CN113336595B - 一种基因编辑烟草黑色营养液配方及水培装置和水培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基因编辑烟草黑色营养液配方，基于重量百分比，其包括：炭黑素重量含量为1％‑5％，聚乙烯吡咯烷酮重量含量为0.1％‑0.5％，植酸重量含量为0.05％‑0.15％，余量按格里克基本营养液配方或改良霍格兰营养液配方。另外，本发明还公开一种基因编辑烟草单株水培装置及水培方法，其包括：水培杯(4)、定植杯(3)和吸水线(7)。本发明构建了单株水培养装置，每个植株的营养液单独外加，规避了营养液植株之间的交换共用，防止烟草病害通过营养液交换而交叉感染。另外本发明选择黑色营养液以解决水培绿藻滋生的问题。

Description

一种基因编辑烟草黑色营养液配方及水培装置和水培方法

技术领域

本发明属于烟草栽培领域，具体涉及一种基因编辑烟草黑色营养液配方及水培装置和水培方法，以及其在基因编辑素材筛选中的应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，也是常用一种分子遗传学研究的模式植物。烟草性状不仅受自身遗传物质影响，也受种植环境因素的影响。如不同的温度、气候和土壤等种植条件，对烟草的性状、产量和品质影响非常大。

水培是无土栽培中较为先进的一种栽培方式，是将植物根系直接与营养液接触。由营养液提供养分而进行的植物生产。水培能对植物的生长发育过程进行精准控制且管理方便。烟草水培栽培种植的优点在于比土壤种植提供了一个更统一规范且可复制的培养系统，烟草生长在水溶液中营养成分可以比较精确的控制，培养出健壮而整齐一致的植株，另一方面，生长在水溶液的烟草能容易地观察和收集到包括根在内的各部分组织。

但是同时常规烟草水培栽培种植存在一定不足，常规的烟草水培其水培营养液，不同植株之间是共用的。如果消毒不严存在种传病源，会而营养液的共用和交换，使得不同植株之间病害交叉感染，从而影响植株的生长发育，导致科研实验报废。另外，由于营养液在光照条件下，容易滋生绿藻。绿藻会与水培植物竞争营养和氧气，会导致烟株营养缺乏，或缺氧引发烂根、叶黄等问题。为了抑制绿藻，通常选择抗生素等作为营养液，同时向营养液中添加绿藻抑制剂如硫酸铜、除草剂(扑草净)等，这些试剂(绿藻抑制剂)本身对植株存在一定的损害，同时也存在污染和毒性等问题。

因此，人们希望开发一种基因编辑烟草单株水培装置以及研发新型的水培营养液，既能解决病源交互感染的问题，同时还可以杜绝绿藻滋生。

为了解决以上问题，提出本发明。

发明内容

为了解决病源交互感染的问题，本发明构建了单株水培养装置，每个植株的营养液单独外加，规避了营养液植株之间的交换共用，实现每个种植营养液的单独使用，防止烟草病害通过营养液交换而交叉感染。另外本发明选择在水培过程中添加的营养液为自主研发的黑色营养液，其可以起到遮光的效果，防止绿藻的滋生。

本发明目的在于针对现有技术不足，提供了一种基因编辑烟草黑色营养液配方及水培装置，采用本发明可有效防病害交叉感染，避免绿藻滋生，本发明的方法操作简单、装置设备成本低，适合用于编辑素材的精细化比较。

本发明目的通过下列技术方案予以实现：

本发明第一方面提供一种基因编辑烟草黑色营养液配方，基于重量百分比，其包括：炭黑素重量含量为1％-5％，聚乙烯吡咯烷酮重量含量为0.1％-0.5％，植酸重量含量为0.05％-0.15％，余量按格里克基本营养液配方或改良霍格兰营养液配方。格里克基本营养液配方或改良霍格兰营养液配方是本领域技术人员公知的营养液配方，本发明相当于在该配方的基础上加入炭黑素、聚乙烯吡咯烷酮、植酸。

优选地，所述的炭黑色素粒径范围为50～500nm。

优选地，所述的聚乙烯吡咯烷酮分子量2000～10000。设定聚乙烯吡咯烷酮分子量和炭黑色素粒径的目的在于保证营养液均匀且粘度适中。其中如果聚乙烯吡咯烷酮分子量太大就会导致其贴在水培杯壁上。

本发明第二方面提供一种基因编辑烟草单株水培装置，使用本发明第一方面所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，所述基因编辑烟草单株水培装置包括：水培杯4、定植杯3、吸水线7；

所述水培杯4顶部具有水培杯盖2，所述水培杯4内部容纳有营养液5；

所述定植杯3位于所述水培杯4内部，且通过所述水培杯盖2固定在所述水培杯4的上部分；所述定植杯3中装有烟苗1和用于培养所述烟苗1的基质；所述定植杯3底部具有吸水线孔31，所述吸水线7从所述吸水线孔31穿出，使所述吸水线7一端位于所述基质中，另一端位于所述营养液中5，用于将所述营养液5吸取到基质中；

所述吸水线7的材料为聚酯纤维。

优选地，所述定植杯3和所述水培杯4均为圆柱形，且所述定植杯3直径小于所述水培杯4，所述定植杯3高度小于所述水培杯4，以保证所述定植杯3可以装入所述水培杯4内部，优选地，所述定植杯3高度为所述水培杯4的0.2-0.5倍。

优选地，所述水培杯盖2上具有定植杯孔21，所述定植杯3从所述定植杯孔21穿出，并插入所述水培杯4中；所述水培杯盖2向所述水培杯4一侧凹陷形成凹槽22，优选地，所述水培杯盖2上所述凹槽22的深度为1cm-3cm；

所述定植杯孔21孔径大于或等于所述定植杯3杯身外径，但所述定植杯3固定边沿直径大于所述定植杯孔21孔径0.5-1cm，且所述定植杯3固定边可承重1kg以上重量，以使所述定植杯3可以被所述水培杯盖2托举固定。

设置成凹槽结构有利于添加水或者营养液，添加水或者营养液时只需要将水或者营养液倒入所述水体杯盖2的凹槽22中即可，一定时间后凹槽22中的营养液会随着所述定植杯3中的基质或者包裹烟苗1的黑色聚酯纤维渗入到所述水培杯4底部。而现有技术向水培杯4加营养液通常是将定植杯3抬起一定距离，通过定植杯孔21添加水或者营养液，本发明水培装置培育过程中后续添加水或者营养液更加方便，易于实施。

优选地，所述定植杯3的四周壁上或者底部吸水线孔31周围具有多个开孔，有利于定植的烟株与营养液充分接触和根透出。

优选地，所述烟苗1的根部用黑色聚酯纤维包裹。

本发明第三方面提供一种对基因编辑烟草单株水培的方法，使用本发明第二方面所述的基因编辑烟草单株水培装置，使用本发明第一方面所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，具体包括以下步骤：

(a)、基因编辑烟草采用正常漂浮育苗，烟苗1达到正常移栽壮苗标准后，挑选长势、大小均匀的烟苗1进行移栽；

(b)、移栽时，把烟苗1从苗盘拔出，用黑色聚酯纤维包裹住烟根，同时连根上附着的育苗基质一起包裹，包裹好后，把烟苗1植入定植杯3中，定植杯3的底部预先装好吸水线7；

(c)、在水培杯4中装入营养液5，营养液5的液面稍低于水培杯盖2的底部；把植入烟苗1的定植杯3放入水培杯4中，遮光培养2-3天，然后恢复正常光照。遮光培养是将整个装置进行遮光培养，更利于烟苗生长发根。

优选地，恢复正常光照后还包括以下步骤：

(d)、烟苗恢复正常光照后，按正常水培方法管理，定期补充水或营养液，添加水和营养液时，可直接添加在水培杯盖2的凹槽22中，水和营养液会随着所述定植杯3中的基质或者包裹烟苗1的黑色聚酯纤维渗入到所述水培杯4底部。

(e)、烟株生长到现蕾期，挑选大小均匀、叶片数相当、现蕾时间接近的烟株进行分组，并进行性状观察，并采集叶片进行编辑靶标化学成分检测，并以观察和测定结果判定编辑基因对表型和靶标代谢成分的影响。

本发明第四方面提供一种防病害交叉感染的无绿藻的烟草水培方法，使用本发明第二方面所述的基因编辑烟草单株水培装置，使用本发明第一方面所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，对基因编辑烟草单株水培。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、为了解决水培绿藻滋生的问题，本发明水培过程中添加的营养液为自主研发的黑色营养液，其可以起到遮光的效果，从而防止绿藻的滋生。

2、为了解决病源交互感染的问题，本发明构建了单株水培养装置，每个植株的营养液单独外加，规避了营养液植株之间的交换共用，实现每个种植营养液的单独使用，防止烟草病害通过营养液交换而交叉感染。

3、选择黑色营养液可以解决水培绿藻滋生的问题，同时水培杯4是透明的，可以直接方便的观察营养液水位。

4、本发明采用黑色聚酯纤维包裹所述烟苗1的根部，聚酯纤维有好的吸水性和刚性，遇水不会收缩，并且长时间不会腐烂，可长期保持。聚酯纤维包裹可显著提升烟根的透气性，有效避免常规水培缺氧而导致的根腐现象，非常有利烟株健康生长。

5、本发明所述水培杯盖2向所述水培杯4一侧凹陷形成凹槽22，更优选地，所述水培杯盖2上所述凹槽22的深度为1cm-3cm；设置成凹槽结构有利于添加水或者营养液，添加水或者营养液时只需要将水或者营养液倒入所述水体杯盖2的凹槽22中即可，一定时间后凹槽22中的营养液会随着所述定植杯3中的基质或者包裹烟苗1的黑色聚酯纤维渗入到所述水培杯4底部。而现有技术向水培杯4加营养液通常是将定植杯3抬起一定距离，通过定植杯孔21添加水或者营养液，本发明水培装置培育过程中后续添加水或者营养液更加方便，易于实施。更简单来说，采用下凹结构的水培杯盖，添加水和营养液时，可直接添加在杯盖中，水和营养液会从聚酯纤维缝隙漏到水培杯中。非常有利于浇水和添加营养液。

附图说明

图1为为本发明的基因编辑烟草单株水培装置结构示意图：

附图标记的名称为：1-烟苗、2-水培杯盖、3-定植杯、4-水培杯、5-营养液、6-黑色聚酯纤维、7-吸水线、21-定植杯孔、22-凹槽、31-吸水线孔。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例和对比例中所需要的原料均为市售。

实施例1

营养液：粒径范围为200nm的炭黑素重量含量2％，分子量为5000聚乙烯吡咯烷酮重量含量0.3％，植酸重量含量0.1％，其他配方按格里克基本营养液配方。

水培装置：直径8cm，高度10cm的透光的水培杯，杯盖下凹2cm；定植杯的直径为5cm，高度为5cm，定植杯固定边沿直径大于水培杯0.5cm，且可承重2kg以上重量。配置好的营养液到入水培杯中，至水培杯高度8cm处。

将基因编辑烟草和母本对照烟草，采用正常漂浮育苗，烟苗达到正常移栽壮苗标准后，挑选长势、大小均匀的20株烟苗分别进行移栽。移栽时，把烟苗从苗盘拔出，用黑色聚酯纤维包裹住烟根(连根上附着的育苗基质一起包裹)，包裹好后，把烟苗植入定植杯中，定植杯的底部预先装好吸水线。在水培杯中装入营养液，营养液的液面稍低于水培杯盖的底部。把植入烟苗的定植杯放入水培杯盖的圆孔中，遮光培养2-3天，然后恢复正常光照。烟苗恢复正常光照后，按正常水培方法管理，定期补充水或营养液，添加水和营养液时，可直接添加在杯盖中，水和营养液会从聚酯纤维缝隙漏到水培杯中。烟株生长到现蕾期，观察其性状，挑选大小均匀、叶片数相当、现蕾时间接近的烟株进行分组，所得植株分别标记为实施例1母本和实施例1编辑，分别进行性状观察，并采集其中部烟叶，冻干后进行编辑靶标K的检测。

K检测采用流动分析仪进行检测。

性状观察按照YCT 142—2010烟草农艺性状调查测量方法。

表1基因编辑素材与母本数据对照

ID	株高cm	茎围cm	K％
				实施例1母本	77.8±4.2	3.5±0.4	1.45±0.33
实施例1编辑	80.4±4.6	3.6±0.3	3.12±0.46

由表1可知，采用本发明方法种植的母本和基因编辑素材长势都比较均匀，化学分析数据离散度小，所得基因编辑素K含量明显高于母本对照，可作为重点素材进行观察种植。

对照例1

采用常规的水培方法，即所有的植株的营养液共用，其他方法与实施例1中方法相同，种植相同的基因编辑素材20株，其植株标记实施A。对实施A进行性状观察和根腐病发病株数，并采集其中部烟叶，冻干后进行编辑靶标烟碱的检测。

表2不同种植方法离散度分析

ID	株高cm	茎围cm	烟碱ug/g	根腐病株
					实施例1编辑	80.4±4.6	3.6±0.3	3.12±0.46	0
实施例A	72±10.8	3.4±1.3	3.08±1.17	3

由表2可知，采用本发明方法与常规水培相比，离散度小更加均匀，更重要的是有效的控制根腐病发生。

对照例2

按照实施例1，种植母本20株，在团颗期，对其中一株用花叶病侵染，观察植株染病情况，其植株标记实施B。

采用常规的水培方法，即所有的植株的营养液共用，其他方法与实施例1中方法相同，种植母本20株，在团颗期，对其中一株用花叶病侵染，观察植株染病情况，其植株标记为对照B。

表3不同水培方法烟草不同生长期青枯病染病植株数

ID	现蕾期(株)	成熟期(株)
			实施B	1	1
对照B	11	15

由表可知，常规的水培方法由于共用营养液，病害随营养液传播而非常容易出现交叉感染，交叉感染率达到75％，而本发明则明显规避掉上述不足防止了病害的交叉感染，交叉感染率为0。

对照例3

按照实施例1，种植母本20株，在不同时期收集营养液，检测营养液中绿藻的含量，标记为实施例C。

采用常规水培方法，所有的植株的营养液共用，其他方法与实施例1中方法相同，在不同时期收集营养液，检测营养液中绿藻的含量，标记为对照C1。

采用透明水培杯，营养液与实施例1相同，但不加入炭黑素、聚乙烯吡咯烷酮和植酸，其他方法与实施例1中方法相同，在不同时期收集营养液，检测营养液中绿藻的含量，标记为对照C2。

绿藻含量检测方法采用血球计数板计数法，计算单位体积内绿藻个数

表4不同水培方法绿藻含量比较

ID	现蕾期(*10<sup>5</sup>个/ml)	成熟期(*10<sup>5</sup>个/ml)
			实施C	0.18	0.42
对照C1	0.2	0.89
			对照C2	12	27

由表可知本发明方法可以有效遏制绿藻的生长，有效避免绿藻会与水培植物竞争营养和氧气，从而导致烟株营养缺乏，或缺氧引发烂根、叶黄等问题。

Claims (10)

1.一种基因编辑烟草黑色营养液配方，其特征在于，基于重量百分比，其包括：炭黑色素重量含量为1%-5%，聚乙烯吡咯烷酮重量含量为0.1%-0.5%，植酸重量含量为0.05%-0.15%，余量按格里克基本营养液配方或改良霍格兰营养液配方。

2.根据权利要求1所述的基因编辑烟草黑色营养液配方，其特征在于，所述的炭黑色素粒径范围为50～500nm；所述的聚乙烯吡咯烷酮分子量2000～10000。

3.一种使用权利要求1-2任一项所述的基因编辑烟草黑色营养液配方的基因编辑烟草单株水培装置，其特征在于，使用权利要求1-2任一项所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，所述基因编辑烟草单株水培装置包括：水培杯（4）、定植杯（3）和吸水线（7）；

所述水培杯（4）顶部具有水培杯盖（2），所述水培杯（4）内部容纳有营养液（5）；

所述定植杯（3）位于所述水培杯（4）内部，且通过所述水培杯盖（2）固定在所述水培杯（4）的上部分；所述定植杯（3）中装有烟苗（1）和用于培养所述烟苗（1）的基质；所述定植杯（3）底部具有吸水线孔（31），所述吸水线（7）从所述吸水线孔（31）穿出，使所述吸水线（7）一端位于所述基质中，另一端位于所述营养液中（5）。

4.根据权利要求3 所述的基因编辑烟草单株水培装置，其特征在于，所述定植杯（3）和所述水培杯（4）均为圆柱形，且所述定植杯（3）直径小于所述水培杯（4），所述定植杯（3）高度小于所述水培杯（4），以保证所述定植杯（3）可以装入所述水培杯（4）内部。

5.根据权利要求4所述的基因编辑烟草单株水培装置，其特征在于，所述定植杯（3）高度为所述水培杯（4）的0.2-0.5倍；所述定植杯（3）的四周壁上或者底部吸水线孔（31）周围具有多个开孔；所述烟苗（1）的根部用黑色聚酯纤维包裹。

6.根据权利要求1所述的基因编辑烟草单株水培装置，其特征在于，所述水培杯盖（2）上具有定植杯孔（21），所述定植杯（3）从所述定植杯孔（21）穿出，并插入所述水培杯（4）中；所述水培杯盖（2）向所述水培杯（4）一侧凹陷形成凹槽（22）。

7.根据权利要求6所述的基因编辑烟草单株水培装置，其特征在于，所述水培杯盖（2）上所述凹槽（22）的深度为1cm-3cm；

所述定植杯孔（21）孔径大于或等于所述定植杯（3）杯身外径，但所述定植杯（3）固定边沿直径大于所述定植杯孔（21）孔径0.5-1cm，且所述定植杯（3）固定边可承重1kg以上重量，以使所述定植杯（3）可以被所述水培杯盖（2）托举固定。

8.一种对基因编辑烟草单株水培的方法，其特征在于，使用权利要求3-7任一项所述的基因编辑烟草单株水培装置，使用权利要求1-2任一项所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，具体包括以下步骤：

(a)、基因编辑烟草采用正常漂浮育苗，烟苗（1）达到正常移栽壮苗标准后，挑选长势、大小均匀的烟苗（1）进行移栽；

(b)、移栽时，把烟苗（1）从苗盘拔出，用黑色聚酯纤维包裹住烟根，同时连根上附着的育苗基质一起包裹，包裹好后，把烟苗（1）植入定植杯（3）中，定植杯（3）的底部预先装好吸水线（7）；

(c)、在水培杯（4）中装入营养液（5），营养液（5）的液面稍低于水培杯盖（2）的底部；把植入烟苗（1）的定植杯（3）放入水培杯（4）中，遮光培养2-3天，然后恢复正常光照。

9.根据权利要求8所述的水培方法，其特征在于，恢复正常光照后还包括以下步骤：

(d)、烟苗恢复正常光照后，按正常水培方法管理，定期补充水或营养液，添加水和营养液时，可直接添加在水培杯盖（2）的凹槽（22）中，水和营养液会随着所述定植杯（3）中的基质或者包裹烟苗（1）的黑色聚酯纤维渗入到所述水培杯（4）底部。

(e)、烟株生长到现蕾期，挑选大小均匀、叶片数相当、现蕾时间接近的烟株进行分组，并进行性状观察，并采集叶片进行编辑靶标化学成分检测，并以观察和测定结果判定编辑基因对表型和靶标代谢成分的影响。

10.一种防病害交叉感染的无绿藻的烟草水培方法，其特征在于，使用权利要求3-7任一项所述的基因编辑烟草单株水培装置，使用权利要求1-2任一项所述的基因编辑烟草黑色营养液配方作为基因编辑烟草水培营养液，对基因编辑烟草单株水培。

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