JP6492100B2 - イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍を診断する為の染色体評価 - Google Patents
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関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている、２０１３年１１月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／９０４，６５９号、マシュー・ブリーン（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｂｒｅｅｎ）、代理人整理番号ＮＳ１３００５ＵＳＶの利益を主張するものである。
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている、２０１３年１１月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／９０４，６５９号、マシュー・ブリーン（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｂｒｅｅｎ）、代理人整理番号ＮＳ１３００５ＵＳＶの利益を主張するものである。
本発明は、全般的には、改良された、イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍の診断方法の発見に関する。
２．１．はじめに
移行上皮癌（ＴＣＣ）は、尿路上皮癌（ＵＣ）とも称されており、イヌにおいて最もよく見られる尿管新生物である。この形式の癌は、腎臓、輸尿管、膀胱、前立腺、及び尿道を含む１つ以上の解剖学的部位に局在される場合があり、膀胱において最も多くの症例が見られる［１］。膀胱においては、癌は、膀胱の裏地を形成する移行上皮細胞から成長し、膀胱壁及び筋肉層に侵入する。塊が大きくなるにつれ、その結果として、腎臓から膀胱への、或いは膀胱から尿道を通る尿の流れが阻害されることが多くなる。イヌのＴＣＣを病理評価すると、ほとんどが、リンパ節及び他の体内器官（肺、肝臓、その他）に広がる可能性のある高グレード腫瘍であることがわかる。
移行上皮癌（ＴＣＣ）は、尿路上皮癌（ＵＣ）とも称されており、イヌにおいて最もよく見られる尿管新生物である。この形式の癌は、腎臓、輸尿管、膀胱、前立腺、及び尿道を含む１つ以上の解剖学的部位に局在される場合があり、膀胱において最も多くの症例が見られる［１］。膀胱においては、癌は、膀胱の裏地を形成する移行上皮細胞から成長し、膀胱壁及び筋肉層に侵入する。塊が大きくなるにつれ、その結果として、腎臓から膀胱への、或いは膀胱から尿道を通る尿の流れが阻害されることが多くなる。イヌのＴＣＣを病理評価すると、ほとんどが、リンパ節及び他の体内器官（肺、肝臓、その他）に広がる可能性のある高グレード腫瘍であることがわかる。
米国獣医師会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の推定によると、米国では毎年４２０万匹のイヌが癌と診断されている。ペットのイヌの全数におけるＴＣＣの厳密な生涯リスク及び発生数は不明であるが、ＴＣＣは、診断される全ての癌の約１〜２％を占めると推定されており、これは、米国で毎年４０，０００〜８０，０００匹ものイヌがＴＣＣにかかりうることを意味している。更に、スコティッシュテリア、シェトランドシープドッグ、ウェストハイランドホワイトテリア、ワイアーフォックステリア、及びビーグルを含む幾つかの品種の純血種のイヌにおいて、膀胱のＴＣＣにかかるリスクが高まっていることが報告されている。
２．２．イヌのＴＣＣの診断上の問題
イヌのＴＣＣの診断においては、イヌの尿路上皮癌の症状が他の様々な尿管症状と共通であるという大きな問題がある。例えば、イヌにおいて、膀胱感染症、膀胱結石、膀胱内の肥厚成長、及び膀胱の炎症は全て、膀胱癌に起因する症状と同様の症状を引き起こしうる。イヌの尿に対する通常の細胞学的評価は、誤認につながる可能性がある。これは、上述の悪性でない症状が異常な外観の細胞を尿内に脱落させる可能性があり、これが悪性と間違えられる可能性がある為である。放射線写真検査や超音波検査などの撮像技術を用いると、尿管内で異常な成長の存在が見つかる可能性があるが、これらは、悪性の場合も悪性でない場合もあり、又、異常な外観の細胞を尿内に存在させる場合もある。現在では、イヌのＴＣＣの確定診断は、病理医が腫瘍の生検試料を評価した後にのみ行われてよい。尿管内で可能性の高い塊の生検試料を採取することは、手術中、膀胱鏡検査中、又は外傷性カテーテル挿入によって行われてよく、これらはそれぞれ介入レベルが下がりつつある。しかしながら、可能性の高い腫瘍の塊をかき乱す処置は、いかなるものであれ、悪性上皮細胞を局部上の別の場所に散らばらせることになり、癌を広げることになるおそれがある。この「散らばらせる」可能性は、臨床管理にとっての懸念である。従って、ＴＣＣを連想させる症状を示すイヌにおけるＴＣＣの確定診断は、自由採取尿試料の評価から行うのが望ましいであろう。
イヌのＴＣＣの診断においては、イヌの尿路上皮癌の症状が他の様々な尿管症状と共通であるという大きな問題がある。例えば、イヌにおいて、膀胱感染症、膀胱結石、膀胱内の肥厚成長、及び膀胱の炎症は全て、膀胱癌に起因する症状と同様の症状を引き起こしうる。イヌの尿に対する通常の細胞学的評価は、誤認につながる可能性がある。これは、上述の悪性でない症状が異常な外観の細胞を尿内に脱落させる可能性があり、これが悪性と間違えられる可能性がある為である。放射線写真検査や超音波検査などの撮像技術を用いると、尿管内で異常な成長の存在が見つかる可能性があるが、これらは、悪性の場合も悪性でない場合もあり、又、異常な外観の細胞を尿内に存在させる場合もある。現在では、イヌのＴＣＣの確定診断は、病理医が腫瘍の生検試料を評価した後にのみ行われてよい。尿管内で可能性の高い塊の生検試料を採取することは、手術中、膀胱鏡検査中、又は外傷性カテーテル挿入によって行われてよく、これらはそれぞれ介入レベルが下がりつつある。しかしながら、可能性の高い腫瘍の塊をかき乱す処置は、いかなるものであれ、悪性上皮細胞を局部上の別の場所に散らばらせることになり、癌を広げることになるおそれがある。この「散らばらせる」可能性は、臨床管理にとっての懸念である。従って、ＴＣＣを連想させる症状を示すイヌにおけるＴＣＣの確定診断は、自由採取尿試料の評価から行うのが望ましいであろう。
本発明は、背景技術の課題を解決するためのものである。
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、イヌからの生物試料において泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する方法を提供し、本方法は、（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を測定するステップと、（ｂ）ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６のコピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９のコピー数が正常対照に比べて減少している場合に、そのイヌの泌尿生殖器悪性腫瘍の可能性が高まっていると判定するステップと、を含む。一実施形態では、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数は測定される。
コピー数は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、又は次世代配列決定によって測定されてよい。生物試料は、尿試料、新鮮凍結試料、新鮮試料、又はホルマリンで固定されパラフィン包埋された試料であってよい。
本発明は又、泌尿生殖器悪性腫瘍の治療の対象となるイヌを選択する方法を提供し、本方法は、イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を測定するステップと、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６のコピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９のコピー数が正常対照に比べて減少している場合に、そのイヌを泌尿生殖器悪性腫瘍の治療の対象として選択するステップと、を含む。泌尿生殖器悪性腫瘍の治療は、手術、放射線療法、又は化学療法であってよい。
イヌからの試料において泌尿生殖器悪性腫瘍を診断する方法であって、（ａ）イヌからの試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６に固有の核酸を用いる核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって検出するステップと、（ｂ）検出されたレベルを、トレーニングセットからの少なくとも１つの試料と比較するステップであって、サンプルトレーニングセットが、基準試料からのレベルからのデータを含み、比較するステップが、対象からの試料において検出されたレベルと少なくとも１つのトレーニングセットから検出されたレベルとの間の相関を求めることを含む統計アルゴリズムを適用することを含む、上記比較するステップと、（ｃ）対象からの試料において検出されたレベルと、統計アルゴリズムの結果とに基づいて泌尿生殖器悪性腫瘍を診断するステップと、を含む方法。核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、ＦＩＳＨ分析であってよい。
イヌからの試料において泌尿生殖器悪性腫瘍を診断する方法であって、（ａ）イヌからの試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６に固有のプライマー／プローブを用いるデジタル液滴ＰＣＲアッセイによって検出するステップと、（ｂ）検出されたレベルを、トレーニングセットからの少なくとも１つの試料と比較するステップであって、サンプルトレーニングセットが、基準試料からのレベルからのデータを含み、比較するステップが、対象からの試料において検出されたレベルと少なくとも１つのトレーニングセットから検出されたレベルとの間の相関を求めることを含む統計アルゴリズムを適用することを含む、上記比較するステップと、（ｃ）対象からの試料において検出されたレベルと、統計アルゴリズムの結果とに基づいて泌尿生殖器悪性腫瘍を診断するステップと、を含む方法。
更に、本発明は、イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する為のキットを提供し、本キットは、（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６を特定して検出できる核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１つの試薬と、（ｂ）イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を測定し、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６のコピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９のコピー数が正常対照に比べて減少している場合に使用される指示と、を含む。
５．１．定義
「泌尿生殖器悪性腫瘍」は、膀胱の組織又は近隣組織において発生する癌である。泌尿生殖器悪性腫瘍は、本明細書では、移行上皮癌（ＴＣＣ）を含み、これは尿路上皮癌とも称される。本明細書に記載の方法及び試薬は、扁平上皮癌及び腺癌の検出にも用いられてよい。
「泌尿生殖器悪性腫瘍」は、膀胱の組織又は近隣組織において発生する癌である。泌尿生殖器悪性腫瘍は、本明細書では、移行上皮癌（ＴＣＣ）を含み、これは尿路上皮癌とも称される。本明細書に記載の方法及び試薬は、扁平上皮癌及び腺癌の検出にも用いられてよい。
「コピー数」は、単一の座であれ、１つ以上の座であれ、ゲノム全体であれ、ＤＮＡの一計量法である。「コピー数」が２であることは、イヌにおける「野生型」である（これは、性染色体を除き、２倍性の為である）。イヌにおいて（性染色体を除き）「コピー数」が２以外であることは、野生型からの逸脱である。そのような逸脱は、コピー数の獲得及び増幅、即ち増加と、コピー数の欠失、即ち減少と、更にはコピー数の欠如と、を含む。
「標識された」、「検出可能標識により標識された」、及び「検出可能に標識された」は、本明細書では、エンティティ（例えば、プローブ）が検出可能であることを示す為に、区別なく用いられる。「標識」及び「検出可能標識」は、エンティティを検出可能にする為にエンティティに付けられる部分構造（ｍｏｉｅｔｙ）を意味し、例えば、プローブを標的配列に結合する際にプローブを検出可能にする為にプローブに付けられる部分構造を意味する。部分構造自体は、検出可能でなくてよいが、更に別の部分構造と反応すると検出可能になる場合がある。「検出可能に標識された」という用語の使用は、そのように標識することを包含するものとする。
検出可能標識は、標識が信号を発生させ、その信号が測定可能であり、その強度が結合されたエンティティの量に比例するように、選択されてよい。核酸などの分子、例えば、プローブを標識及び／又は検出するシステムとして、様々なものがよく知られている。標識された核酸は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、又は他の手段によって直接又は間接的に検出可能標識を混和又は共役させることにより、調製されてよい。好適な検出可能標識として、放射性同位元素、蛍光体、発色団、化学発光剤、微小粒子、酵素、磁気粒子、高電子密度粒子、質量標識、スピン標識、ハプテン等がある。本明細書では、蛍光体及び化学発光剤が選択されている。
「核酸試料」は、プローブとのハイブリダイゼーションに適した形式の核酸を含む試料を意味する。プローブは、例えば、核、又はそのような核から分離又は精製された核酸を含む試料である。核酸試料は、ゲノムＤＮＡの全体又は一部（例えば、特定の染色体）、ｍＲＮＡの全体又は一部（例えば、特定の染色体又は遺伝子）、又は選択された配列を含んでよい。ＦＩＳＨなどのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの標的として使用するには、凝縮された染色体（例えば、間期や中期において存在するもの）が好適である。
「所定のカットオフ」及び「所与のレベル」は、一般に、アッセイ結果を所定のカットオフ／レベルと比較することによって診断／予後／治療の有効性結果を評価する為に使用されるカットオフ値を意味しており、所定のカットオフ／レベルは、既に、様々な臨床パラメータ（例えば、病気の重篤度、進行／非進行／改善等）とリンクされているか関連付けられている。
「プローブ」は、本開示の文脈においては、選択的ハイブリダイゼーションを考慮に入れるか推進する条件の下で、標的配列の少なくとも一部分と選択的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プローブは、一般に、ＤＮＡのコード鎖又はセンス（＋）鎖に対して相補的であってよく、或いは、ＤＮＡの非コード鎖又はアンチセンス（−）鎖に対して相補的（「逆相補的」と称されることもある）であってよい。プローブは、長さが著しくばらついてよい。ＰＣＲなどの幾つかの用途では、約１０から約１００ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５から約７５ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５から約５０ヌクレオチドの長さが選択されてよく、染色体プローブの場合は、約５０から約１×１０６ヌクレオチドの長さが選択されてよく、ＢＡＣプローブの場合は、約５，０００から約８００，０００ヌクレオチドの長さ、或いは、より好ましくは約１００，０００から約４００，０００ヌクレオチドの長さが選択されてよい。
本発明は、（１）染色体１３、１９、又は３６と称されるイエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌａｉｒｉｓ、ＣＦＡ）ゲノムのセグメント（以下、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６と称される）を検出するプローブとして働くことが可能な核酸の断片を包含する。イヌゲノムは、配列が決定されていて利用可能であり、例えば、ＮＣＢＩ Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓゲノムデータベース、又はＥＮＳＥＭＢＬデータベースＣａｎＦａｍ３．１（ＧＣＡ＿０００００２２８５．２）が利用可能である。又、リンドブラッドトーら（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ ｅｌ ａｌ．）、２００５年、「イエイヌのゲノム配列、比較分析、及びハプロタイプ構造（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｄｏｇ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４３８号（通巻７０６９号）、ｐ．８０３−８１９も参照されたい。
ＣＦＡ１３、１９、又は３６の変化は、当該技術分野においてよく知られている幾つかの方法によって検出可能であり、それらは、例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーション、アレイとのハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）等であり、或いは、（２）ＣＦＡ１３、１９、又は３６を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして知られている。ＰＣＲプライマーは、ＣＦＡ１３、１９、又は３６の核酸配列に加えて、他の配列、例えば、増幅された核酸の使用を促進する制限酵素劈開部位を含んでよい。ＰＣＲについては、以下の文献、即ち、サカイ等（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９号、ｐ．４８７−４９１、「ＰＣＲ技術（エルリッチ版）（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌｉｃｈ， ｅｄ．）」、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年を参照されたい。後述されるように、ＰＣＲは、異常に低レベル又は高レベルのＣＦＡ１３、１９、又は３６を検出することに役立ちうる。
ハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野においてよく知られており、サムブルック， Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）、Ｅ． Ｆ． フリッチュ（Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｔ．マニアティス（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（「分子クローニング：実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）、第９章及び第１１章、１９８９年）と、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．オースベル等編（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）、セクション２．１０及び６．３−６．４、１９９５年）とによって説明されており、これらの関連部分は参照により本明細書に組み込まれている。フィルタハイブリダイゼーションに対する適度にストリンジェントな条件には、約４２℃から約５５℃の温度の約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、及び約６０℃の０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。高度にストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション条件は上記のとおりであるが、洗浄は約６８℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行われるように規定される。ハイブリダイゼーションバッファ内及び洗浄バッファ内で、ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣＩ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）の代わりにＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５ＭのＮａＣＩ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）が使用されてよく、ハイブリダイゼーションの完了後に１５分にわたって洗浄（オプションで少なくとも２回の洗浄）が行われる。
当然のことながら、洗浄温度及び洗浄塩濃度は、所望の程度のストリンジェンシーを達成する為に必要に応じて調節されてよく、これは、当業者には知られていて後で詳述される（例えば、前掲のサムブルック等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）を参照）、ハイブリダイゼーション反応及び二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することにより行われてよい。既知の配列の核酸がハイブリダイズされた場合、ハイブリッド長は、（例えば、ＧＡＰを使用して）核酸の配列をアライメントさせ、最適配列相補性の領域を１つ以上同定することによって決定されてよい。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなければならないが、このときＴｍは下記の式によって決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合は、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数＃）である。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドの場合は、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−（６００Ｎ）である。但し、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオンの濃度である。そのようなハイブリダイズする核酸のそれぞれは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド（又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０、又は少なくとも１００）である。前掲のサンブルック等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）。
５．２．ポリヌクレオチドの増幅及び決定
多くの場合は、当該技術分野においてよく知られている幾つかの核酸増幅手順のいずれかを用いて核酸配列を増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列（鋳型）に対して相補的な配列を含む核酸コピーの化学合成又は酵素合成である。本発明の方法及びキットは、当業者には知られている核酸の増幅又は検出の方法のいずれかを用いてよく、それらは、例えば、米国特許第５，５２５，４６２号（タカラダ等（Ｔａｋａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．））、同第６，１１４，１１７号（ヘップ等（Ｈｅｐｐ ｅｔ ａｌ．））、同第６，１２７，１２０号（グラハム等（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．））、同第６，３４４，３１７号（ウルノビッツ（Ｕｒｎｏｖｉｔｚ））、同第６，４４８，００１号（オク（Ｏｋｕ））、同第６，５２８，６３２号（カタンザリティ等（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ ｅｔ ａｌ．））、及び国際公開第ＷＯ２００５／１１１２０９号（ナカジマ等（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．））に記載されており、これらは全て、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。
多くの場合は、当該技術分野においてよく知られている幾つかの核酸増幅手順のいずれかを用いて核酸配列を増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列（鋳型）に対して相補的な配列を含む核酸コピーの化学合成又は酵素合成である。本発明の方法及びキットは、当業者には知られている核酸の増幅又は検出の方法のいずれかを用いてよく、それらは、例えば、米国特許第５，５２５，４６２号（タカラダ等（Ｔａｋａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．））、同第６，１１４，１１７号（ヘップ等（Ｈｅｐｐ ｅｔ ａｌ．））、同第６，１２７，１２０号（グラハム等（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．））、同第６，３４４，３１７号（ウルノビッツ（Ｕｒｎｏｖｉｔｚ））、同第６，４４８，００１号（オク（Ｏｋｕ））、同第６，５２８，６３２号（カタンザリティ等（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ ｅｔ ａｌ．））、及び国際公開第ＷＯ２００５／１１１２０９号（ナカジマ等（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．））に記載されており、これらは全て、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。
当該技術分野において知られている、試料中のｍＲＮＡの定量化の方法として、よく用いられているのは、ノーザンブロッティング及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（パーカー・アンド・バーンズ（Ｐａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ）、メソッズ・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．）１０６号、ｐ．２４７−８３、１９９９年）、ＲＮアーゼタンパク質アッセイ（ホッド（Ｈｏｄ）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１３号、ｐ．８５２−５４、１９９２年）、ＰＣＲベースの方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（ワイズ等（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．）、ＴＩＧ ８号、ｐ．２６３−６４、１９９２年）、アレイベースの方法（スキーナ等（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７０号、ｐ． ４６７−７０， １９９５）などである。代替として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、又はＤＮＡタンパク質二本鎖などの特定の二本鎖を認識できる抗体が用いられてよい。配列決定ベースの遺伝子発現分析の代表的な方法として、遺伝子発現連鎖解析（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）、ビードベースの技術、単一分子蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）の諸研究、大量並行シグネチャ配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による遺伝子発現分析がある。ベルクレスク等（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．）、１９９５年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７０号、ｐ．４８４−４８７、ストリーフカーク等（Ｓｔｒｅｅｆｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．）、１９７６年、Ｐｒｏ Ｂｉｏｌ Ｆｌｕｉｄ Ｐｒｏｃ Ｃｏｌｌ、２４号、ｐ．８１１−８１４、ソイニ（Ｓｏｉｎｉ）、米国特許第５，０２８，５４５号、ｓｍＦＩＳＨ、リュビモワ等（Ｌｙｕｂｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．）２０１３年、ネイチャープロトコルズ（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、８巻（９号）、ｐ．１７４３−１７５８．
実施形態によっては、核酸は、当業者に知られている方法を用いたＰＣＲ増幅によって増幅される。しかしながら、当業者であれば理解されるように、増幅は任意の既知の方法で達成されてよく、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、ローリングサークル増幅、転写増幅、自律的配列複製、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などで達成されてよく、これらはそれぞれ、十分な増幅をもたらす。分枝ＤＮＡ技術が用いられてもよく、これは、特定のメチル化パターンを表す、この技術の配列の存在を定性的に示す為、或いは、試料中のこの特定のゲノム配列の量を定性的に決定する為に用いられてよい。ノルテ（Ｎｏｌｔｅ）は、臨床試料中の核酸配列の直接定量化の為の分枝ＤＮＡ信号増幅についてレビューしている（ノルテ（Ｎｏｌｔｅ）、１９９８年、アドバンス・イン・クリニカル・ケミストリ（Ａｄｖ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ）、３３号、ｐ．２０１−２３５）．
ＰＣＲ処理は、当該技術分野においてはよく知られている為、本明細書では詳述しない。ＰＣＲの方法及びプロトコルのレビューについては、例えば、イニス等編（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．）、「ＰＣＲプロトコル、方法及び応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア、１９９０年、米国特許第４，６８３，２０２号（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ））を参照されたい。これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。ＰＣＲの試薬及びプロトコルは、ロシェ・モレキュラー・システムズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のような商用ベンダからも調達可能である。ＰＣＲは、耐熱酵素を用いる自動処理として実施可能である。この処理では、反応混合物の温度は、変性領域とプライマアニール領域と伸長反応領域とが自動的に周期的に繰り返される。この目的に特化された装置が市販されている。
５．３．高スループット、単一分子配列決定、及び直接検出の技術
適切な次世代配列決定技術が広く利用可能である。例えば、４５４ライフサイエンスプラットフォーム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ）（ロシェ、ブランフォード、ＣＴ（Ｒｏｃｈｅ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ））（マルグリエス等（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．）、２００５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４３７号、ｐ．３７６−３８０）、イルミナのゲノムアナライザ、ゴールデンゲートメチル化アッセイ、又はインフィニウムメチル化アッセイ、即ち、インフィニウムヒューマンメチル化２７Ｋビードアレイ又はベラコードゴールデンゲートメチル化アレイ（ｌｌｌｕｍｉｎａ'ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， ｏｒ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ， ｉ．ｅ．， Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ２７Ｋ ＢｅａｄＡｒｒａｙ ｏｒ ＶｅｒａＣｏｄｅ ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）（イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、サンディエゴ、カリフォルニア、ビブコバ等（Ｂｉｂｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．）、２００６年、ゲノムリサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ）、１６号、ｐ．３８３−３９３、米国特許第６，３０６，５９７号及び同第７，５９８，０３５号（マセビクツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ））、同第７，２３２，６５６号（バラスブラマニアン等（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．）））、又はライゲーション、ＳＯＬｉＤシステムによるＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ， ＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国特許第６，７９７，４７０号、同第７，０８３，９１７号、同第７，１６６，４３４号、同第７，３２０，８６５号、同第７，３３２，２８５号、同第７，３６４，８５８号、及び同第７，４２９，４５３号（バラニー等（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．））、又はヘリコス純単一分子ＤＮＡ配列決定技術（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ハリス等（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）２００８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３２０号、ｐ．１０６−１０９、米国特許第７，０３７，６８７号、同第７，６４５，５９６号（ウィリアムス等（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．））、同第７，１６９，５６０号（ラピドゥス等（Ｌａｐｉｄｕｓ ｅｔ ａｌ．））、米国特許第７，７６９，４００号（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）））、パシフィックバイオサイエンスの単一分子、実時間（ＳＭＲＴ）技術、及び配列決定（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ （ＳＭＲＴ ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ソニとメラー（Ｓｏｎｉ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ）、２００７年、クリニカル・ケミストリ（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．）、５３号、ｐ．１９９６−２００１）などが利用可能であり、これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。これらのシステムは、並列方式の高次多重化において試料から分離された多数の核酸分子の配列決定を可能にする（デア（Ｄｅａｒ）２００３年、ブリーフファンクションゲノムゲノムプロテオーム（Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）１巻（４号）、ｐ．３９７−４１６、及びマコーガムとデア（ＭｃＣａｕｇｈａｎ ａｎｄ Ｄｅａｒ）、２０１０年、ジャーナルオブパソロジー（Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．）、２２０号、ｐ．２９７−３０６）。これらのプラットフォームのそれぞれは、核酸断片のクローン拡大された、又は増幅されていない単一分子の配列決定を可能にする。プラットフォームによっては、例えば、（ｉ）（循環ライゲーション及び劈開を含む）色素修飾プローブのライゲーションによる配列決定、（ｉｉ）ピロ配列決定、及び（ｉｉｉ）単一分子配列決定が含まれる。
適切な次世代配列決定技術が広く利用可能である。例えば、４５４ライフサイエンスプラットフォーム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ）（ロシェ、ブランフォード、ＣＴ（Ｒｏｃｈｅ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ））（マルグリエス等（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．）、２００５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４３７号、ｐ．３７６−３８０）、イルミナのゲノムアナライザ、ゴールデンゲートメチル化アッセイ、又はインフィニウムメチル化アッセイ、即ち、インフィニウムヒューマンメチル化２７Ｋビードアレイ又はベラコードゴールデンゲートメチル化アレイ（ｌｌｌｕｍｉｎａ'ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， ｏｒ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ， ｉ．ｅ．， Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ２７Ｋ ＢｅａｄＡｒｒａｙ ｏｒ ＶｅｒａＣｏｄｅ ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）（イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、サンディエゴ、カリフォルニア、ビブコバ等（Ｂｉｂｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．）、２００６年、ゲノムリサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ）、１６号、ｐ．３８３−３９３、米国特許第６，３０６，５９７号及び同第７，５９８，０３５号（マセビクツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ））、同第７，２３２，６５６号（バラスブラマニアン等（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．）））、又はライゲーション、ＳＯＬｉＤシステムによるＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ， ＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国特許第６，７９７，４７０号、同第７，０８３，９１７号、同第７，１６６，４３４号、同第７，３２０，８６５号、同第７，３３２，２８５号、同第７，３６４，８５８号、及び同第７，４２９，４５３号（バラニー等（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．））、又はヘリコス純単一分子ＤＮＡ配列決定技術（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ハリス等（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）２００８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３２０号、ｐ．１０６−１０９、米国特許第７，０３７，６８７号、同第７，６４５，５９６号（ウィリアムス等（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．））、同第７，１６９，５６０号（ラピドゥス等（Ｌａｐｉｄｕｓ ｅｔ ａｌ．））、米国特許第７，７６９，４００号（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）））、パシフィックバイオサイエンスの単一分子、実時間（ＳＭＲＴ）技術、及び配列決定（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ （ＳＭＲＴ ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ソニとメラー（Ｓｏｎｉ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ）、２００７年、クリニカル・ケミストリ（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．）、５３号、ｐ．１９９６−２００１）などが利用可能であり、これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。これらのシステムは、並列方式の高次多重化において試料から分離された多数の核酸分子の配列決定を可能にする（デア（Ｄｅａｒ）２００３年、ブリーフファンクションゲノムゲノムプロテオーム（Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）１巻（４号）、ｐ．３９７−４１６、及びマコーガムとデア（ＭｃＣａｕｇｈａｎ ａｎｄ Ｄｅａｒ）、２０１０年、ジャーナルオブパソロジー（Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．）、２２０号、ｐ．２９７−３０６）。これらのプラットフォームのそれぞれは、核酸断片のクローン拡大された、又は増幅されていない単一分子の配列決定を可能にする。プラットフォームによっては、例えば、（ｉ）（循環ライゲーション及び劈開を含む）色素修飾プローブのライゲーションによる配列決定、（ｉｉ）ピロ配列決定、及び（ｉｉｉ）単一分子配列決定が含まれる。
ピロ配列決定は、合成による配列決定に基づく核酸配列決定方法であり、これは、ヌクレオチドの取り込み時に解放されるピロリン酸塩の検出を必要とする。一般に、合成による配列決定は、配列が決定されようとする鎖に対して相補的なＤＮＡ鎖を、１度に１ヌクレオチドずつ合成することを含む。対象核酸は、固体支持物に固定され、配列決定プライマーによりハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸、及びルシフェリンにより培養されてよい。ヌクレオチド溶液は、順次追加及び除去される。ヌクレオチドの正しい取り込みによってピロリン酸塩が解放され、このピロリン酸塩は、ＡＴＰスルフリラーゼと相互に作用して、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰを生成し、これによってルシフェリン反応が促進され、これによって、配列決定を可能にする化学発光信号が生成される。特定の試薬をピロ配列決定及びメチル化する装置が、キアゲン・インコーポレイテッド（ヴァレンシア、カリフォルニア）から調達可能である。トストとグート（Ｔｏｓｔ ａｎｄ Ｇｕｔ）、２００７年、ネイチャープロトコルズ（Ｎａｔ． Ｐｒｏｔ．）、２号、ｐ．２２６５−２２７５も参照されたい。ピロ配列決定に基づいて当業者が使用可能なシステムの一例が、対象核酸にアダプタ核酸をライゲートし、対象核酸をビードとハイブリダイズするステップと、エマルジョン中で対象核酸中のヌクレオチド配列を増幅するステップと、ピコリットル多層井固定支持物を用いてビードをソートするステップと、ピロ配列決定方法（例えば、ナカノ等（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．）、２００３年、ジャーナルオブバイオテクノロジ（Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、１０２号、ｐ．１１７−１２４）により、増幅されたヌクレオチド配列の配列決定を行うステップと、を一般的に含む。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載の処理によって、例えば、本明細書に記載の処理で生成された第１の増幅生成物に非相同核酸をライゲートすることによって生成された増幅生成物を指数関数的に増幅することが可能である。
或る単一分子配列決定の実施形態は、合成による配列決定の原理に基づき、ヌクレオチドの取り込みの成功の結果として光子が放出されるメカニズムとして、単一対蛍光共鳴エネルギ移動（単一対ＦＲＥＴ）を用いる。放出された光子は、多くの場合、増感又は高感度冷却電荷結合素子と全内部反射顕微鏡検査（ＴＩＲＭ）とを組み合わせて使用することにより検出される。光子が放出されるのは、投入される反応溶液が、配列決定処理の結果として合成された成長する核酸鎖に取り込まれる為の正しいヌクレオチドを含む場合だけである。ＦＲＥＴベースの単一分子の配列決定又は検出においては、長距離双極子相互作用により、エネルギが２つの蛍光色素間を移動する（時にはポリメチンシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ５の間を移動する）。ドナーがその固有励起波長で励起され、励起状態エネルギがアクセプタ色素まで非放射的に移動し、次にそのアクセプタ色素が励起される。アクセプタ色素は、最終的には、光子の放射的放出により、基底状態に戻る。このエネルギ移動過程で使用される２つの色素は、単一対ＦＲＥＴの「単一対」を表す。Ｃｙ３は、ドナー蛍光体として使用されることが多く、第１の標識ヌクレオチドとして取り込まれることが多い。Ｃｙ５は、アクセプタ蛍光体として使用されることが多く、第１のＣｙ３標識ヌクレオチドが取り込まれた後に、連続するヌクレオチド添加の為のヌクレオチド標識として使用される。一般に、蛍光体同士が互いに対して１０ナノメートル以内にあれば、エネルギ移動が成功する。ベイリー等（Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）が最近、蛍光共鳴エネルギ移動（ＭＳ−ｑＦＲＥＴ）により量子ドットを用いてメチル化状態を検出する高感度（１５ｐｇメチル化ＤＮＡ）方法を報告した（ベイリー等（Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）、２００９年、ゲノムリサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．）１９巻（８号）、ｐ．１４５５−１４６１。これは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている）。
単一分子配列決定に基づいて使用可能なシステムの一例が、大まかには、プライマーを対象核酸とハイブリダイズして複合体を生成することと、その複合体を固相に関連付けることと、蛍光性分子がタグ付けされたヌクレオチドによってプライマーを繰り返し拡張することと、繰り返し毎に蛍光共鳴エネルギ移動信号の画像をキャプチャすることと、を含む（例えば、ブラスラフスキ等（Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、１００巻（７号）、ｐ．３９６０−３９６４ （２００３年）、米国特許第７，２９７，５１８号（クエイク等（Ｑｕａｋｅ ｅｔ ａｌ．））。これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている）。そのようなシステムを用いて、本明細書に記載の処理によって生成された増幅生成物を直接配列決定することが行われてよい。実施形態によっては、解放された線形増幅生成物が、例えば、固体支持物、ビード、又はガラススライド上に存在する、固定された捕捉配列に対して相補的な配列を含むプライマーとハイブリダイズされてよい。プライマーと解放された線形増幅生成物の複合体を、固定された捕捉配列とハイブリダイズすることにより、解放された線形増幅生成物は、単一対ＦＲＥＴベースの、合成による配列決定の為に、固体支持物に固定される。プライマーは蛍光性であることが多い為、固定された核酸を有する、スライドの表面の初期基準画像を生成することが可能である。初期基準画像は、真のヌクレオチド取り込みが行われている場所を特定することに有用である。「プライマーのみ」の基準画像において最初に識別されていない、アレイ領域中で検出された蛍光信号は、非固有蛍光であるとして棄却される。プライマーと解放された線形増幅生成物との複合体が固定された後、結合された核酸が並列に配列決定されることが多く、これは、ａ）１つの蛍光標識ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ拡張を行うステップと、ｂ）適切な顕微鏡検査（例えば、ＴＩＲＭ）により蛍光を検出するステップと、ｃ）蛍光ヌクレオチドを除去するステップと、ｄ）別の蛍光標識ヌクレオチドについてステップａ）に戻るステップと、を繰り返すことによって行われる。
この技術は、デジタルＰＣＲにより実施されてよい。デジタルＰＣＲは、カリニナ（Ｋａｌｉｎｉｎａ）とその同僚等によって開発され（カリニナ等（Ｋａｌｉｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２５号、ｐ．１９９９−２００４） 、ヴォーゲルステインとキンツラー（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ）によって更に開発された（１９９９年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）、９６号、ｐ．９２３６−９２４１）。デジタルＰＣＲの応用については、カンター等（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．）（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０２３０９１Ａ２号（カンター等（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．））、及び同第ＷＯ２００７／０９２４７３ Ａ２号（クエイク等（Ｑｕａｋｅ ｅｔ ａｌ．）））によって記載されており、これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。デジタルＰＣＲは、単一分子レベルでの核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ）増幅を利用し、低コピー数核酸を定量化する、高感度な方法を提供する。フリューダイム・コーポレーション（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標） Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）のデジタルＰＣＲ、及びレインダンス テクノロジーズ（Ｒａｉｎｄａｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、いずれも核酸のデジタル分析のシステムを提供する。カーリン−ニューマン Ｇ等（Ｋａｒｌｉｎ−Ｎｅｕｍａｎｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．）（２０１２年）、「バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のＱＸ１００／２００（登録商標） Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（登録商標） ＰＣＲシステムを使用してコピー数の変化をプロービングする（Ｐｒｏｂｉｎｇ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｒａｄ'ｓ ＱＸ１００／２００（登録商標） Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（登録商標） ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）」、バイオ・ラッド広報（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、６２７７号、ディドロ等（Ｄｉｄｅｒｏｔ ｅｔ ａｌ．）、クリニカル・ケミストリ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０１３年２月、ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２０１２．１９３４０９を参照されたい。
実施形態によっては、ヌクレオチド配列決定は、固相単一ヌクレオチド配列決定の方法及び処理によって行われてよい。固相単一ヌクレオチド配列決定方法は、試料核酸の単一分子が固体支持物の単一分子とハイブリダイズする条件下で、試料核酸と固体支持物とを接触させることを含む。そのような条件は、固体支持物の分子と試料核酸の単一分子とを「マイクロリアクタ」の形で提供することを含んでよい。そのような条件は又、試料核酸分子が固体支持物上の固相核酸とハイブリダイズすることが可能な混合物を提供することを含んでよい。本明細書に記載の実施形態において有用な単一ヌクレオチド配列決定方法については、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０９１９３４号（カンター（Ｃａｎｔｏｒ））に記載されている。
実施形態によっては、ナノポア配列決定検出方法が、（ａ）配列決定用核酸（「塩基核酸」、例えば、連鎖プローブ分子）を、配列固有デテクタが塩基核酸のほぼ相補的な副配列と特異的にハイブリダイズする条件下で配列固有デテクタと接触させることと、（ｂ）デテクタからの信号を検出することと、（ｃ）検出された信号に従って塩基核酸の配列を決定することと、を含む。実施形態によっては、塩基核酸がポアを通過する際にデテクタがナノポア構造と干渉すると、塩基核酸とハイブリダイズされたデテクタが塩基核酸から解離され（例えば、順次解離され）、塩基配列から解離されたデテクタが検出される。
デテクタは又、塩基核酸とハイブリダイズしない、ヌクレオチドの１つ以上の領域を含んでもよい。実施形態によっては、デテクタは分子ビーコンである。デテクタは、本明細書に記載のものの中から独立に選択された１つ以上の検出可能標識を含むことが多い。各検出可能標識は、各標識から生成される信号を検出できる任意の都合のよい（例えば、磁気的、電気的、化学的、光学的、その他の）検出処理によって検出されてよい。例えば、ＣＤカメラを使用して、デテクタと連鎖する１つ以上の区別可能な量子ドットからの信号を検出してよい。
ＲＮＡ−ｓｅｑ、即ち全トランスクリプトームショットガン配列決定を用いて転写の発現レベル又はカウント数を測定することに、次世代配列決定手法が適用されてよい。例えば、モータザヴィ等（Ｍｏｒｔａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．）、２００８年、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ Ｍｅｔｈ）、５巻（７号）、ｐ．６２１−６２７、又はワング等（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、２００９年、ネイチャー・レビューズ・ジェネティックス（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ）、１０巻（１号）、ｐ．５７−６３を参照されたい。
本発明における核酸は、当該技術分野において知られている方法を用いてカウントされてよい。一実施形態では、ナノストリング（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）のｎ Ｃｏｕｎｔｅｒシステムが使用されてよい。ガイス等（Ｇｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．）、２００８年、ネイチャー・バイオテクノロジ（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２６巻（３号）、ｐ．３１７−３２５、米国特許第７，４７３，７６７号（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ））。代替として、フリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）のダイナミックアレイシステム（Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ）が使用されてよい。ビルネ等（Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．）、２００９年、プロスワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）、４号、ｅ７１１８、ヘルツァー等（Ｈｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００９年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎ Ｒｅｓ）、６９号、ｐ．７８６０−７８６６。レビューに関しては、チャオ等（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．）、２０１１年、サイエンス・チャイナ・ケミストリ（Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍ）、 ５４巻（８号）、ｐ．１１８５−１２０１、並びにオズソラークとミロス（Ｏｚｓｏｌａｋ ａｎｄ Ｍｉｌｏｓ）、２０１１年、ネイチャー・レビューズ・ジェネティックス（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ）、１２号、ｐ．８７−９８も参照されたい。
本発明は、そのようなアッセイにおける検出可能信号の感度を上げる為の、当該技術分野において知られている任意の方法を包含しており、それらは、巡回プローブ技術の使用（バッカオウイ等（Ｂａｋｋａｏｕｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）２０号、ｐ．２４０−８、これは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている）、及び分枝プローブの使用（ウルデア等（Ｕｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年、クリニカル・ケミストリ（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．）３９号、ｐ．７２５−６、これは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている）を含むが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション複合体は、当該技術分野においてよく知られている手法に従って検出される。
逆転写又は増幅された核酸が修飾核酸であってよい。修飾核酸は、ヌクレオチド類似体を含んでよく、実施形態によっては、検出可能標識及び／又は捕捉剤を含んでよい。検出可能標識の例として、蛍光体、放射性同位元素、測色剤、発光剤、化学発光剤、光散乱剤、酵素などがあり、これらに限定されない。捕捉剤の例として、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体レセプタ、抗体／タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因性要因、化学反応基／相補的化学反応基(例えば、スルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／アミン／イソトリオシアネート、アミン／スクシンイミジルエステル、及びアミン／スルホニルハライド）の対から選択される結合対からの作用物があり、これらに限定されない。捕捉剤を有する修飾核酸は、実施形態によっては、固体支持物に固定されてよい。
本明細書に記載の発明は、他の、癌の検出の為の分子技術、例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている、米国特許広報第２０１３／０１７１６３７号（ギアフィス等（Ｇｉａｆｉｓ ｅｔ ａｌ．））などの技術との組み合わせで使用されてよい。
５．４．統計的方法
データは、１対全（即ち、病気対健康）の場合、及び全ペアワイズ（即ち、健康対個々の病気）の場合の両方において、そのバイオマーカ識別能力に関してランク付けされてよい。ランク付けに使用される統計量の１つが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（感度対（１−特異性）のプロット）の下の面積である。複数のデータセットにまたがる信頼性に関してはバイオマーカが評価されるが、独立した試料セット同士は、ＲＯＣランク付けの為には結合されない。結果として、各バイオマーカの、関心対象の群を識別する能力に関して、複数の独立した分析が行われ、複数の独立したランク付けが得られる。
データは、１対全（即ち、病気対健康）の場合、及び全ペアワイズ（即ち、健康対個々の病気）の場合の両方において、そのバイオマーカ識別能力に関してランク付けされてよい。ランク付けに使用される統計量の１つが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（感度対（１−特異性）のプロット）の下の面積である。複数のデータセットにまたがる信頼性に関してはバイオマーカが評価されるが、独立した試料セット同士は、ＲＯＣランク付けの為には結合されない。結果として、各バイオマーカの、関心対象の群を識別する能力に関して、複数の独立した分析が行われ、複数の独立したランク付けが得られる。
当然のことながら、本発明では、他の遺伝子及び／又は診断基準が使用されてよい。例えば、動物の諸特性、標準的な血液ワークアップ、画像検査の結果、及び／又は組織学的評価が、任意選択で、本明細書に開示のバイオマーカと組み合わされてよい。
そのような分析方法を用いて、予測モデルを形成し、その後、そのモデルを使用して検査データを分類してよい。例えば、便利で特に効果的な分類方法の１つでは、多変量統計解析モデリングが用いられ、これは、まず、既知のクラスの試料からの（例えば、肺癌の特定のクラス、サブクラス、又はグレードを有しているかいないかがわかっている患者からの）データ（「モデリングデータ」）を使用してモデル（「予測数学モデル」）を形成し、次に、未知の試料（例えば、「検査データ」）を、肺癌の状態に応じて分類する。
例えば、言語学、フィンガープリント法、化学、及び心理学にわたる多種多様な問題を特徴づける為に、パターン認識（ＰＲ）法が広く用いられてきた。本明細書に記載の方法の文脈では、パターン認識は、パラメトリック及びノンパラメトリックの両方の多変量統計を使用して、分光データを分析し、従って、試料を分類し、幾つかの従属変数の値を、観測された測定値の範囲に基づいて予測することである。アプローチは主に２つある。一方の方法群は、「非監視下（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）」と呼ばれ、これらは、単に、データの複雑さを合理的に減じるものであり、且つ、人間が目で見て解釈できる表示プロットを生成するものである。他方のアプローチは「監視下（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）」と呼ばれ、既知のクラス又は結果を有する試料のトレーニングセットが、数学モデルを生成する為に使用され、次に、独立バリデーションデータセットにより評価される。
非監視下のＰＲ方法は、他の独立情報を全く参照せずにデータを分析することに用いられる。非監視下のパターン認識方法の例として、主成分分析（ＰＣＡ）、階層的クラスタ分析（ＨＣＡ）、非線形マッピング（ＮＬＭ）などがある。
代替として、且つ、自動分類方法を開発する為に、「監視下」アプローチをデータ分析に用いるのが効率的であることがわかった。ここで、各試料の「クラス」を正しく予測する統計モデルを構築する為に、バイオマーカ発現データの「トレーニングセット」が使用される。その後、このトレーニングセットを、（検定セット又はバリデーションセットと称される）独立データで検定することにより、コンピュータベースのモデルのロバストネスが判定される。これらのモデルは、「エキスパートシステム」と称されることがあるが、或る範囲の様々な数学的手続きに基づいてよい。監視下の方法では、次元を減らしたデータセット（例えば、先頭の数個の主成分）を使用してよいが、典型的には、全次元を有する減らされていないデータを使用する。これらの方法は、あらゆるケースにおいて、各クラスを（例えば、肺癌の各クラスをそのバイオマーカ発現プロファイルに関して）特徴づけて区別する多変量境界の定量的な記述を可能にする。又、任意の予測に対して信頼限界を取得することも可能であり、例えば、適合度に対して配置される確率レベルに対して信頼限界を取得することも可能である（例えば、シャラフ（Ｓｈａｒａｆ）、イルマン（Ｉｌｌｍａｎ）、コワルスキ（Ｋｏｗａｌｓｋｉ）編、（１９８６年）、ケモメトリックス（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ）、ニューヨーク、ウィリーを参照）。予測モデルのロバストネスが、クロスバリデーションによりチェックされてもよく、これは、選択された試料を分析から除外することにより、行われてよい。
監視下のパターン認識方法として、例えば、以下のものがある。最短重心法（ダブニー（Ｄａｂｎｅｙ）、２００５年、バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、２１巻（２２号）、ｐ．４１４８−４１５４、及びチブシラニ等（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｌ ａｌ．）、２００２年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）、米国、９９巻（１０号）、ｐ．６５７６−６５７２）。クラス分析のソフト独立モデリング（ＳＩＭＣＡ）（例えば、ウォルド（Ｗｏｌｄ）、（１９７７年）、ケモメトリックス：理論と応用（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ： ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、５２号、ｐ．２４３−２８２を参照）。部分最小二乗分析（ＰＬＳ）（例えば、ウォルド（Ｗｏｌｄ）、（１９６６年）、多変量分析（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）、１号、ｐ．３９１−４２０、ジョーレスコーグ（Ｊｏｒｅｓｋｏｇ）、（１９８２年）、因果性、構造、予測（Ｃａｕｓａｌｉｔｙ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）、１号、ｐ．２６３−２７０を参照）。線形判別分析（ＬＤＡ）（例えば、ニルソン（Ｎｉｌｌｓｏｎ）、（１９６５年）、学習機械（Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ニューヨークを参照）。ｋ近傍分析（ＫＮＮ）（例えば、ブラウンとマーチン（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ）、１９９６年、ジャーナル・オブ・ケミカル・インフォメーション・アンド・コンピュータ・サイエンス（Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆｏ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉ）、３６巻（３号）、ｐ．５７２−５８４を参照）。人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）（例えば、ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）、（１９９３年）、ニューラルコンピューティングの高度な方法（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）、オハレとジェニングス（Ｏ'Ｈａｒｅ ＆ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）（編）、（１９９６年）、分散型人工インテリジェンスの基礎（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）（９巻）、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）を参照）。確率的ニューラルネットワーク（ＰＮＮ）（例えば、ビショップとナスラバディ（Ｂｉｓｈｏｐ ＆ Ｎａｓｒａｂａｄｉ）、（２００６年）、パターン認識と機械学習（Ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ）（１巻、ｐ．７４０）、ニューヨーク、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、シュペヒト（Ｓｐｅｃｈｔ）、（１９９０年）、確率的ニューラルネットワーク（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、３巻（１号）、ｐ．１０９−１１８を参照）。ルール抽出（ＲＩ）（例えば、クインラン（Ｑｕｉｎｌａｎ）（１９８６年）、機械学習（Ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ）、１巻（１号）、ｐ．８１−１０６を参照）。ベイズ法（例えば、ブレットホースト（Ｂｒｅｔｔｈｏｒｓｔ）、（１９９０年）、ベイズ確率理論によるパラメータ推定の手引（Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｅｏｒｙ）、最大エントロピーとベイズ法（Ｉｎ Ｍａｘｉｍｕｍ ｅｎｔｒｏｐｙ ａｎｄ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）（ｐ．５３−７９）、シュプリンガー・オランダ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ブレットホースト、Ｇ． Ｌ．（Ｂｒｅｔｔｈｏｒｓｔ， Ｇ． Ｌ．）（１９８８年）、ベイズスペクトル分析及びパラメータ推定（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）（４８巻）、ニューヨーク、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）を参照）。非監視下の階層的クラスタリング（例えば、ヘレロ（Ｈｅｒｒｅｒｏ）、２００１年、バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、１７巻（２号）、ｐ．１２６−１３６を参照）。一実施形態では、分類器は、ムリン等（Ｍｕｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）、２００７年、クリニカル・ケミストリ（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、５３巻（７号）、ｐ．１２７３−９に記載された重心ベースの方法であり、これは、その、病気の分類に関する教示について、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている。
例えば、欠落データのアドレス指定、転換、スケーリング、重み付け等により、データを前処理することがしばしば有用である。多変量予測法、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）や部分最小二乗分析（ＰＬＳ）は、いわゆるスケーリングに敏感な方法である。対象となるデータのタイプについての事前の知識及び経験を用いることにより、多変量モデリングの前のデータの質を、スケーリング及び／又は重み付けによって強化することが可能である。適切なスケーリング及び／又は重み付けにより、データ中に隠れていた重要且つ興味深い変化を明らかにすることが可能であり、それによって、その後の多変量モデリングをより効率的にすることが可能である。スケーリング及び重み付けを行うことにより、対象となるシステムの知識及び経験に基づいて、データを正しいメトリックに配置することが可能であり、それによって、データ中に既に固有に存在していたパターンを明らかにすることが可能である。
可能であれば、データの欠落、例えば、カラム値のギャップは避けられるべきである。しかしながら、必要であれば、そのような欠落データは、例えば、カラムの平均値（「平均埋め」）、ランダム値（「ランダム埋め」）、又は主成分分析に基づく値（「主成分埋め」）で置き換えられるか「埋め」られてよい。これらの様々なアプローチのそれぞれは、その後のＰＲ分析に対する作用がそれぞれ異なる。
記述子座標軸の「転換」が有用となる場合がある。そのような転換の例として、正規化及び平均センタリングがある。「正規化」は、試料間のばらつきを除去する為に用いられてよい。様々な正規化アプローチが可能であり、それらは、分析における幾つかのポイントのいずれにおいても大抵は適用可能である。「平均センタリング」は、解釈を簡略化する為に用いられてよい。通常は、各記述子から、全ての試料におけるその記述子の平均値が差し引かれる。このようにして、記述子の平均が原点と一致し、全ての記述子は、ゼロが「中心になる」。「単位分散スケーリング」では、データを同等の分散にスケーリングできる。通常、各記述子の値は１／ＳｔＤｅｖでスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、全ての試料に対するその記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、或る意味では、平均センタリングと単位分散スケーリングの中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は１／ｓｑｒｔ（ＳｔＤｅｖ）でスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、全ての試料に対するその記述子の標準偏差である。このようにして、各記述子の分散は、その初期標準偏差と数値的に同等になる。パレートスケーリングは、例えば、ローデータ、又は平均センタリングされたデータに対して行われてよい。
「対数スケーリング」は、データがポジティブスキューを有する場合、且つ／又は、データが（例えば、何桁かにわたる）広範囲に及ぶ場合に、解釈を支援する為に用いられてよい。通常は、各記述子の値が、その値の対数に置き換えられる。「等範囲スケーリング」では、各記述子は、全ての試料にわたるその記述子の範囲で割られる。このように、全ての記述子が同じ範囲、即ち、１という範囲を有する。しかしながら、この方法は、異常値ポイントの存在に敏感である。「自己スケーリング」では、各データベクトルが平均でセンタリングされ、単位分散でスケーリングされる。この手法は、各記述子がその後、同等に重み付けされ、大きな値と小さな値が同等の重みで取り扱われるので、非常に有用である。このことは、非常に低いレベルながら検出可能なレベルで存在する検体にとって重要となる可能性がある。
データをスケーリングする、監視下の方法も幾つか知られている。これらのうちの幾つかは、クラス間の区別を行う、パラメータ（例えば、記述子）の能力の尺度を提供することが可能であり、分離を広げることによって分類を改善する為に用いられてよい。例えば、「分散重み付け」では、単一パラメータ（例えば、記述子）の分散重みが、クラス内分散の合計に対するクラス間分散の比として計算される。大きな値は、この分散がクラス同士の区別を行う能力があることを意味する。例えば、これらの試料が２つのクラス（例えば、トレーニングセット）に入ることがわかっている場合は、各記述子の平均及び分散を検査することが可能である。記述子が非常に異なる平均値と小さい分散を有する場合、この記述子は、クラス同士を分離することに優れていることになる。「特徴重み付け」は、分散重み付けのより一般的な記述であり、各記述子の平均及び標準偏差が計算されるだけでなく、他のよく知られた重み付け因子（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ重み）が使用される。
本明細書に記載の方法の実施及び／又は結果の記録は、これらの方法を実施でき、且つ／又は結果を記録できる任意の装置を使用して行われてよい。使用可能な装置として、例えば、あらゆるタイプのコンピュータを含む電子計算装置が挙げられ、これに限定されない。本明細書に記載の方法がコンピュータにおいて実施及び／又は記録される場合、これらの方法の各ステップを実施するようにコンピュータを構成する為に使用可能なコンピュータプログラムは、そのコンピュータプログラムを収容できる任意のコンピュータ可読媒体に収容されてよい。使用可能なコンピュータ可読媒体として、例えば、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、並びに他のメモリ及びコンピュータ記憶装置が挙げられ、これらに限定されない。これらの方法の各ステップを実施し、且つ／又は結果を記録するようにコンピュータを構成する為に使用可能なコンピュータプログラムは、電子ネットワークを介して提供されてもよく、例えば、インターネット、イントラネット、又は他のネットワークを介して提供されてよい。
測定値と基準値を比較する処理は、問題の弁別遺伝子に関する測定値及び基準値のタイプにふさわしい任意の便利な方法で実施されてよい。「測定」は、定量的又は定性的な測定手法を用いて実施されてよく、測定値と基準値を比較するモードは、採用される測定技術に応じて異なってよい。例えば、発現レベルの測定に定性的測色アッセイが用いられる場合、レベルの比較は、着色反応生成物の強度を視覚的に比較することによって、又は、着色反応生成物の濃度測定又は分光測定のデータを比較することによって（例えば、測定装置から得られた数値データ又はグラフィカルデータ（例えば、棒グラフ）を比較することによって）行われてよい。しかしながら、本発明の方法で使用される測定値としては、定量的な値が最も一般的であると考えられる。他の例では、測定値は定性的である。定性的な測定の場合と同様に、比較は、数値データを検分することによって、又は、データの表現を検分することによって（例えば、棒グラフや折れ線グラフのようなグラフィカル表現を検分することによって）行われてよい。
比較処理は、手動（本方法の専門家による目視検分など）で行われてよく、自動で行われてもよい。例えば、アッセイ装置（例えば、化学発光信号を測定する照度計）が、回路と、回路がバイオマーカタンパク質に関する測定値と基準値の比較を行うことを可能にするソフトウェアと、を含んでよい。或いは、独立した装置（例えば、デジタルコンピュータ）が、１つ以上の測定値と１つ以上の基準値との比較に使用されてよい。自動比較装置は、測定されるバイオマーカタンパク質に対する基準値を記憶していてよく、或いは、測定値を、同時に測定された基準試料（例えば、対照者からの試料）から得られた基準値と比較してもよい。
当業者であれば明らかなように、反復測定値が取得される場合、基準値と比較される測定値は、反復測定値が考慮された値である。反復測定値は、それらの測定値の平均値又は中央値を「測定値」として使用することにより考慮されてよい。
本発明は又、特定の処置の対象となる動物を識別する方法、又は特定の処置が望ましい動物、又は特定の処置を避けるべき動物を選択する方法を含む。
上述の方法は、参照試験所、動物病院の病理検査室、大学の獣医学研究室、獣医の診療所、又は獣医によって実施されてよい。上述の方法は更に、アルゴリズム及び／又は統計分析を含んでよい。
５．５．試料
試料は、尿試料、組織試料、血液試料、並びに血液、血漿、血清、尿からの無細胞抽出液であってよい。各例において示されている細胞遺伝学的アッセイの場合、細胞は、ＦＩＳＨプローブの為のテンプレートを提供する為に使用される。ＰＣＲアッセイの場合、腫瘍ＤＮＡは、細胞、又は無細胞血漿／血清／尿から取得されてよい。
試料は、尿試料、組織試料、血液試料、並びに血液、血漿、血清、尿からの無細胞抽出液であってよい。各例において示されている細胞遺伝学的アッセイの場合、細胞は、ＦＩＳＨプローブの為のテンプレートを提供する為に使用される。ＰＣＲアッセイの場合、腫瘍ＤＮＡは、細胞、又は無細胞血漿／血清／尿から取得されてよい。
５．６．組成物及びキット
本発明は、イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する為の組成物及びキットを提供し、これは、（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６を特定して検出できる核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１つの試薬と、（ｂ）イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を測定し、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６のコピー数が正常対照より増加しているか、ＣＦＡ１９のコピー数が正常対照より減少している場合に使用される指示と、を含む。
本発明は、イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する為の組成物及びキットを提供し、これは、（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６を特定して検出できる核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１つの試薬と、（ｂ）イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、又はＣＦＡ３６のコピー数を測定し、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６のコピー数が正常対照より増加しているか、ＣＦＡ１９のコピー数が正常対照より減少している場合に使用される指示と、を含む。
これらの指示は、イヌから取得された関連細胞の試料中に染色体異常が存在するかどうかを判定することを含む。プローブのうちの少なくとも２つが関連する染色体異常が存在すれば、患者が膀胱癌を有することになる。そのようなキットは更に、遮断薬又は他のプローブ、プローブの検出を促進する各種の標識又は標識薬剤、ハイブリダイゼーション用試薬（例えば、干渉剤）、中期スプレッドなどを含んでよく、或いは、これらによって構成されてよい。
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が帰属する技術分野における当業者が普通に理解する意味と同じ意味を有する。冠詞の「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語が１つではなく１つ以上（即ち、少なくとも１つ）あることを意味する。例えば、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は１つ以上のｅｌｅｍｅｎｔ（要素）を意味する。
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、指定された要素、整数又はステップ、或いは要素、整数、又はステップの群を包含することを意味するものであって、他の要素、整数、又はステップ、或いは要素、整数、又はステップの群を全て排除することを意味するものではないことを理解されたい。本発明は、特許請求の範囲に記載のステップ、要素、及び／又は試薬を適切に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」か、これらから「構成され（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」るか、これらから「基本的に構成され（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」てよい。
更に、特許請求の範囲は、任意選択の要素を全て排除するように立案されてよいことに注意されたい。従って、本声明は、「ただ単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ単に（ｏｎｌｙ）」などの排他的な術語を、特許請求要素の列挙との関連で使用すること、又は、「否定的な」限定を行うことに対する先行詞として働くことを目的とする。
或る範囲の値が与えられた場合、文脈上明らかに矛盾する場合を除き、その範囲の上限と下限の間にある、下限の単位の１０分の１までの各介在値も明確に開示されていることを理解されたい。指定範囲内の任意の指定値又は介在値と、その指定範囲内の他の任意の指定値又は介在値との間のより小さい各範囲も、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、それぞれ独立に、その範囲に包含されるか排除されてよく、より小さな範囲にいずれかの限界が包含されるか、どの限界も包含されないか、両方の限界が包含される各範囲も、指定範囲内の任意の明確に排除される限界に応じて、本発明に包含される。指定範囲が一方又は両方の限界を包含する場合、それらの包含される限界の一方又は両方を排除する範囲も本発明に包含される。
以下の実施例は、本発明を更に例示的に説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に、当然のことながら、本発明は、記載される特定の実施形態、従って、もちろん多様であってよい特定の実施形態には限定されない。又、当然のことながら、本明細書において使用される術語は、特定の実施形態のみを説明する為のものであり、限定を意図されたものではない。これは、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定される為である。
６．実施例
６．１．実験データ
ＴＣＣを有する未治療のイヌから原発腫瘍の生検試料（ｎ＝３１）が採取され、ホルマリンで固定されるか急速凍結されてから液体窒素中に保存された。更に、ノースカロライナ州立大学獣医学部において、臨床疾患の形跡がないイヌの死検時に非新生物性の膀胱組織が採取された。対照試料が獣医病理学者によって評価され、新生物形成の形跡がなく、病理組織学的に「正常」であることが確定された。
６．１．実験データ
ＴＣＣを有する未治療のイヌから原発腫瘍の生検試料（ｎ＝３１）が採取され、ホルマリンで固定されるか急速凍結されてから液体窒素中に保存された。更に、ノースカロライナ州立大学獣医学部において、臨床疾患の形跡がないイヌの死検時に非新生物性の膀胱組織が採取された。対照試料が獣医病理学者によって評価され、新生物形成の形跡がなく、病理組織学的に「正常」であることが確定された。
６．２．ｏａＣＧＨ
腫瘍からＤＮＡが抽出され、アガロースゲル電気泳動法により、分子量が高いことが確認され、分光光度計の読みが２６０：２３０＞２及び２６０：２８０＞１．８であった（ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）のＮａｎｏｄｒｏｐ−１０００）。原発腫瘍の生検試料（検査試料）のそれぞれからＤＮＡが分離され、ゲノムＤＮＡ酵素標識キット（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を使用して蛍光体共役ｄＮＴＰを取り込むことにより、ＤＮＡが標識された（これについては以前に［２］に記載されている）。一方の性に特定した基準ＤＮＡ試料が雑種イヌから生成され、１０匹の健康なオスと１０匹の健康なメスからの等モル量のＤＮＡがプールされ、これらは同様に、ただし異なる蛍光体共役ｄＮＴＰで標識された。蛍光標識された検査試料及び基準試料が、オリゴヌクレオチドアレイｃＣＧＨ （ｏａＣＧＨ）アレイを特徴とするＣａｎｉｎｅ Ｇ３ Ｓｕｒｅｐｒｉｎｔ １８０，０００（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＡＭＡＤＩＤ ０２５５２２） と、６５℃、２０ｒｐｍで４０時間にわたってハイブリダイズされた（これについては以前に［３］に記載されている）。アレイは、高分解能マイクロアレイスキャナ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｇ２５０５Ｃ）を使用して３μｍでスキャンされ、特徴抽出（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ｖ１０．９）ソフトウェアを使用してデータが抽出された。スキャンデータのデータ品質の評価が、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）の特徴抽出ソフトウェア（ｖ１０．５）（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の「品質測定（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｅｔｒｉｃｓ）」レポートによって行われた。コピー数呼び出しを行う為に、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのアプローチであるFASST2セグメンテーションアルゴリズムが用いられた。ＦＡＳＳＴ２アルゴリズムは、他の一般的な、コピー数推定の為のＨＭＭ方法と異なり、各プローブにおけるコピー数状態を推定しようとするのではなく、多数の状態を用いて、モザイクイベントなどのより大きな可能性をカバーする。その後、これらの状態値を使用して、対数比閾値に基づく呼び出しが行われる。セグメンテーションの有意性閾値は５×１０上−６に設定されたが、これには又、セグメント当たり最低３個のプローブが必要であり、セグメントをブレークする前の隣接プローブ間の最大プローブ間隔を１Ｍｂにする必要があった。１つのコピーの増加、及び１つのコピーの減少の対数比閾値は、それぞれ＋０．２０１及び−０．２３４に設定された。
腫瘍からＤＮＡが抽出され、アガロースゲル電気泳動法により、分子量が高いことが確認され、分光光度計の読みが２６０：２３０＞２及び２６０：２８０＞１．８であった（ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）のＮａｎｏｄｒｏｐ−１０００）。原発腫瘍の生検試料（検査試料）のそれぞれからＤＮＡが分離され、ゲノムＤＮＡ酵素標識キット（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を使用して蛍光体共役ｄＮＴＰを取り込むことにより、ＤＮＡが標識された（これについては以前に［２］に記載されている）。一方の性に特定した基準ＤＮＡ試料が雑種イヌから生成され、１０匹の健康なオスと１０匹の健康なメスからの等モル量のＤＮＡがプールされ、これらは同様に、ただし異なる蛍光体共役ｄＮＴＰで標識された。蛍光標識された検査試料及び基準試料が、オリゴヌクレオチドアレイｃＣＧＨ （ｏａＣＧＨ）アレイを特徴とするＣａｎｉｎｅ Ｇ３ Ｓｕｒｅｐｒｉｎｔ １８０，０００（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＡＭＡＤＩＤ ０２５５２２） と、６５℃、２０ｒｐｍで４０時間にわたってハイブリダイズされた（これについては以前に［３］に記載されている）。アレイは、高分解能マイクロアレイスキャナ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｇ２５０５Ｃ）を使用して３μｍでスキャンされ、特徴抽出（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ｖ１０．９）ソフトウェアを使用してデータが抽出された。スキャンデータのデータ品質の評価が、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）の特徴抽出ソフトウェア（ｖ１０．５）（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の「品質測定（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｅｔｒｉｃｓ）」レポートによって行われた。コピー数呼び出しを行う為に、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのアプローチであるFASST2セグメンテーションアルゴリズムが用いられた。ＦＡＳＳＴ２アルゴリズムは、他の一般的な、コピー数推定の為のＨＭＭ方法と異なり、各プローブにおけるコピー数状態を推定しようとするのではなく、多数の状態を用いて、モザイクイベントなどのより大きな可能性をカバーする。その後、これらの状態値を使用して、対数比閾値に基づく呼び出しが行われる。セグメンテーションの有意性閾値は５×１０上−６に設定されたが、これには又、セグメント当たり最低３個のプローブが必要であり、セグメントをブレークする前の隣接プローブ間の最大プローブ間隔を１Ｍｂにする必要があった。１つのコピーの増加、及び１つのコピーの減少の対数比閾値は、それぞれ＋０．２０１及び−０．２３４に設定された。
ＦＡＳＳＴ２セグメンテーションアルゴリズムによって「呼び出された」ＤＮＡコピー数異常の比較が、ＴＣＣが確定されたケースのコホート（ｎ＝３１）と臨床的に健康な試料（ｎ＞１００）との間で行われた。Ｎｅｘｕｓ ＤＮＡ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ （Ｖ７）を使用して、ＣＧＨ結果が分析され、ゲノムＤＮＡが分離された細胞集団中の頻発する異常が識別された。異常は、その細胞集団中のゲノムセグメントの平均ＤＮＡコピー数の形で検出可能である。ＣＧＨによって識別された、ＴＣＣ中のＤＮＡコピー数変化が最高度に頻発する染色体に対して、その後、ＴＣＣが確定されたイヌ患者の尿試料から取得された個々の細胞、並びに、臨床的に健康であって悪性腫瘍の形跡がなかったイヌから取得された個々の細胞におけるコピー数状態の評価が行われた。
６．３．結果
３１件の原発イヌＴＣＣの各ケースから採取された生検試料から抽出されたＤＮＡのゲノム全体のｏａＣＧＨデータから、イヌゲノム全体にわたるコピー数異常が明らかになり、これらを組み合わせて使用することにより、ＴＣＣの発現と符合する異常の存在を検出する為のアッセイを開発することが可能になった（図１）。
３１件の原発イヌＴＣＣの各ケースから採取された生検試料から抽出されたＤＮＡのゲノム全体のｏａＣＧＨデータから、イヌゲノム全体にわたるコピー数異常が明らかになり、これらを組み合わせて使用することにより、ＴＣＣの発現と符合する異常の存在を検出する為のアッセイを開発することが可能になった（図１）。
図１。３１件のイヌのＴＣＣにおける有意なＤＮＡコピー数変化の頻度である。図１Ａ）ＤＮＡコピー数変化の分布及び頻度を示すゲノム全体の浸透度プロットである（２６ｋｂ分解能）。ｘ軸は、３８個の常染色体とＸ染色体とに分割された、イエイヌのゲノムを示す。ｙ軸は、３１件のうちの、使用されたｏａＣＧＨプラットフォームによって検出された、ゲノム間隔のそれぞれにおいてコピー数異常を示した比率を示す（最小間隔は約２６ｋｂ）。０％より上にある暗灰色のバーは、セグメント化された各領域における、ＤＮＡコピー数の増加を示した件数のパーセンテージを示し、０％より下にある明灰色のバーは、セグメント化された各領域における、ＤＮＡコピー数の減少を示した件数のパーセンテージを示す。多数の染色体全体及び染色体セグメントが評価済みコホートにおいて或る程度のコピー数異常を示しているのは明らかである。これらの領域のいずれかを使用して、泌尿生殖器悪性腫瘍の疑いがある患者における異常細胞の存在を検出することが可能である。異常の頻度が最も高かったもの（件数の７５％超）には、ＣＦＡ１３及び３６におけるＤＮＡコピー数の増加と、ＣＦＡ１９におけるＤＮＡコピー数の減少とが含まれる。コピー数変化が頻発する第２の層（頻度が件数の３３％超であって、太い黒の横線で表される層）は、ＣＦＡ２、５、６、１０、１２、２６、２７、２８、及びＸの領域におけるコピー数の減少、並びにＣＦＡ２、４、５、６、７、１０、１４、１７、２０、２３、２４、３０、３１、３５、３８、及びＸの領域におけるコピー数の増加として明らかである。異常が最も頻発する３つ（１３における増加、１９における減少、並びに３６における増加）については、（使用された特定のｏａＣＧＨによって検出された）約１Ｍｂの間隔を示す異常の頻度のピーク例が、ＣＦＡ１３、１９、及び３６において灰色の縦線で示されている。更に、灰色の縦線で二分されているＣＦＡ８の領域は、ＴＣＣの３１件の全てにおいて検出可能な有意のコピー数変化がなかったゲノム領域を表す。図１Ｂ）従来のイヌ核型の細胞遺伝学的表意記号で示された浸透度データであり、これは、ＤＮＡコピー数の増加（染色体の右側のヒストグラム）及び減少（各染色体の左側のヒストグラム）が起こりそうな染色体及び染色体領域の代替表現を与えるものである。図１Ｃ）ＣＦＡ８、１３、１９、及び３８の長さ方向のＤＮＡコピー数変化の頻度を示す個々の染色体の浸透度プロットである。パネルＡに示されたものと同じ灰色の縦線が、個々の染色体のそれぞれに対して維持されて、各染色体の選択された領域、即ち、ＣＦＡ１３、１９、及び３８に関して異常の頻度が最も高い領域、及びＣＦＡ８に関して３１件のいずれにおいてもコピー数変化が検出されなかった領域を表している。ＣＦＡ１３、１９、及び３６に関して示された（ｌｏｇ２比のＦＡＳＳＴ２分析によって示された）異常の頻度の１Ｍｂサイズのピーク例がｃｈｒ１３：３５〜３６Ｍｂ、ｃｈｒ１９：２５〜２６Ｍｂ、及びｃｈｒ３６：２３〜２４Ｍｂを中心としており、ｌｏｇ２比データのＦＡＳＳＴ２分析によって評価された場合にコピー数ニュートラルであったＣＦＡ８の領域が、ｃａｎｆａｍ２の位置を使用してｃｈｒ８：７〜８Ｍｂに位置していた。
イヌ染色体（ＣＦＡ）１３の増加、ＣＦＡ１９の欠失、及びＣＦＡ３６の増加によって表される、最高頻度の異数性を有する３つの染色体について、評価済み試料におけるこれらの変化の頻度を表１に示す。イヌからの１００件超の非新生物性試料の分析では、この試料セットの場合のＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のそれぞれの検出可能なコピー数変化は示されなかった。従って、これらのデータは、これら３つの染色体のうちの１つ以上の検出及び列挙に基づいて異常細胞の存在を特定する手段を与える。
表１。症状があるものと対照とにおけるイヌ染色体１３、１９、及び３１の分類別（ニュートラル、減少、又は増加）コピー数状態の頻度。これは、イヌＴＣＣが確定された３１件及び非腫瘍性セルの１００件超の生検から分離されたＤＮＡ試料の分析によって決定される。これらの染色体の３つ全ての期待されるコピー数はｎ＝２（ニュートラル）であり、これは、健康なイヌの細胞の分析によって明らかである。ＣＦＡ１３、１９、及び３６に関して検出されるコピー数変化は一方向性であり、ＣＦＡ１３及び３６は、コピー数が増えた形で存在し、ＣＦＡ１９は、コピー数が減った形で存在した。
表２は、３１件の試料に関する追加データを示す。
表２。イヌＴＣＣの３１件における３６及び１９のコピー数の増加及び１９のコピー数の減少の頻度の組み合わせ。
これらのデータは以下を示す。
ＴＣＣの１００％は、３つの異常のうちの１つ以上を有する。
ＴＣＣの９３．５５％は、３つの異常のうちの２つ以上を有する。
ＴＣＣの６７．７４％は、３つの異常を全て有する。
表２。イヌＴＣＣの３１件における３６及び１９のコピー数の増加及び１９のコピー数の減少の頻度の組み合わせ。
ＴＣＣの１００％は、３つの異常のうちの１つ以上を有する。
ＴＣＣの９３．５５％は、３つの異常のうちの２つ以上を有する。
ＴＣＣの６７．７４％は、３つの異常を全て有する。
６．４．統計分析
非新生物性であることが病理学的に確認された組織（対照）からの数百個のＤＮＡ試料を分析すると、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のいずれもコピー数異常を呈していないことが示された。そこで、少なくとも１００個の全面的に陰性である対照の存在に基づいて、３つの領域のそれぞれについて、感受性、特異性、正しく分類された比率（％）、及びＡＵＣ値（９５％の信頼区間）が計算された。
非新生物性であることが病理学的に確認された組織（対照）からの数百個のＤＮＡ試料を分析すると、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のいずれもコピー数異常を呈していないことが示された。そこで、少なくとも１００個の全面的に陰性である対照の存在に基づいて、３つの領域のそれぞれについて、感受性、特異性、正しく分類された比率（％）、及びＡＵＣ値（９５％の信頼区間）が計算された。
イヌＴＣＣにおけるイヌ染色体１３、１９、及び３６の異数性に関して表１に与えられた頻度を用いて、３つの異常のそれぞれについて、関連付け及び潜在的予測性能の程度が計算された。
幾つかの統計量が計算された。
第１に、相対リスク（ＲＲ）が計算された。計算された通り、ＣＦＡ１３の増加、及び／又はＣＦＡ３６の増加、及び／又はＣＦＡ１９の減少があるイヌが（ＴＣＣの疑いがあるケースからの膀胱腫瘍生検試料又は尿試料において）検出可能な新生物性細胞を示す全リスクを、イヌが新生物性細胞を持たない全リスクと比較したものとして解釈されてよい。相対リスク（ＲＲ）は、単純に、２つの事象の間の確率又は関係である。例えば、相対リスクが１０であることは、その試料を採取された患者が尿管新生物／ＴＣＣを有する可能性が１０倍高いことを意味する。
第２に、オッズ比（ＯＲ）が計算された。計算された通り、このオッズ比は、評価済み染色体に異数性があるイヌが悪性腫瘍／ＴＣＣを示すオッズを、評価済み染色体に異数性があるイヌが悪性腫瘍／ＴＣＣを有しないオッズと比較したものとして解釈されてよい。ＯＲでは、（ＲＲの場合のように）純パーセンテージを用いる代わりにオッズの比を用いる。ＯＲは、「オッズ」を、その口語的定義（即ち、チャンス）ではなく、その統計的定義で明確に示しており、これは、或る事象の確率を、或る事象が起こらない確率で割ったものである。
第３に、感受性及び特異性が計算されて、偽陽性及び偽陰性の可能性が判定された。感受性は、そのようであると正しく識別された実際の陽性の比率（この場合は、ＴＣＣが正しく識別されて確定されたケースのパーセンテージ）を測定する。特異性は、正しく識別された陰性の比率を測定し、この場合は、ＴＣＣを抱えていないイヌであることが正しく識別されて確定されたパーセンテージを測定する。
第４に、全体誤分類率が計算された。この測定は、このマーカによって誤分類されたイヌのパーセンテージを示す。検査全体の精度は、単純に、１−誤分類率ということになる。
更に、領域ごとのこれらの測定のそれぞれについて、９５％信頼区間が計算された。
これらの統計的発見及びその解釈を、３つの領域のそれぞれについて以下に個別に列挙した。
表３．セグメント１：染色体１３の増加
表４．セグメント２：染色体１９の減少
表５．セグメント３：染色体３６の増加
３つのケースの全てにおいて、１００超の「健康な」イヌのどれからも、染色体１３、１９、及び３６の異数性が試料中に見つからなかった為、それらの領域のそれぞれに異数性があれば、これは、生検／尿試料を採取されたイヌが新生物性細胞／ＴＣＣを示したという高レベルの特異性（現在のデータセットの９９％超）があることになる。更に、イヌの生理の観点からは、何らかの異常細胞があれば、それは膀胱管由来又は泌尿生殖器管由来である可能性が高く、従って、異常癌が泌尿生殖器由来ではない可能性は非常に小さい。提示されたデータを検討することにより、これらの異常の組み合わせが、イヌＴＣＣから抽出された細胞から予想されるものと一致することを推定することが可能である。
６．５．組み合わせ分析
（最大で３つ全ての領域を一緒に使用して、３つ全ての領域の増加情報及び減少情報が含まれた状態で）多変量モデルの潜在的予測能力を評価する為に、Ｊ４８アルゴリズムを使用して決定木モデルが構築された。クロスバリデーションの有無にかかわらず、最良の木には変数が１つだけ含まれていて、それは、ＣＦＡ１３のコピー数増加であった。これが最良のモデルであり、更なる変数を追加してもモデルは改善されず、弱体化することもなかった。
（最大で３つ全ての領域を一緒に使用して、３つ全ての領域の増加情報及び減少情報が含まれた状態で）多変量モデルの潜在的予測能力を評価する為に、Ｊ４８アルゴリズムを使用して決定木モデルが構築された。クロスバリデーションの有無にかかわらず、最良の木には変数が１つだけ含まれていて、それは、ＣＦＡ１３のコピー数増加であった。これが最良のモデルであり、更なる変数を追加してもモデルは改善されず、弱体化することもなかった。
更に、尿管からの細胞が上述の３つの異常のうちの２つ以上を示す場合、新生物の存在を示す感受性及び特異性は極端に高くなる（評価済みデータセットに基づいて９９％超）。
２つの最も高頻度な異数性、即ち、ＣＦＡ１３の増加／ＣＦＡ３６の増加が検出されると、ＯＲが４２２．２３０になり、ＲＲが３３．８１７になり誤分類が０になる。信頼区間は全て未定義である。
上述のデータは、以下の発見の為のベースを与える。
ＣＦＡ１３のコピー数増加、ＣＦＡ１９のコピー数減少、及びＣＦＡ３６のコピー数増加として定義される３つの主な異常のうちの１つ以上が検出されると、オス又はメスのイヌの泌尿生殖器管から採取された細胞試料の全体においてであれ一部においてであれ、試料が疑わしい塊の生検試料か尿かにかかわらず、これは、異常細胞の存在を示していることになり、この場合、そのような細胞は新生物として示される可能性があり、又、泌尿生殖器管の移行上皮癌から抽出された可能性があるとして示される。
ＣＦＡ１３、及び／又はＣＦＡ１９、及び／又はＣＦＡ３６のコピー数状態を、部分的であれ全体的であれ、検出及び定量化できる方法であれば、いかなる方法でも、本発明を可能にする為に用いることができる。そのようなアプローチとして以下のものがあってよく、これらに限定されない。
（１）イヌ患者試料から採取された中期標本に対する従来式の細胞遺伝学的評価。
（２）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。これにより、イヌ患者から採取された細胞が患者の塊試料又は尿試料の細胞であれば、それらの細胞に、ＣＦＡ１３、及び／又は１９、及び／又は３６の一部又は全てを表す１つ以上のプローブを接触させる。そのようなプローブは、限定ではないが、検出及び定量化される染色体の長さ方向の全体又は一部を表すものであり（例えば、全体的又は部分的染色体ペイントプローブ）、「遺伝子座特異」として分類されるプローブであり、これらは評価対象染色体の特定領域と結合するものであり、その領域の検出及び定量化に好適であると判定されたものである。１つの遺伝子座プローブは、一本鎖又は二本鎖の核酸の１つ以上の１つ以上の断片を含んでよく、これらは、バクテリオファージホストのバクテリア（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ファージ、コスミド、プラスミドなど）として伝搬されたクローン化断片の形式であったり、ゲノム配列内でレポートされる特定の配列のＰＣＲ増幅によって生成される形式であったりする。これらのケースでは、プローブは、当業者には広く知られている手続きにより、ハプテンにより標識され、好適な色原体又は蛍光体のポストハイブリダイゼーションにより検出されてよく、或いは、プローブは、それら自体がハイブリダイゼーションの前に蛍光体によって標識されてよく、これは、プローブがハイブリダイゼーションと当業者には広く知られている好適な洗浄ステージの直後のハイブリダイゼーション箇所をレポートできるようにする為である。代替形式として、プローブは、多数の一本鎖又は二本鎖の核酸配列の集合体（例えば、長さが様々であってよいオリゴヌクレオチド）を含んでよく、この場合、配列は、検出及び列挙される領域を表す利用可能な核酸配列に基づいて設計され、これらは蛍光体により標識されてよい。限定ではなく例として、そのようなプローブは、図１において、評価されたＴＣＣケースのコホートにおける異常の頻度のピークを表す灰色の縦線で規定される領域を検出するように設計されてよく、これにより、これらの厳密な場所のいずれかが、更なるケースが評価されるにつれて移動しうることが認識される。
（３）患者試料から分離されたＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。試料内の核酸から取得された相対コピー数及び絶対コピー数には増幅ベースの方法が広く用いられており、それらは、例えば、従来式ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）である。例えば、ｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲアッセイの設計の場合、評価済みＴＣＣ試料に基づく単位複製配列の絶対濃度を測定する為には、ＣＦＡ１３、１９、及び３６にある配列の増幅が必要になり、任意選択で、各異常のピークを表す領域でのそれらの増幅が必要になる。例えば、図１Ａ及び図１Ｃの灰色の縦線は、（ｌｏｇ２比のＦＡＳＳＴ２分析によって示された）ＣＦＡ１３、１９、及び３６の異常のピーク例と、ＣＦＡ８のうちの、ｌｏｇ２比データのＦＡＳＳＴ２分析によって評価されてコピー数ニュートラルであった領域と、を示す選択された約１Ｍｂの間隔を表す。上述の塩基位置のそれぞれは、コピー数事象の境界から抽出され、且つ、ｃａｎｆａｍ２（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）から抽出され、ＥＮＳＥＭＢＬＥ及びＵＳＣＳにおいて公開されている現行版のイヌゲノムアセンブリ（ＣａｎＦａｍ３）内に再配置されてよい。従って、ＣＦＡ８のこの小さな領域内の（ただし、これに限定されない）核配列を使用して、ｑＰＣＲ及びｄｄＰＣＲの使用時にＴＣＣにおいてニュートラルコピー数状態を達成することが可能であり、ここから、コピー数異常に関して評価された領域について単位複製配列の相対濃度（従って、コピー数）を推定することが可能であり、この例では、限定ではないが、ＣＦＡ１３、１９、及び３６上に記された定義済み塩基対位置について推定することが可能である。
（４）比較ゲノムハイブリダイゼーション。「検査」試料のコピー数を示すことが可能な任意のアレイフォーマットが使用されてよい。或る範囲の固体表面に固定された核酸を使用する多くの方法が、当業者には広く知られている。
（５）次世代配列決定方法は、正常であることがわかっている領域のアバンダンスに基づいて、標的領域のアバンダンスが予想より大きいか小さいかを判定することが可能である。
実施例１
上述のアプローチの１つが実際にはどのように行われうるかの例を示す為に、４色の細胞遺伝学的アッセイが開発された。これには、これらの染色体のそれぞれとハイブリダイズするように設計された、イヌのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）のクローンが使用された。イヌから採取された細胞の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によってイヌの染色体１３、１９、及び３６を検出及び定量化する手段を提供する為に、イヌＢＡＣクローン（表５）が、ＣＨＯＲＩ−８２イヌライブラリから選択された。評価済みの３１件のＴＣＣ生検試料の全てにおいてコピー数ニュートラルであることが観測されたイヌ染色体８の一領域を表す為に、第４のＦＩＳＨプローブが開発された。
表６。ＴＣＣが確定している患者試料から抽出された個別細胞の多色ＦＩＳＨ分析で用いられる、ＣＦＡ８、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数を検出及び定量化する手段を提供する為に使用された、ＣＨＯＲＩ−８２イヌＢＡＣライブラリからの４つのイヌＢＡＣクローンの識別情報。４つのＢＡＣは全て、以前にインハウスで細胞遺伝学的に検証され、レポートされたセット［４］から選択されている。
健康なイヌとＴＣＣの診断が確定しているイヌから得られた自由採取尿試料から分離された細胞に対して４色ＦＩＳＨが実施された。ＤＮＡは、４つのスペクトル的に分解可能な蛍光色素共役ｄＮＴＰの１つを取り込む為に、表６で識別されたＢＡＣクローンから調製されて標識された（これらの蛍光色素共役ｄＮＴＰはそれぞれが標準プロトコルを使用しており、これらについては本願発明者らが以前に公開している。例えば、［４、５］）。４つのプローブは混合され、健康なイヌと癌を有するイヌから採取された尿から分離された細胞とハイブリダイズされた（これに使用されたプロトコルは当該技術分野において広く使用されており、これらについては本願発明者らが以前に公開している。例えば、［４、５］）。ゲノム全体に拡散した反復成分を表す、標識されていないイヌＤＮＡが含まれており、これは、４つのＢＡＣプローブ中に反復成分があっても、それがイヌゲノム内のそれらの原発特異位置以外のゲノム箇所とハイブリダイズすることを抑制する為である。金色、赤色、緑色、及びＣｙ５（遠赤色）に見える光を表す波長に対する狭帯域通過蛍光フィルタを有する多色ＦＩＳＨワークステーション機器と冷却ＣＣＤカメラとを使用して画像が取得された。細胞核がＤＡＰＩで対比染色された。各色平面が白黒で画像化されてから、平面ごとに検出された蛍光信号が疑似着色されて、各フィルタを通過した波長に対応する色が再現された（Ｃｙ５信号は遠赤色の為、ピンクで表された）。
図２は、非新生物性細胞の染色体と接触した４つのプローブ全てのハイブリダイゼーション特性を示しており、これによれば、適用されている条件（当該技術分野における標準的な条件）の下で、４つのプローブのそれぞれが、相同染色体の適切な対の指定された物理位置に局在化された、イヌゲノムの固有且つ特異な領域の２つのコピーを検出する。
図２。イヌ染色体８、１３、１９、及び３６を検出及び定量化するように設計された蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブの多色ハイブリダイゼーション。
イヌ泌尿生殖器癌／ＴＣＣの場合、イヌ染色体（ＣＦＡ）１３及び３６は、コピー数が増加することになり（ｎ＞２）、ＣＦＡ１９は、コピー数が減少することになる（ｎ＜２）。同じ細胞において、ＣＦＡ８はコピー数が平衡する（ｎ＝２）。この例では、イヌＢＡＣクローンは、パネルＣのＭｂ位置でＣＦＡ８、１３、１９、及び３６を表すように選択された。４つのＢＡＣクローンからのＤＮＡは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析で使用されるように標識されており、この為には、別々のハイブリダイゼーション箇所として検出することを可能にする、４つのスペクトル的に分解可能な蛍光体の取り込みが、ＣＦＡ８＝金色、ＣＦＡ１３＝赤色、ＣＦＡ１９＝緑色、ＣＦＡ３６＝ピンク（グレイスケールとして表示）のように行われた。図２Ａは、健康なイヌから採取された細胞からのイヌ中期標本にハイブリダイズされた４つのＦＩＳＨプローブを示しており、ここでは、イヌ染色体は、ＤＡＰＩで対比染色された結果として青色である。図２Ｂは、パネルＡと同じ画像であるが、ＤＡＰＩバンディングをグレースケールで見せるように処理されている。図２Ａ及び図２Ｂは、各プローブがゲノムの２つの領域とのみハイブリダイズし、各箇所が染色体８、１３、１９、及び３６の同族体を表すことを示している。図２Ｃは、パネルＢの同族体の各対の一方を拡大し、且つ適切な方向に向けて示すことにより、ハイブリダイゼーション信号の染色体位置を示している。各染色体の横に示されているのは、染色体番号と、選択されたプローブが結合する、その染色体上での厳密な物理位置（単位はＭｂ）である。
イヌ泌尿生殖器癌／ＴＣＣの場合、イヌ染色体（ＣＦＡ）１３及び３６は、コピー数が増加することになり（ｎ＞２）、ＣＦＡ１９は、コピー数が減少することになる（ｎ＜２）。同じ細胞において、ＣＦＡ８はコピー数が平衡する（ｎ＝２）。この例では、イヌＢＡＣクローンは、パネルＣのＭｂ位置でＣＦＡ８、１３、１９、及び３６を表すように選択された。４つのＢＡＣクローンからのＤＮＡは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析で使用されるように標識されており、この為には、別々のハイブリダイゼーション箇所として検出することを可能にする、４つのスペクトル的に分解可能な蛍光体の取り込みが、ＣＦＡ８＝金色、ＣＦＡ１３＝赤色、ＣＦＡ１９＝緑色、ＣＦＡ３６＝ピンク（グレイスケールとして表示）のように行われた。図２Ａは、健康なイヌから採取された細胞からのイヌ中期標本にハイブリダイズされた４つのＦＩＳＨプローブを示しており、ここでは、イヌ染色体は、ＤＡＰＩで対比染色された結果として青色である。図２Ｂは、パネルＡと同じ画像であるが、ＤＡＰＩバンディングをグレースケールで見せるように処理されている。図２Ａ及び図２Ｂは、各プローブがゲノムの２つの領域とのみハイブリダイズし、各箇所が染色体８、１３、１９、及び３６の同族体を表すことを示している。図２Ｃは、パネルＢの同族体の各対の一方を拡大し、且つ適切な方向に向けて示すことにより、ハイブリダイゼーション信号の染色体位置を示している。各染色体の横に示されているのは、染色体番号と、選択されたプローブが結合する、その染色体上での厳密な物理位置（単位はＭｂ）である。
図３は、同じ４つのプローブが、健康なイヌの尿試料から抽出された非新生物性細胞にハイブリダイズされた場合と、移行上皮癌が確定したイヌから得られた自由採取尿から抽出された細胞にハイブリダイズされた場合の、典型的なハイブリダイゼーションパターンを示す。健康な細胞では、４つのプローブ全てのコピー数がｎ＝２である。ＴＣＣを有するイヌから取得された細胞の例を表す為に示された２つの細胞において、ＣＦＡ８を表すプローブのコピー数はｎ＝２であるが、ＣＦＡ１９を表すプローブのコピー数はｎ＝１であり、ＣＦＡ１３及びＣＦＡ１９を表すプローブのコピー数は両方ともｎ＞２である。
図３。多色（５平面）ＦＩＳＨ分析を用いて、Ａ）健康なイヌ、並びに、Ｂ及びＣ）膀胱の移行上皮癌の診断が確定した２匹のイヌの尿試料から抽出されたＤＡＰＩ（青の対比染色）（グレースケールで表示）細胞のＣＦＡ８（金色）、１３（赤色）、１９（緑色）及び３６（ピンク）を表すプローブを検出及び定量化する実施例。Ａｉ／Ｂｉ／Ｃｉでは５色平面画像が示されており、Ａｉｉ／Ｂｉｉ／Ｃｉｉでは、各ハイブリダイゼーション箇所が対応色の矢印で示された同じ５色平面が示されている。
パネルＡ／Ａｉでは、明らかに４つのプローブ全てが２つの別個のコピー（ｎ＝２）として存在しており、これは、「健康／コピー数平衡」状態を示している。Ｂ／Ｂｉ及びＣ／Ｃｉでは、両方の細胞が平衡コピー数のＣＦＡ８プローブ（ｎ＝２）を予想どおり有している一方、各細胞は、ＣＦＡ８（緑色）を表すプローブの１つのコピーと、ＣＦＡ１３（赤色）及びＣＦＡ３６（ピンク）を表すプローブの複数のコピーと、を有しているだけである（グレースケールで表示）。ＣＦＡ１３（赤色）及びＣＦＡ３６（ピンク）を表すプローブのハイブリダイゼーション箇所の幾つかのサイズが大きい場合、これは、そのハイブリダイゼーション箇所における縦列重複を示しており、その為、実際に目に見える数のハイブリダイゼーション箇所にわたって細胞当たりの厳密なコピー数を算定することは不可能である。従って、細胞Ｂ及びＣでは、ＣＦＡ１３を表すプローブのコピー数はそれぞれｎ＞５及びｎ＞４であり、又、細胞Ｂ及びＣでは、ＣＦＡ３６を表すプローブのコピー数はそれぞれｎ＞７及びｎ＞６であると言える。これら２つの細胞は、両方とも、３つの標的領域の全てにおいて異数性を有する。
上記で示された実施例は、イヌ細胞中の標的染色体の検出及び評価に好適な「キット」を表す為に用いられてよい。ＴＣＣと診断されたイヌの尿生殖器管から落ちた細胞中の３つの標的染色体の異数性の頻度を評価するために、本願発明者らは、１０件の尿試料のそれぞれにおいて最大３０個の細胞を評価した。１０件の試料の全てにわたる、３つの標的領域のそれぞれにおける、細胞のコピー平均数が異常である細胞の頻度と、異常の頻度の数値範囲と、を表６に示す。これらのデータは、評価された試料の中で、３つの領域のうちの少なくとも１つについて異常である細胞の最小数が２３％であったことを示している。
表７。ＴＣＣの診断が確定したイヌの尿サンプルから抽出された細胞集団においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数異常を示した細胞の比率の一覧。
更に、評価された１０件のうちの８件において、１００％の細胞が３つの標的異常のうちの１つ以上を有していて、残りの２件では、９３％と８７％の細胞がそれらの標的異常のうちの１つ以上を有していた。これらのデータは、診断ＦＩＳＨベースのアッセイを実施することにより、泌尿生殖器管から尿中に落ちた細胞の列挙に基づいて、上述の３つの染色体の検出及び定量化を実施して、ＴＣＣを高度に示唆する異常細胞の存在を確定させることが可能であることの十分な証拠を与える。
実施例２
本発明が定量的ＰＣＲアッセイの形式でどのように用いられうるかを例示する為に、本発明も、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイの形式で実施するように縮小した。ＣＦＡ１３、１９、及び３６のコピー数異常のピークは、図１において灰色の縦線で示されるように規定された。これは、ｃｈｒｌ３：３５〜３６ＭｂにおけるＣＦＡ１３、ｃｈｒｌ９：２５〜２６ＭｂにおけるＣＦＡ１９、及びｃｈｒ３６：２３〜２４ＭｂにおけるＣＦＡ３６の約１Ｍｂ領域を、ｃａｎｆａｍ２を使用して表している。更に、イヌＴＣＣ中のコピー数不変のゲノムの領域を表す為に、ｃｈｒ８：７〜８Ｍｂに位置するＣＦＡ８のコピー数ニュートラルの領域が含まれた。
ＣＦＡ１３、１９、及び３６についての範囲が確定された３つの異常領域と、ＣＦＡ８についての「ニュートラル」領域と、のそれぞれにおけるイヌゲノムのＤＮＡ配列が評価され、ＤＮＡコピー数分析での使用に好適な４つのＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭＧＢアッセイを設計する為に使用された。この４つのアッセイのそれぞれの詳細を、表８に示す。この例では、ＢｉｏＲａｄ ＱＸ１００液滴デジタルＰＣＲシステムを使用し、ＣＦＡ８に位置するコピー数ニュートラルアッセイのコピー数を基準として、（ＣＦＡ１３、１９、及び３６に位置する）３つの標的アッセイのコピー数を測定した。
表８。イヌＴＣＣの各ケースにおけるＣＦＡ１３、１９、及び３６の特定領域のコピー数を検出及び定量化する為に開発された４対アッセイで使用される各ＰＣＲプライマー及びＴａｑＭａｎプローブのＤＮＡ配列（ｃａｎｆａｍ２から）及びゲノム位置。コピー数アッセイのそれぞれについて、３つの検査アッセイのうちの１つが基準アッセイと混合され、ＰＣＲがデュプレックス反応として起こる。示されたアッセイは、使用するＰＣＲサイクル条件が同じであれば性能が同じであるように開発された。プローブ、プライマー、及び単位複製配列は、ＳＥＱ ＩＤの１番から２０番である。
各ＴａｑＭａｎアッセイは、１００〜１１０ｂｐの単位複製配列を与えるように設計され、それぞれが同じ熱サイクル条件で増幅された。実施例１として示されたＦＩＳＨ分析の為の材料を与える為に使用されたものと同じ尿試料からＤＮＡが分離されており、従って、ＦＩＳＨ及びｄｄＰＣＲによって生成されたデータは、同じケースからのものであった。「基準」アッセイ（ＣＦＡ８）はＨＥＸと標識され、３つの「検査」アッセイ（ＣＦＡ１３、１９、及び３６）は、それぞれがＦＡＭと標識された。各コピー数評価は、基準アッセイと、３つの検査アッセイのうちの１つと、を含む、１つのチューブ／ウェル内の一対のＴａｑＭａｎアッセイとして処理された。デュプレックス／ペア化反応ごとに、反応成分（即ち、試料ＤＮＡ、ＰＣＲマスターミックス、順方向プライマー及び逆方向プライマー、ＣＦＡ８の基準領域に対する、ＨＥＸと標識されたＴａｑＭａｎプローブ、及びＣＦＡ１３又は１９又は３６のいずれかの検査領域に対する、ＦＡＭと標識されたＴａｑＭａｎプローブ）が混合されて１つのチューブ／ウェルにされた。ＱＸ１００液滴生成器を使用して、各試料が最大２０，０００個の１ナノリットルサイズの液滴に分割された。当業者にはよく知られているプロトコルを用いた、各液滴内での試薬の熱サイクルの後、各試料からの液滴がＱＸ１００液滴読取器内の単一ファイルに流し込まれ、検査単位複製配列及び基準単位複製配列のそれぞれに対する正液滴及び負液滴の数が検知された。単位複製配列／ＰＣＲ正液滴及び単位複製配列／ＰＣＲ負液滴がカウントされて、デジタル形式での絶対定量化が行われた。３つの検査アッセイのそれぞれの濃度／マイクロリットルが、同じチューブ／ウェル内の基準アッセイの濃度／マイクロリットルに対して正規化されると、ＤＮＡ試料中の「検査」領域の平均コピー数が算定された。３つのペア化アッセイの全てに関するデータが図４に示されており、これによれば、ｄｄＰＣＲは、異常領域のコピー数状態を正確に検出及び定量化することが可能であり、これによって、異常ＤＮＡ試料を識別する為のＦＩＳＨベースの評価に対して代替手段が提供される。
図４。ＴＣＣを有するイヌの尿試料から抽出されたＤＮＡ試料中のイヌゲノムの異常領域の平均ＤＮＡコピー数を、ｄｄＰＣＲを用いて算定する実施例。差し込まれたＦＩＳＨ画像は、図３のパネルＢで示されたものと同じ細胞であり、ＣＦＡ８、１３、１９、及び３６の対する単一遺伝子座プローブのコピー数は、ｎ＝２、ｎ＝＞５、ｎ＝１、及びｎ＝＞７と記録された。そのＴＣＣ患者からの３０個の細胞が分析されたら、各プローブの平均コピー数は一定のままであった。３つの異常領域のｄｄＰＣＲデータが、図の本体部に示されている。各領域についてのチャートは、３つのデータ点が示されており、それらは、標的配列／単位複製配列（即ち、ＣＦＡ１３又は１９又は３６）の濃度、基準配列／単位複製配列（即ち、ＣＦＡ８）の濃度、並びに、基準配列／単位複製配列（ＣＦＡ８）の濃度に対する正規化によって得られた標的配列／単位複製配列の導出された平均コピー数（矢印）である。実施例１で報告されたＦＩＳＨアプローチを用いた３０個の個別細胞の評価による、４つの領域（ＣＦＡ８、１３、１９、及び３６）のそれぞれについての平均コピー数の一覧が表に示されている。「基準」領域（ＣＦＡ８）を基準とする、「検査」領域（ＣＦＡ１３、１９、及び３６）についての平均ＤＮＡコピー数。１６，０００個の１ｎｌの液滴ＰＣＲ反応の評価の結果も示されている。
ｄｄＰＣＲから抽出された、ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６の領域の平均コピー数は、ｎ＝６．１９、ｎ＝１．０７、及びｎ＝２７．１であった。ＣＦＡ１９の領域の平均コピー数の値（ｎ＝１．０７）は、３０個の個別細胞の分析によって得られる平均値（ｎ＝１．０２）に匹敵する。ＣＦＡ１３及びＣＦＡ３６については、ＦＩＳＨデータは、平均コピー数がそれぞれｎ＞５及びｎ＞７であったことを示しており、一方、これら２つの領域についてのｄｄＰＣＲデータは、平均コピー数ｎ＝６．１９及びｎ＝２７．１をそれぞれ示している。これらのデータは、ｄｄＰＣＲベースのアッセイを使用して、標的領域のコピー数を正確に検出及び定量化することによって、追加コピーが縦列重複されてＦＩＳＨでは分解不能になった領域の列挙に関して、ＦＩＳＨ分析に付加価値を与えることのベースをサポートする。
７．参考文献
１．ムトサエルス， Ａ．Ｊ．、Ｗ．Ｒ．ウィドマー、Ｄ．Ｗ．クナップ等（Ｍｕｔｓａｅｒｓ， Ａ．Ｊ．， Ｗ．Ｒ． Ｗｉｄｍｅｒ， ａｎｄ Ｄ．Ｗ． Ｋｎａｐｐ）、イヌの移行上皮癌（Ｃａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ジャーナル・オブ・ヴェテリナリ・インターナル・メディシン（Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ）、２００３年、１７巻（２号）、ｐ．１３６〜４４。
２．トーマス， Ｒ．等（Ｔｈｏｍａｓ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．）、１５０件のイヌ非ホジキンリンパ腫において頻発するＤＮＡコピー数異常の「ゲノム記録」による、腫瘍関連異数性の改良（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｔｈｒｏｕｇｈ 'ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｃｏｄｉｎｇ' ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ １５０ ｃａｎｉｎｅ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、白血病とリンパ腫（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＆ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、２０１１年、５２巻（７号）、ｐ．１３２１〜３５。
３．サイザー， Ｅ．Ｌ．等（Ｓｅｉｓｅｒ， Ｅ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．）、株間を読む：広く使用されている５つのイヌリンパ腫瘍細胞株の分子特性化（Ｒｅａｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｉｎｅｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｃａｎｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）、ヴェテリナリ・アンド・コンパラティブ・オンコロジ−（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２０１１年。
４．トーマス， Ｒ．等（Ｔｈｏｍａｓ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．）、ゲノムアセンブリが組み込まれたイヌ１Ｍｂ ＢＡＣマイクロアレイ：イヌ癌研究及び比較ゲノム分析の為の細胞遺伝学的リソース（Ａ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｏｇ １ Ｍｂ ＢＡＣ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ： ａ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｃａｎｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）、サイトジェネティック・ゲノム・リサーチ（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ）、２００８年、１２２巻（２号）、ｐ．１１０〜２１。
５．ブリーン， Ｍ．等（Ｂｒｅｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．）、イヌゲノムの組み込み４２４９マーカＦＩＳＨ／ＲＨマップ（Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ４２４９ ｍａｒｋｅｒ ＦＩＳＨ／ＲＨ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｇｅｎｏｍｅ）、ＢＭＣゲノミクス（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、２００４年、５巻（１号）、ｐ．６５。
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本発明は、その詳細説明との組み合わせで説明されたが、上述の説明は例示を意図しており、本発明の範囲の限定を意図するものではないことを理解されたい。本発明の他の態様、利点、及び修正は、以下に示される特許請求の範囲に包含される。本明細書で言及される全ての発行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の発行物又は特許出願のそれぞれが、参照によって組み込まれるものとして具体的且つ個別に示されているように、参照によって本明細書に組み込まれている。
Claims (12)
- イヌからの生物試料において泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する方法であって、
（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数を測定するステップと、
（ｂ）ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６の前記コピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９の前記コピー数が正常対照に比べて減少している場合に、前記イヌの前記泌尿生殖器悪性腫瘍の可能性が高まっていると判定するステップと、
を含む方法。 - 前記コピー数は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記コピー数は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記コピー数は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記コピー数は、次世代配列決定によって測定される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物試料は尿試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は新鮮凍結試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は新鮮試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、ホルマリンで固定されパラフィン包埋された試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 泌尿生殖器悪性腫瘍の治療の対象となるイヌを選択する方法であって、イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数を測定するステップと、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６の前記コピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９の前記コピー数が正常対照に比べて減少している場合に、前記イヌを泌尿生殖器悪性腫瘍の治療の対象として選択するステップと、を含む方法。
- 前記泌尿生殖器悪性腫瘍の治療は、手術、放射線療法、又は化学療法である、請求項１０に記載の方法。
- イヌの泌尿生殖器悪性腫瘍を検出する為のキットであって、
（ａ）ＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６を特定して検出できる核酸プローブと、
（ｂ）イヌからの生物試料においてＣＦＡ１３、ＣＦＡ１９、及びＣＦＡ３６のコピー数を測定し、ＣＦＡ１３又はＣＦＡ３６の前記コピー数が正常対照に比べて増加しているか、ＣＦＡ１９の前記コピー数が正常対照に比べて減少している場合に使用される指示と、
を備えるキット。
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