高的表位结合密度、更好的表位识别能力和更好的结构识别能力以特异性靶标目标蛋白，可提高目标蛋白质的检测灵敏度，小体积的检测探针更易洗脱多余探针，降低检测背景荧光，易于合成和修饰，价格低廉，免疫原性低。

Description

一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法

技术领域

本发明涉及单细胞免疫印迹领域，尤其涉及一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法。

背景技术

单细胞免疫印迹技术(single cell immunoblotting)是UC伯克利大学的AmyHerr教授提出的一种单细胞蛋白质检测技术，使用对靶标蛋白质具有特异性的抗体探针来检测细胞中单细胞。由于蛋白质凝胶电泳和抗体识别的整合，因此单细胞免疫印迹技术受抗体交叉反应性的干扰较小。因此单细胞免疫印迹技术能够特异性地检测单细胞中不同分子量的蛋白质。并且由于水凝胶芯片上具有数千个细胞阱，因此单细胞免疫印迹技术可以在一张水凝胶微芯片上同时进行数千个单细胞内不同单细胞表达水平的测定，同时在群体和单个细胞尺度上进行细胞异质性的研究。

基于抗体的单细胞免疫印迹往往只能分离分子量在30-250kDa的蛋白质，极大地限制了单细胞免疫印迹技术的应用。为了避免蛋白质扩散，小分子量蛋白质(分子量在30kDa以下)需要提升丙烯酰胺凝胶的浓度以提高分离分辨率。但当凝胶浓度提高后，在抗体孵育过程中，抗体由于分子量较大(一般在150-1000kDa)，在凝胶基质内具有较大的水凝胶位阻效应，一定程度上限制了一抗的识别和二抗的信号放大。因此对于小分子蛋白质的检测，基于抗体探针的单细胞免疫印迹技术的检测结果灵敏度受限。

而小分子蛋白质以被验证在人体病理过程中起着非常重要的作用。这就对实现小分子量、低丰度蛋白质的检测探针提出了新的要求。因此，采用适于高浓度凝胶的小体积的检测探针，使小分子量蛋白质分离分辨率高对单细胞免疫印迹技术的生物学应用具有十分重要的现实意义。

Amy Herr等人报道了一种改进的基于金属抗体探针的单细胞免疫印迹技术，采用金属基团标记的一抗探针成像以替代荧光基团标记的二抗成像后，可很好地检测小分子量蛋白质。该方法未采用二抗探针成像，降低了成像探针的分子量，减少了一抗探针加二抗探针的水凝胶位阻效应，改善了抗体探针对于小分子量蛋白质的检测质量。

以上技术对于分析单细胞间小分子量蛋白表达含量的已被证明非常重要，但是均存在着缺点：

1、金属基团标记的一抗探针仍然具有较大的体积和水凝胶位阻效应；

2、金属基团标记的一抗探针成像需要IMC技术，检测流程复杂，检测速度较慢；

3、金属基团标记的一抗探针制备方法与流程复杂。

适体已被探索作为替代抗体的检测探针。近年来，在组织染色中，一些荧光适配体可用于快速检测。Gomes和Si等人报道了在组织染色中，荧光适配体可用于快速检测，并且适配体通常比其抗体对应物识别更多的细胞表位，适配体提供的更高的表位标记密度导致更好的结构识别和荧光水平的卓越性能。荧光标记适体探针的最小物理尺寸允许快速凝胶内扩散和靶蛋白孵育。因此，适配体探针有望应用于单细胞尺度的快速生物成像。此外，与抗体相比，适体具有成本相对较低、易于修饰、易于合成、免疫原性低等优点。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种采用适用于高水凝胶胶浓度的小体积探针，以应用于小分子量蛋白质的单细胞免疫印迹研究。新型单细胞免疫印迹检测探针满足以下要求：

1、特异性靶标目标蛋白质能力：检测需具有较好的结构识别能力和表位识别能力以特异性靶标目标蛋白，提高目标蛋白质的检测灵敏度。

2、体积小：小体积的检测探针有利于水凝胶体系内的扩散和靶标蛋白质的孵育。探针孵育时间更短，成像速度快，节省实验时间，降低人力时间成本。

3、价格低，易于合成，易于修饰。

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发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是，提供一种可适用于低分子量蛋白质检测的新型单细胞免疫印迹检测方法，可实现三种功能：1)用于丙烯酰胺凝胶内靶标蛋白质的检测，对蛋白质具有特异性靶标，以用于单细胞免疫印迹技术，推进单细胞蛋白质组学的生物学应用；2)以适用于凝胶孔径小的小体积探针实现小分子量蛋白质高分辨率、快速成像。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述方法使用适配体作为样品检测探针。

在本发明的较佳实施方式中，该方法包括以下步骤：

步骤1、制备单细胞免疫印迹芯片，芯片为水凝胶；

步骤2、制备RIPA-like裂解液，裂解液也是电泳缓冲液；

步骤3、将步骤2中制备的裂解液水浴加热至50-55℃；

步骤4、在单细胞免疫印迹芯片中滴加样品溶液，并静置一段时间；

步骤5、将芯片置于电泳槽内，进行蛋白质电泳；

步骤6、将电泳后的芯片进行紫外曝光；

步骤7、将曝光后的芯片置于TBST中摇洗并换液；

步骤8、将摇洗后的芯片置于适配体探针溶液中浸泡孵育一段时间，并再次用TBST摇洗并换液；

步骤9、拍摄芯片照片，记录检测情况；

步骤10、将芯片置于共聚焦显微镜下观察检测情况。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤1中水凝胶的丙烯酰胺浓度为8-14％。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤1具体包括：

使用14％丙烯酰胺，75mM Tris-HCl，0.1％SDS，0.1％TritonX-100，0.2％APS，0.2％TEMED制备水凝胶。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤2具体包括：

所述RIPA-like裂解液配方为：0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM甘氨酸，pH 8.3。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤8中适配体探针溶液的孵育时间为5-120分钟。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤8中适配体探针溶液的浓度为2-100nM。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述适配体的大小为1-15kDa。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述适配体选自DNA、RNA中的一种。

在本发明的另一较佳实施方式中，所述适配体由荧光或发光基团、金属基团、量子点基团、酶、胶体金、超顺磁性微球中的一种标记。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

1、特异性靶标目标蛋白质能力。适配体探针具有较好的结构识别能力以特异性靶标目标蛋白，可提高目标蛋白质的检测灵敏度；适配体探针具有更高的表位结合密度和更好的表位识别能力以特异性靶标目标蛋白，可提高目标蛋白质的检测灵敏度。

2、成像速度快。小体积的检测探针有利于水凝胶体系内的扩散。相较于抗体探针150-1000kDa的分子量，适配体探针分子量一般为1-15kDa，因此适配体探针在水凝胶体系中的空间位阻较小；探针孵育时间更短，成像速度快，节省实验时间，降低人力时间成本；小体积的检测探针具有更高的表位结合密度，有利于水凝胶体系内的靶标蛋白质的孵育；小体积的检测探针更易洗脱多余探针，降低检测背景荧光。

3、适配体探针易于合成，且合成价格低廉。

4、适配体探针易于修饰。

5、适配体探针免疫原性低。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明中一个较佳实施例的适配体探针结合蛋白质的原理示意图；

图2是本发明中一个较佳实施例的适配体与抗体的三维结构对比图；

图3是本发明中一个较佳实施例的适配体结合和抗体结合示意图；

图4是本发明中一个较佳实施例的基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法的原理示意图；

图5是本发明中一个较佳实施例的基于适配体和抗体的单细胞免疫印迹GFP蛋白检测的PAGE信号对比示意图；

图6是本发明中一个较佳实施例的基于适配体和抗体的单细胞免疫印迹BSA蛋白检测的PAGE信号对比示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

如图1所示，适配体是一种单链寡核苷酸链(通常是20-180个核苷酸的寡核苷酸或具有10-30个氨基酸残基的肽)，其折叠的特定三维结构赋予它们结合其靶标目标的能力。

如图3所示，适配体类似于第一抗体，连接荧光基团后，适配体可直接对靶标目标进行成像。考虑到成本，抗体一般通过第一抗体特异性靶标目标，再通过第二抗体进行成像。与抗体(分子量通常为150-1000kDa)相比，适体(分子量仅1-15kDa)具有更小的体积，并且受空间位阻的影响更小。因此适配体探针具有快速扩散、分布和检测的能力。

如图4所示，本发明中的基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法的原理和流程为：(1)水凝胶芯片准备。制备具有微孔的水凝胶单细胞免疫印迹芯片，室温下的小凝胶孔径保证了低分子量蛋白质的分离分辨率；(2)单细胞捕获：单细胞悬液经重力作用沉降入数十微米直径的单细胞捕获单元；(3)细胞原位化学裂解和凝胶电泳：预热至55℃的类RIPA裂解电泳液原位对细胞进行10秒裂解；细胞裂解后，微芯片两端被施加电场，蛋白质在电场作用下进行凝胶电泳以分离不同分子量的蛋白质；(4)蛋白质固定和免疫印迹蛋白质分析：凝胶电泳结束后，微芯片表面被激发光激发照射，使得水凝胶涂层蛋白条带中蛋白质分子与水凝胶中单体分子进行原位聚合反应；固定好的靶标蛋白质分子被适配体结合，洗脱；(5)荧光成像和数据分析：在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目靶标蛋白分子的荧光信号强度。

小体积的检测探针有利于水凝胶体系内的扩散。如图2所示，相较于抗体探针150-1000kDa的分子量，适配体探针分子量一般为1-15kDa，因此适配体探针在水凝胶体系中的空间位阻较小。探针孵育时间更短，成像速度快，节省实验时间，降低人力时间成本。

实施例1：基于适配体探针的单细胞免疫印迹技术可用于检测GFP蛋白质溶液。

1、制备水凝胶。14％丙烯酰胺，75mM Tris-HCl，0.1％SDS，0.1％TritonX-100，0.2％APS，0.2％TEMED。

2、配置RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysis buffer，也是电泳缓冲液)。0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM甘氨酸，pH 8.3。保存于4度。

3、取裂解液/电泳液水浴加热至50-55℃。提前开启紫外，使光源稳定。

4、将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200ul GFP溶液(1mg/mL)，轻摇玻片，使GFP溶液分布均匀。静置3min。

5、将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55度预热的10ml RIPA-like裂解液。

6、立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s。

7、立即终止电压，紫外曝光。曝光时间分别设置为45s。

8、曝光结束，取出胶，将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。

9、置于适配体探针溶液(20nM)中浸泡染色5min。

10、TBST摇洗30min，10min换液一次。

11、拍摄照片，记录蛋白检测情况。

12、将胶置于共聚焦显微镜下观察，得到如附图5所示。说明基于适配体探针的单细胞免疫印迹技术经较短的时间(5min)就可以对胶内蛋白质具有较强的检测。

实施例2：基于适配体探针的单细胞免疫印迹技术可用于检测单细胞蛋白质。

1、按实施例1制备复合型水凝胶。

2、配置RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysis buffer，也是电泳缓冲液)。0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM甘氨酸，pH 8.3。保存于4度。

3、取裂解液/电泳液水浴加热至50-55摄氏度。提前开启紫外，使光源稳定。

4、将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200ul BSA溶液(5.12mg/mL)，轻摇玻片，使BSA溶液分布均匀。静置3min。

5、将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55度预热的10ml RIPA-like裂解液。

6、立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s。

7、立即终止电压，紫外曝光。曝光时间分别设置为45s。

8、曝光结束，取出胶。

9、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。

10、置于适配体探针溶液(20nM)中浸泡染色5min。

11、将胶置于共聚焦显微镜下观察，得到如附图6所示。说明基于适配体探针的单细胞免疫印迹技术经较短的时间(5min)就可以对胶内蛋白质具有较强的检测。

适配体探针优选的为1-15kDa，适配体可以选自包括但不限于DNA、RNA，适配体探针可以为但不限于使用荧光或发光基团、金属基团、量子点基团、酶、胶体金、超顺磁性微球等标记。优选的水凝胶中丙烯酰胺浓度为8-14％，用于孵育的适配体探针溶液优选地为2-100nM，孵育时间优选地为5-120分钟。

本发明中的基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法可以应用于微流控蛋白免疫印迹、单细胞蛋白免疫印迹、毛细管电泳蛋白免疫印迹等检测方法中，可以用于单细胞、多细胞中的蛋白质的检测，此外，还可以用于蛋白质与DNA或RNA复合物的检测，并且可以用于一种或多种蛋白质的同时检测。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述方法使用适配体作为样品检测探针。

2.如权利要求1所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备单细胞免疫印迹芯片，芯片为水凝胶；

步骤2、制备RIPA-like裂解液，裂解液也是电泳缓冲液；

步骤3、将步骤2中制备的裂解液水浴加热至50-55℃；

步骤4、在单细胞免疫印迹芯片中滴加样品溶液，并静置一段时间；

步骤5、将芯片置于电泳槽内，进行蛋白质电泳；

步骤6、将电泳后的芯片进行紫外曝光；

步骤7、将曝光后的芯片置于TBST中摇洗并换液；

步骤8、将摇洗后的芯片置于适配体探针溶液中浸泡孵育一段时间，并再次用TBST摇洗并换液；

步骤9、拍摄芯片照片，记录检测情况；

步骤10、将芯片置于共聚焦显微镜下观察检测情况。

3.如权利要求2所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述步骤1中水凝胶的丙烯酰胺浓度为8-14％。

4.如权利要求2所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：

使用14％丙烯酰胺，75mM Tris-HCl，0.1％SDS，0.1％TritonX-100，0.2％APS，0.2％TEMED制备水凝胶。

5.如权利要求2所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：

所述RIPA-like裂解液配方为：0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM甘氨酸，pH 8.3。

6.如权利要求2所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述步骤8中适配体探针溶液的孵育时间为5-120分钟。

7.如权利要求2所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述步骤8中适配体探针溶液的浓度为2-100nM。

8.如权利要求1所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述适配体的大小为1-15kDa。

9.如权利要求1所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述适配体选自DNA、RNA中的一种。

10.如权利要求1所述的一种基于适配体探针的单细胞免疫印迹检测方法，其特征在于，所述适配体由荧光或发光基团、金属基团、量子点基团、酶、胶体金、超顺磁性微球中的一种标记。

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