CN105557527A - 一种大花蕙兰人工种子制作方法 - Google Patents

Abstract

一种大花蕙兰人工种子制作方法，包括以下步骤：a)类原球茎诱导：以大花蕙兰无菌苗茎尖为材料接种于类原球茎诱导培养基生长，诱导形成类原球茎；b)原球茎增殖：步骤a)得到的类原球茎在固体增殖培养基生长20-30天后，转移至液体培养基进行增殖生长20-30天，增殖之后的大花蕙兰类原球茎用于人工种子制作和包埋；c)大花蕙兰人工种子制作与萌发：将步骤b)得到的类原球茎切分成单个类原球茎，采用海藻酸钠溶液和CaCl₂包埋，凝固形成的人工种子经过无菌和温室萌发。本发明方法可以用于不同大花蕙兰品种的人工种子的制作，温室播种萌发后形成的种苗可以代替常规组培苗进行大花蕙兰种苗的生产，降低大花蕙兰种苗生产成本。

Description

一种大花蕙兰人工种子制作方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种大花蕙兰人工种子制作方法。

背景技术

大花蕙兰(CymbidiumHybrid)为兰科兰属植物中的部分大花型附生种的杂交种，是世界上销量最高的洋兰之一。大花蕙兰花色鲜艳、花期长，观赏性极高，深受世界兰花爱好者的欢迎。由于大花蕙兰多为杂交品种，种子自然结实率相当低，且种子发育不完全，没有胚乳，常规情况下极难萌发，需要采用无菌播种技术才能萌发，后代萌发种子多出现性状分离，加之大花蕙兰分株能力弱，因而繁殖困难，繁殖速度慢，远远不能满足商品化生产的要求，而组织培养技术已成为大花蕙兰规模化繁殖与生产的重要手段(陈璋，2004)。国内研究大花蕙兰快速繁殖体系的报道虽多，但多集中在无菌苗增殖等方面，而采用类原球茎液体震荡培养对大花蕙兰增殖和人工种子包埋尚未见报道。

大花蕙兰常规组培苗工厂化生产，通常采用不定芽增殖和生根培养技术，操作步骤繁琐，生长周期长，机械化程度低，费工费时，能耗高，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种大花蕙兰人工种子制作方法，以克服现有技术的上述缺陷。

本发明的技术方案如下：

一种大花蕙兰人工种子制作方法，包括以下步骤：

a)类原球茎诱导：以大花蕙兰无菌苗茎尖为材料接种于类原球茎诱导培养基生长，诱导形成类原球茎；

b)原球茎增殖：步骤a)得到的类原球茎在固体增殖培养基生长20-30天后，转移至液体培养基进行增殖生长20-30天，增殖之后的大花蕙兰类原球茎用于人工种子制作和包埋；

c)大花蕙兰人工种子制作与萌发：将步骤b)得到的类原球茎切分成单个类原球茎，采用海藻酸钠溶液和CaCl₂包埋，凝固形成的人工种子经过无菌和温室萌发。

所述步骤a)中类原球茎诱导为将无菌苗茎尖接种到1/2MS+NAA0.5-2.0mg·L^-1+椰乳50-150ml·L^-1+蔗糖30-40g·L^-1+琼脂5.5-7.0g·L^-1+活性炭1.0g·L^-1的培养基上诱导形成类原球茎。

所述步骤b)中大花蕙兰类原球茎的固体增殖的步骤为：挑选生长状态接近的类原球茎，接种到1/2MS固体培养基添加NAA1.0-2.5mg·L^{- 1}+6-BA0.5-1.0mg·L^-1生长20-30天；

所述步骤b)中大花蕙兰类原球茎的液体增殖的步骤为：选用容积为100-500ml的三角瓶为培养容器，将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0-2.5mgL^-1+6-BA0.5-1.0mg·L^-1液体培养基中，每瓶接种2.0g，培养时间为20-30天，液体生长20天的类原球茎用于人工种子包埋。

所述步骤c)大花蕙兰人工种子制作与萌发包括以下步骤：

将海藻酸钠溶解于1/2MS培养液中，配制成质量浓度为2％-3％的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌。在无菌条件下，选择饱满硬脆的绿色类原球茎，分离直径5.0mm左右的颗粒置于海藻酸钠溶液中，然后用滴管吸取含有类原球茎的溶液滴入作为凝聚剂的2％CaCl₂溶液中，形成直径8.0mm左右的凝胶颗粒，20min后取出，以无菌水冲洗三次，置于培养皿中贮存备用；此外，人工种皮中需添加NAA0.5-2.0mg·L^-1+6-BA0.5-1.0mg·L^-1；

挑取未萌发的类原球茎，将类原球茎接种到铺有干燥滤纸的培养皿及铺有以无菌水湿润的滤纸的培养皿中，恒温培养20天。以不加有机元素的1/2MS+NAA0.5-2.0mg·L^-1+6-BA1.0-2.0mg·L^-1配置2％的海藻酸钠溶液，包埋上述类原球茎。得到的人工种子置于纯琼脂培养基的培养皿中，在培养室中培养，萌发率达到90％以上；

人工种子萌发：包埋形成的人工种子接种在无激素无营养培养基中统计萌发率，萌发率可达90％以上；直接播种萌发，萌发率可达到80％以上。

以上条件所用培养基除注明外，均添加3％的蔗糖和100-150ml·L-1椰子汁，活性炭1-2％，pH值调至5.4-5.6，培养条件为光照1000lx，16h光周期，25℃培养。

本发明的有益效果是：

迄今为止，兰科花卉人工种子制作技术的研究在石斛兰、文心兰、黄蝉兰等已有报道，但关于大花蕙兰人工种子的制作技术在国内外尚未见报道。本发明建立了大花蕙兰类原球茎液体培养基中快速增殖的基础上，以类原球茎为材料采用海藻酸钠和CaCl₂为人工种皮进行人工种子的制作，包埋的人工种子能正常萌发和成苗，该技术的进一步应用可以促进大花蕙兰优质种苗生产，提高生产效率，降低种苗生产成本。

而人工种子作为繁殖材料较无菌苗移栽具有更多的优越性。将类原球茎包埋制成人工种子则可以适用于种苗的机械化生产，缩短组织培养周期，提高种苗生产效率，降低成本，提高种苗发芽率和整齐度，提高生产效率。

本发明方法可以用于不同大花蕙兰品种的人工种子的制作，温室播种萌发后形成的种苗可以代替常规组培苗进行大花蕙兰种苗的生产，降低大花蕙兰种苗生产成本。

本发明以大花蕙兰茎尖诱导形成的类原球茎为材料，进行人工种子制作和包埋。类原球茎采用固体和液体两种培养基交替培养，生长速度快，增殖系数高，以液体培养增殖的类原球茎为材料，采用海藻酸钠和氯化钙进行人工种子包埋，人工种子种皮稳定，质量高，进一步培养萌发率高。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述：

实施例一：以大花蕙兰品种‘4073’为材料进行下列操作。

(1)供试材料：大花蕙兰茎尖诱导类原球茎，接种到1/2MS+NAA0.5mg·L^{- 1}+椰乳100ml·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.0g·L^-1+活性炭1.0g·L^-1的培养基上培养诱导出的类原球茎；

大花蕙兰类原球茎固体增殖：挑选生长状态接近的类原球茎，在无菌条件下称重，接种到1/2MS添加NAA2.0mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1，生长30天后进行固体培养增殖；

选用容积为100ml的三角瓶为培养容器，将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1液体培养基上，每瓶接种2.0g；

将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1液体培养基上，对其进行20d的培养，每瓶接种2.0g。

(2)大花蕙兰人工种子制作与萌发

将海藻酸钠溶解于1/2MS液体培养基中，配制质量浓度为2％的海藻酸钠溶液，高温高压蒸汽灭菌。在无菌条件下，选择饱满硬脆的绿色类原球茎，分离直径5.0mm左右的颗粒置于质量浓度分别为2％的海藻酸钠溶液中，然后用滴管吸取溶液滴入作为凝聚剂的质量浓度为2％的CaCl₂溶液中，形成直径8.0mm左右的凝胶颗粒，20min后取出，制作成类原球茎人工种子。以无菌水冲洗三次，平置于纯琼脂培养基的培养皿中。

在种皮中添加NAA0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1，除了以上成分外，种皮中都添加2％海藻酸钠。

挑取未萌发的类原球茎，分别接种添加1/2MS+2.0mg·L^-1NAA+6-BA1.0mg·L^-1的固体培养基和液体培养基；同时将类原球茎接种到铺有干燥滤纸的培养皿及铺有以无菌水湿润的滤纸的培养皿中，恒温培养20天。以不加有机元素的1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1配置2％的海藻酸钠溶液，包埋类原球茎，包埋的人工种子置于纯琼脂培养基的培养皿中，在培养室中培养，30天后萌发率达到90％。

以1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+2％海藻酸钠为基本种皮，分别添加质量浓度为1.0％的活性炭，对培养20天的类原球茎进行包埋，每个处理包埋50粒类原球茎，置于培养皿内，25℃恒温培养20天，继续培养20天，以突破种皮最长叶1.0cm为标准统计成苗率，成苗率达到80％。

以上条件所用培养基除注明外，均添加3％的蔗糖和100ml·L^-1椰子汁，活性炭0.1％，pH值调至5.4，培养条件为光照1000lx，16h光周期，25℃培养。

实施例二：以大花蕙兰品种‘4083’为材料进行下列操作。

(1)供试材料：大花蕙兰茎尖诱导类原球茎，接种到1/2MS+NAA1.0mg·L^{- 1}+150ml·L^-1椰乳+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.0g·L^-1+活性炭1.0g·L^-1的培养基上培养诱导出的类原球茎；

大花蕙兰类原球茎的固体增殖：挑选生长状态接近的类原球茎，在无菌条件下称重，接种到1/2MS添加NAA2.0mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1，生长30天后进行固体培养增殖；

选用容积为200ml的三角瓶为培养容器，将类原球茎接种到1/2MS+NAA1.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1液体培养基上，每瓶接种4.0g，生长20天；

将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1液体培养基上，对其进行20d的培养，每瓶接种2.0g，生长30天后用于人工种子包埋；

(2)大花蕙兰人工种子制作与萌发

将海藻酸钠溶解于MS液体培养基中，配制质量浓度为2％的海藻酸钠溶液，高压灭菌。在无菌条件下，选择饱满硬脆的绿色类原球茎，分离直径5.0mm左右的颗粒置于质量浓度分别为2％的海藻酸钠溶液中，然后用滴管吸取溶液滴入作为凝聚剂的质量浓度为2％的CaCl₂溶液中，形成直径8.0mm左右的凝胶颗粒，20min后取出，制作成类原球茎人工种子。以无菌水冲洗三次，平置于纯琼脂培养基的培养皿中；

在种皮中添加NAA0.5mg·L^-1+6-BA2.0mg·L^-1，除了以上成分外，种皮中都添加2％海藻酸钠；

将类原球茎接种到铺有干燥滤纸的培养皿及铺有以无菌水湿润的滤纸的培养皿中，恒温培养20天进行干燥处理。以不加有机元素的1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1配置2％的海藻酸钠溶液，包埋类原球茎，包埋的人工种子置于纯琼脂培养基的培养皿中，在培养室中培养，30天后萌发率达到90％。

以1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+2％海藻酸钠为基本种皮，分别添加质量浓度为1.0％的活性炭，对培养20天的类原球茎进行包埋，置于培养皿内，25℃恒温培养40天，以突破种皮最长叶1.0cm为标准统计成苗率，成苗率达到85％；

以上条件所用培养基除注明外，均添加3％的蔗糖和100ml·L^-1椰子汁，活性炭0.1％，pH值调至5.4，培养条件为光照1000lx，16h光周期，25℃培养。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容已经全部记载在权利要求书中。

Claims (5)

1.一种大花蕙兰人工种子制作方法，其特征包括以下方面：

a)类原球茎诱导：以大花蕙兰无菌苗茎尖为材料接种于类原球茎诱导培养基生长，诱导形成类原球茎；

b)类原球茎增殖：步骤a)得到的类原球茎在固体增殖培养基生长20-30天后，转移至液体培养基进行增殖生长20-30天，增殖之后的大花蕙兰类原球茎用于人工种子制作和包埋；

c)大花蕙兰人工种子制作与萌发：将步骤b)得到的类原球茎切分成单个类原球茎，采用海藻酸钠溶液和CaCl₂包埋，凝固形成的人工种子经过无菌和温室萌发。

2.根据权利要求书1所述大花蕙兰人工种子制作方法，其特征在于所述步骤a)中类原球茎诱导为将无菌苗茎尖接种到1/2MS+NAA0.5-2.0mg·^-1+椰乳50-150ml·L^-1+蔗糖30-40g·L^-1+琼脂5.5-7.0g·L^-1+活性炭1.0g·L^-1的培养基上诱导形成类原球茎。

3.根据权利要求书1所述大花蕙兰人工种子制作方法，其特征在于所述步骤b)中大花蕙兰类原球茎的固体增殖的步骤为：挑选生长状态接近的类原球茎，在无菌条件下称重，接种到1/2MS固体培养基添加NAA1.0-2.5mg·L^-1+6-BA0.5-1.0mg·L^-1生长20-30天。

4.根据权利要求书1所述大花蕙兰人工种子制作方法，其特征在于所述步骤b)中大花蕙兰类原球茎的液体增殖的步骤为：选用容积为100-500ml的三角瓶为培养容器，将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0-2.5mgL^-1+6-BA0.5-1.0mg·L^-1液体培养基中，每瓶接种2.0g，培养时间为20-30天，液体生长20天的类原球茎用于人工种子包埋。

5.根据权利要求书1所述大花蕙兰人工种子制作方法，其特征在于所述步骤c)大花蕙兰人工种子制作与萌发包括以下步骤：

将海藻酸钠溶解于1/2MS培养液中，配制成质量浓度为2％-3％的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌。在无菌条件下，选择饱满硬脆的绿色类原球茎，分离直径5.0mm左右的颗粒置于海藻酸钠溶液中，然后用滴管吸取含有类原球茎的溶液滴入作为凝聚剂的2％CaCl₂溶液中，形成直径8.0mm左右的凝胶颗粒，20min后取出，以无菌水冲洗三次，置于培养皿中贮存备用；此外，人工种皮中需添加NAA0.5-2.0mg·L^-1+6-BA0.5-1.0mg·L^-1；

挑取未萌发的类原球茎，将类原球茎接种到铺有干燥滤纸的培养皿及铺有以无菌水湿润的滤纸的培养皿中，恒温培养20天。以不加有机元素的1/2MS+NAA0.5-2.0mg·L^-1+6-BA1.0-2.0mg·L^-1配置2％的海藻酸钠溶液，包埋上述类原球茎。得到的人工种子置于纯琼脂培养基的培养皿中，在培养室中培养，萌发率达到90％以上；

人工种子萌发：包埋形成的人工种子接种在无激素无营养培养基中统计萌发率，萌发率可达96.2％；直接播种萌发，萌发率可达到80％以上。