CN113826541A - 一种快速检测与鉴定植物根细胞结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测与鉴定植物根细胞结构的方法,包括如下步骤:1)将萌发好后种子在水培装置中培养,得到植物根系;2)采集步骤1)中的植物根系样品;3)将步骤2)中的植物根系样品进行细胞结构的观测、拍照;4)统计步骤3)中的根系样品的细胞结构形状。本发明的检测与鉴定方法中植株长势旺盛、结构完整。利用该方法培养的玉米早期苗地上部茎秆粗壮、叶色浓绿,地下部根系发达且结构完整,比土培法、雾培法和卷纸水培法更能保持根系原始样貌,便于根系表型的获取和研究。
Description
技术领域
本发明涉及植物检测领域,具体说,涉及一种快速检测与鉴定植物根细胞结构的方法。
背景技术
玉米是重要的粮食、经济、饲料兼用作物,也是现代工业和生物质能源的重要原料,同时它还是生物学基础研究的重要材料。玉米生产对保证全球粮食安全、饲料供给和能源利用具有极其重要的作用。根系形成了植物地下部分的主体,主要生理功能是固定植物、吸收土壤中的水分和溶解在水中的无机营养物,此外根还有生物合成的功能,许多氨基酸、植物碱和有机氮等有机物都在根中合成。玉米通过根系从土壤中获取氮(N)和磷(P)等营养元素。植物,比如玉米,一般有两个途径增加营养物质的获取,一是扩大根系面积使得根能与更多土壤接触、二是增加跨膜营养物质的吸收率。有研究发现根系结构与发育是氮利用效率和耐旱的主要影响因素。理解根系发育和它的分子机制对根系结构的影响,对于不同环境和土壤条件下增加产量潜能和产量稳定性是至关重要的。
20世纪90年代以来,国内外在植物根系生理生态、遗传、分子生物学、栽培、根系研究方法方面取得了丰硕成果,积累了丰富的知识,但由于根系生长环境的复杂性及根系研究方法和手段的局限性给根系研究带来了极大的不便,使得对于地下部分的研究远远落后于地上部分。自18世纪20年代Hales开展根系研究以来,根系研究方法不断发展,由最初的挖掘法发展到根箱法、容量法等,再到现在的溶液培养法、雾培法、塑料管土柱法、三维坐标容器法、同位素示踪法等,以上方法各有优缺点,如雾培法操作简单、能够观察到完整的株系,但是它的生长环境与自然环境相差较大、营养液的更换与保障需要相应的辅助设施,影响实验结果;塑料管土柱法具有取样简单、工作量小、根系完整、与大田一致的优点,但是该方法取样会对根系造成损伤,大大影响试验结果的准确性;网袋法可以直接在大田进行试验操作、所取样品具有普遍性和代表性,但是费时费力;三维坐标容器法能保持完整根系的自然状态、全方位立体的分析根系的各项指标、绘制三维图谱并能根据图谱计算根系的多项参数,但是其设备昂贵、制作复杂;同位素示踪法具有灵敏度高、样品制备简单、测定方便、可靠性高、简单易行和费用低的有点,但是该方法利用放射性粒子,所以存在污染环境的潜在危险。在根系研究方法方面,已有的研究方法还不能完全满足对根系快速、高通量的检测和测定,需要一种快速高通量、简单易行、省时省力、可靠性高、无污染且能够尽量保持根系生长原始状貌的根系研究方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,如何快速高通量、简单易行、省时省力、可靠性高、无污染且能够尽量保持根系生长原始状貌的根系检测和/或鉴定方法。
本发明提供一种检测和/或鉴定植物根系的方法,包括如下步骤:
1)将萌发的植物种子在装有营养液的水培装置中培养,得到植物根系;
2)采集步骤1)中的植物根系样品进行根系结构的观测和拍照,得到根系性状;所述步骤1)中的水培装置包括底箱和培养板,所述底箱为上端开口的容纳盆,所述培养板可拆卸的连接在容纳盆的开口处,所述培养板上设有多个用于培养植物的培养孔,所述培养孔中设有定值棉;
3)将步骤2)中的植物根系样品进行观测、拍照;
4)统计步骤3)中的根系样品的性状。
所述步骤4)在对根系样品的性状的统计的基础上,还可以根据性状的情况对其进行分类鉴定(鉴别)。
其中,所述步骤1)中的营养液为包括NH4NO3、CaCl22H2O、NaH2PO4、K2SO4、KH2PO4、MgSO47H2O、Fe-EDTA和微量元素溶液的混合溶液。
其中,营养液中各溶质的浓度分别:NH4NO34mmol/L、CaCl2.2H2O0.4mmol/L、NaH2PO40.1mmol/L、K2SO40.75mmol/L、KH2PO40.25mmol/L、MgSO4.7H2O0.6mmol/L、FeSO4·7H205.6mg/L、Na2-EDTA7.5mg/L、MnSO4.4H2O22.3mg/L、ZnSO4.7H2O 8.6mg/L、CuSO4.5H2O0.025mg/L、CoCl2.6H2O0.025mg/L、Na2MoO4.2H2O0.25mg/L、KI0.83mg/L和H3BO36.2mg/L。
其中,所述营养液每两天更换一次;每天光照时间为16小时,黑暗时间为8小时;在培养期间温度为23±2℃。生长期内采用空气泵对营养液增氧,所述增氧为所述空气泵开15min后关15min的循环,所述氧气泵规格为12W、4×4L/min、0.02Mpa的静音可调式增氧泵。
其中,所述步骤3)中植物根系样品的观测方法包括:将采集的植物根系样品进行包埋、修块、切片和镜检。
其中,所述步骤4)中得到根系性状的方法包括:
41)利用ImageJ软件对所获得的根部图片进行根系性状的获取;
42)对获取的根系性状进行分类和统计。
其中,所述,所述根系性状包括下数至少一种:根横截面积根直径、维管束面积、维管束直径、韧皮部面积、韧皮部直径和韧皮部数量、木质部面积、木质部直径和木质部数量。
上述所述的植物玉米。
本发明提供一种用于检测与鉴定植物根细胞结构的水培装置,所述水培装置包括底箱和培养板,所述底箱为上端开口的容纳盆,所述培养板可拆卸的连接在容纳盆的开口处,所述培养板上设有多个用于培养植物的培养孔,所述培养孔中设有定值棉。
其中,所述培养孔为70个,每个所述培养孔的直径为2.8cm,相邻的两个培养空之间的间距为3cm。
其中,所述培养板的尺寸为60×42×(0.8-1)cm;所述底箱的尺寸为60.5×43×15.5cm;所述底箱由不透明的材料制成。
本发明的检测鉴定方法配合本发明的水培装置具有如下优点:
1、操作简便、重复性好。应用该方法,可在不同的培养条件下进行玉米水培实验,不同实验下的水培结果表明该方法实际操作过程中简单实用且重复性强。
2、植株长势旺盛、结构完整。利用该方法培养的玉米早期苗地上部茎秆粗壮、叶色浓绿,地下部根系发达且结构完整,比土培法、雾培法和卷纸水培法更能保持根系原始样貌,便于根系表型的获取和研究。
3、快速、高通量。利用该方法可快速、高通量获取玉米根部不同组织部位的细胞结构,一次可培养280+(280+70n(n>=0))棵苗,按一次280株植株计算,按文中所提的取样部位,一次可取2520个样品,包埋按一天500个样品计算,切片按一个样品5个切片计算,一天约可切200份样品,镜检约5天,生长期20天,综上约1个月左右即可获得全部280份自交系的不同根类型不同组织部位的2,520份细胞结构表型图片,以及226,800份涵盖横截面积、直径、维管束面积、直径、韧皮部数量面积、直径和数量、木质部面积、直径和数量等根细胞结构性状数据。
附图说明
图1为水培玉米板结构示意图,其中图A为俯视图,图2为立体图,图中1表示底箱,2表示培养板,21表示培养孔,3表示定值棉。
图2为移苗并定植时的玉米苗示意图。
图3为玉米水培示意图。
图4为根组织取样部位示意图。其中,1,2,3分别为主根成熟区、伸长区和分生区;4,5,6分别为侧根成熟区、伸长区和分生区;7,8,9分别为冠根成熟区、伸长区和分生区。
图5为本发明的玉米B73根样品切片镜检图。
图6为本发明的玉米B73根系细胞结构。
图7为ImageJ获取根系表型数据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
玉米B73,由国家种质资源库获得。
实施例1以玉米B73为例进行玉米根系不同组织部位不同细胞类型表型性状
1.玉米水培营养液配置
本实施例中的溶液如无特别说明,溶剂均为蒸馏水。
玉米水培营养液由溶质和溶剂组成,溶剂为蒸馏水,溶质及其含量为:NH4NO34mmol/L、CaCl2.2H2O0.4mmol/L、NaH2PO40.1mmol/L、K2SO40.75mmol/L、KH2PO40.25mmol/L、MgSO4.7H2O0.6mmol/L、FeSO4·7H205.6mg/L、Na2-EDTA7.5mg/L、MnSO4.4H2O22.3mg/L、ZnSO4.7H2O8.6mg/L、CuSO4.5H2O0.025mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、Na2MoO4.2H2O0.25mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L。
玉米水培营养液的配方如表1-3所示。其中表1为水培营养液中溶质的配方;表1中Fe-EDTA的配方如表2所示,表1中微量元素液的配方如表3所示。首先按照1000*浓度的比例将FeSO4·7H20和Na2-EDTA分别用纯水溶解后,将Na2-EDTA溶液缓缓倒入FeSO4·7H20溶液中,最后加入10ml1N的KOH,定容至1升,得到1000*浓度的Fe-EDTA溶液;再按照表3中的1000*浓度的比例配比配制1000*浓度的微量元素液;按照表1中的配比将256g/L的NH4NO3溶液5ml、47.04g/L的CaCl2.2H2O溶液5ml、9.6g/L的NaH2PO4溶液5ml、130.5g/L的K2SO4溶液5ml、27.6g/L的KH2PO4溶液5ml、118.08g/L的MgSO47H2O溶液5ml、1000*浓度的MS微量元素液5ml和1000*浓度的Fe-EDTA溶液20ml混合后定容至4L,用NaOH调整pH至6.6-6.8,得到水培营养液。
表1.水培营养液中各溶质及其浓度及配方
表2.Fe-EDTA溶液中各溶质及其浓度及配方
表3.MS微量元素液中各溶质及其浓度及配方
编号 | 名称 | 终浓度mg/L | 1000x浓度g/L |
I | MnSO<sub>4</sub>.4H<sub>2</sub>O | 22.3 | 22.3 |
II | ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O | 8.6 | 8.6 |
III | CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>0 | 0.025 | 0.025 |
IV | CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O | 0.025 | 0.025 |
V | Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O | 0.25 | 0.25 |
VI | KI | 0.83 | 0.83 |
VII | H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 6.2 | 6.2 |
2.玉米根系的水培
1)种子萌发:挑选大小一致的B73种子80粒,10%H2O2溶液消毒45min,蒸馏水洗3次,转至滤纸上发芽至芽长2-3cm(约5天)。
2)移苗:将发芽的种子移植至水培装置中,具体为:将萌发好后种子的茎包埋在半开口的圆柱状海绵塞(定植棉)中,定植棉直径为3cm,高为3cm,使玉米中胚轴以下部分均在海绵底端外,保证根系均能浸没在水培营养液及后期生长过程中根系不进入海绵中(如图2所示),方便后续取样等操作,将带有玉米植株的海绵塞从培养板底部往上卡在小孔中,将培养板快速放置在盛有营养液的底箱上,营养液上液面没过海绵底端,保证根系能充分接触营养液。
其中,所述水培装置(结构如图1所示)包括长×宽×高为60×42×(0.8-1)cm的PVC板制成的培养板,培养板按照孔径为2.8cm,行距3cm,间距为3cm的标准打孔,每行10个培养孔,共7行;每个培养孔中放置有半开口的圆柱状海绵塞(定植棉);所述水培装置还包括用于容纳营养液的底箱,该底箱为不透明塑料容纳盆(60.5×43×15.5cm),该盆容纳体积约为28L;所述水培装置可同时生长70棵玉米苗。
3)玉米根系的培养,按照如下培养条件培养两周得到玉米根系:营养液每两天更换一次;光照时间为16h/8h昼/夜循环;在培养期间保证温度稳定在23±2℃;生长期内采用空气泵对营养液增氧,泵氧时间为每15min/15min开/关循环,氧气泵规格为12W、4×4L/min、0.02Mpa(压强)的静音可调式增氧泵。培养两周后的玉米生长情况如图3所示,得到70株玉米苗。
4)样品采集和固定:将步骤3中的玉米苗的根系按照不同的部位取样,取样部位分别为主根分生区、伸长区和成熟区;侧根分生区、伸长区和成熟区;冠状根分生区、伸长区和成熟区,具体取样部位见图4,图4中1表示主根成熟区、2表示主根伸长区、3表示主根分生区、4表示侧根成熟区、5表示侧根伸长区、6表示侧根分生区、7表示冠根成熟区、8表示冠根伸长区、9表示冠根分生区。取样长度约为1cm,取样后将样品放入FAA固定液(每100ml所述FAA固定液又福尔马林(38%甲醛)5ml:冰醋酸5ml和70%酒精90ml组成),固定后进行包埋切片,或者样品在固定液中可放4℃保存2年左右。
3、玉米根系细胞的检测鉴定与性状统计
将步骤2中采集的不同部位的根系样品分别进行检测,具体包括如下步骤:
1)包埋:将新鲜根样品包埋在普通琼脂糖中。将3%的琼脂糖高温溶解后放在室温待温度降至40-50℃时,将其倒入包埋盒或者小圆形塑料皿中,快速将样品固定在琼脂糖中,保证样品处于正中央且平行于包埋盒下底面,便于修块。若样品较多,可将琼脂糖进行保温,再进行后续处理。
2)修块:待琼脂糖冷却凝固后,对样品进行修块,使得样品待切割面与修块上平面平行,将包埋块修成梯形便于固定在样品台上。
3)切片:切片使用仪器为LeicaVT100S半自动震动切片机或其他同类型切片机;取出样品台擦干,将修好的样品块快速粘(可以使用切片机官方胶水或502强力胶进行黏贴)在样品台中央,充分干燥胶水后复位样品台,并调整好样品方向进行切片,得到不同位置的样品切片。
4)切片镜检:分别将不同位置的样品切片转移至载玻片上,同时加一滴水在切片上,并盖上盖玻片,在显微镜下镜检拍照,可见清晰细胞结构如图5所示。
5)数据获取:利用ImageJ软件对所获得的根部图片进行数据获取。打开ImageJ软件,点击File-Open,打开图片,选择直线工具,点击右下角图像标尺起点和终点,选择Analyze-SetScale,填写Knowndistance为0.01cm及Unitoflength为cm,如果所有图片都为这一标尺则选择Global选项,用直线工具测量直径、选择曲线工具测量面积,操作示例见图7。按照上述方法可以获取上述9种不同的根系样品的根横截面积、直径;维管束面积、直径;韧皮部数量面积、直径和数量;木质部面积、直径和数量,共计90组根细胞结构性状数据。
6)数据统计和分析:将步骤2中获取的90组根细胞结构性状数据进行数据统计和分析即可以快速的得到玉米根系的全部细胞结构性状数据。
本发明的检测与鉴定方法操作简便、重复性好。应用该方法,可在不同的培养条件下进行玉米水培实验,不同实验下的水培结果表明该方法实际操作过程中简单实用且重复性强。
本发明的检测与鉴定方法中植株长势旺盛、结构完整。利用该方法培养的玉米早期苗地上部茎秆粗壮、叶色浓绿,地下部根系发达且结构完整,比土培法、雾培法和卷纸水培法更能保持根系原始样貌,便于根系表型的获取和研究。
本发明的检测与鉴定方法检快速、高通量。利用该方法可快速、高通量获取玉米根部不同组织部位的细胞结构,一次可培养280+(280+70n(n>=0))棵苗,按一次280株植株计算,按文中所提的取样部位,一次可取2520个样品,包埋按一天500个样品计算,切片按一个样品5个切片计算,一天约可切200份样品,镜检约5天,生长期20天,综上约1个月左右即可获得全部280份自交系的不同根类型不同组织部位的2,520份细胞结构表型图片,以及226,800份涵盖横截面积、直径、维管束面积、直径、韧皮部数量面积、直径和数量、木质部面积、直径和数量等根细胞结构性状数据。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种检测和/或鉴定植物根系的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将萌发的植物种子在装有营养液的水培装置中培养,得到植物根系;
2)采集步骤1)中的植物根系样品,进行根系结构的观测和拍照,得到根系性状;所述步骤1)中的水培装置包括底箱和培养板,所述底箱为上端开口的容纳盆,所述培养板可拆卸的连接在容纳盆的开口处,所述培养板上设有多个用于培养植物的培养孔,所述培养孔中设有定值棉;
3)将步骤2)中的植物根系样品进行观测、拍照;
4)统计步骤3)中的根系样品的性状。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中的营养液为包括NH4NO3、CaCl2-2H2O、NaH2PO4、K2SO4、KH2PO4、MgSO4-7H2O、Fe-EDTA和微量元素溶液的混合溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中的培养条件为:所述营养液每两天更换一次;每天光照时间为16小时,黑暗时间为8小时;在培养期间温度为23±2℃。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于,所述步骤3)中植物根系样品的观测方法包括:将采集的植物根系样品进行包埋、修块、切片和镜检。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于,所述得到根系性状的方法包括:
41)利用ImageJ软件对所获得的根部图片进行根系性状的数据获取;
42)对获取的数据进行分类和统计。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述根系性状的数据包括下数至少一种:根横截面积根直径、维管束面积、维管束直径、韧皮部面积、韧皮部直径和韧皮部数量、木质部面积、木质部直径和木质部数量。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于,所述植物为玉米。
8.一种用于检测与鉴定植物根细胞结构的水培装置,其特征在于,所述水培装置包括底箱和培养板,所述底箱为上端开口的容纳盆,所述培养板可拆卸的连接在容纳盆的开口处,所述培养板上设有多个用于培养植物的培养孔,所述培养孔中设有定值棉。
9.根据权利要求8所述的水培装置,其特征在于,所述培养孔为70个,每个所述培养孔的直径为2.8cm,相邻的两个培养空之间的间距为3cm。
10.根据权利要求8所述的水培装置,其特征在于,所述培养板的尺寸为60×42×0.8-1cm;所述底箱的尺寸为60.5×43×15.5cm;所述底箱由不透明的材料制成。
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