CN1843095A

CN1843095A - 金线莲人工种子制作方法

Info

Publication number: CN1843095A
Application number: CN200610040176.5A
Authority: CN
Inventors: 张明生; 王勐骋; 甄艳; 杨永华; 曹巧云; 殷召静; 王康
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2026-05-11
Also published as: CN100403883C

Abstract

本发明属于植物人工种子生产技术领域，主要提供了紧缺难繁药用植物金线莲的人工种子制作关键技术。具体涉及金线莲原球茎的诱导增殖及原球茎悬浮系的建立，金线莲人工种子的人工种皮包埋基质、人工胚乳及人工种子萌发基质的制备，金线莲人工种子的贮藏及播种技术，为金线莲规模化人工栽培开辟了新途径。

Description

金线莲人工种子制作方法

一、技术领域

本发明属于植物人工种子生产技术领域。

二、背景技术

金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.，是兰科开唇兰属(Anoectochilus)一种多年生草本植物，主要分布于亚洲的日本、中国、斯里兰卡、印度和尼泊尔等国。金线莲是我国传统的珍贵药材，全草入药，其味甘微苦，性平微寒，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效，用于治疗肝炎、糖尿病、高血压、小儿惊风、毒蛇咬伤、性病、风湿病、肿瘤等(江西中医学院学报.1999，11：188-189；中草药.2000，31：944-946)等疾病，素有“金草”、“神药”、“药虎”、“药王”等美称。金线莲株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品。随着研究的深入，金线莲的优良品质突显，日益受到世人青睐，具有广阔的开发利用前景。

由于金线莲对生态环境要求严格，自然繁殖和生长缓慢，加上鸟兽喜食和人为肆意采挖，致使野生资源锐减，现已处于濒临灭绝的境地，国际市场上药材价格高达6000美元/kg。为挽救这一珍稀物种以确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，必须及时进行该药用植物野生变家种的人工种植。

然而，种子种苗的培育是中药材人工种植首先必须解决的关键问题。由于金线莲种子微小，自然条件下难以萌发。近年来，虽然不少研究者在金线莲组织培养与离体快繁研究方面取得较大突破，但因其试管苗生产周期较长，成本较高，炼苗移栽成活率低，且不便贮藏和运输，从而限制了规模化生产。而人工种子与试管苗相比，所用培养基量少、体积小、繁殖及发芽成苗快、运输与保存方便，是解决金线莲药材规模化生产所需种子种苗的一条有效途径。

三、发明内容

本发明解决的主要问题是珍稀紧缺药用植物金线莲的人工种子生产技术，即采用现代生物技术方法获得金线莲原球茎，以原球茎作为人工种子的繁殖体，将其包埋在含有营养物质、生长调节物质、防腐剂、杀虫剂和杀菌剂等复合成分的胶囊内制成金线莲人工种子，为该药用植物的GAP种植奠定基础。本发明涉及金线莲原球茎的诱导与增殖，人工种皮的制备，人工胚乳的配制，人工种子的包埋与贮藏等。

在本发明中，术语“原球茎”是指通过离体培养兰科植物顶端分生组织、腋芽或不定芽所形成的可以分化发育成植株的结构。

(一)本发明中的材料

金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.采自其地道产区黔东南。

(二)本发明的技术方案

1.金线莲原球茎的诱导与增殖培养

将新鲜野生金线莲全草洗净、充分消毒后，去掉根和叶，剪成约1cm长的带节茎段，无菌环境下将其接种在原球茎诱导培养基上，培养基组成为MS+2.0～3.0mg·l^-16-BA+0.2～0.5mg·l^-1NAA+0.5～0.8mg·l^-1ZT+25.0～30.0g·l^-1蔗糖+6.0～8.0g·l^-1琼脂，pH5.7～6.0。25±1℃、每日500～1000lx弱光照射10～12h的条件下培养25～30d后，外植体上先后分化出2～5个乳白色原球茎。此时将原球茎切成2～4块移植于原球茎增殖培养基上，增殖培养基组成与诱导培养基相同。增殖培养20～25d后，分化出新的团块状丛生形原球茎增殖群体。

2.原球茎悬浮系的建立及人工种子繁殖体的获得

将原球茎团块分散后按3～5g/瓶鲜重的接种量接种于盛有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为1/2MS+2.0～3.0mg·l^-16-BA+0.2～0.3mg·l^-1NAA+0.4～0.6mg·l^-1ZT+25.0～30.0g·l^-1蔗糖，pH5.7～6.0。25±1℃、摇床转速60r·min^-1、漫射光下培养，每10d更换培养基1次，培养30d后，筛选悬浮系中适宜大小的原球茎供作金线莲人工种子的繁殖体。

3.金线莲人工种子的制作与贮藏

以金线莲原球茎为繁殖体，3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖+1.5～3.0％CaCl₂为人工种皮基质，0.1～0.2mg·l^-1NAA+0.1～0.2mg·l^-1GA₃+0.3～0.5mg·l^-16-BA+0.3～0.5mg·l^-1青霉素+0.3～0.5％多菌灵粉剂+0.2～0.4％苯甲酸钠+1.0～1.5％的蔗糖+1.0～1.5％的活性炭为人工胚乳成分，制作金线莲人工种子。将制成的金线莲人工种子用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存。

本发明的有益效果是既克服了金线莲自然繁殖率低的困难，也弥补了从离体培养产生试管苗再生植株生产周期较长、成本高、炼苗移栽工作量大且不便贮藏和运输的不足。这项发明成果不仅为挽救金线莲这一宝贵资源提供了技术保障，为其它濒危难繁物种的保存提供了参考依据，也为该植物野生变家种规模化人工种植所需种子种苗的生产提供了新的途径。

四、附图说明

图1人工种子制作流程

A外管，B繁殖体，C内管，D人工胚乳，E 1.5％～3.0％CaCl₂溶液，F人工种子

五、具体实施方式

1.金线莲原球茎的诱导与增殖培养

(1)金线莲原球茎的诱导

将新鲜野生金线莲全草用自来水冲洗1-2h，再用肥皂水振荡3～5min，洗去肥皂水后，以无菌水冲洗一遍，用75％乙醇浸泡0.5～1min，再在0.1％HgCl₂溶液中浸泡10～15min，无菌水冲洗3～5遍，吸干表面水分，去掉根和叶，剪成约1cm长的带节茎段，无菌保存备用。在无菌环境下，将消毒后的金线莲带节茎段接种在原球茎诱导培养基上，培养基组成为MS+2.0～3.0mg·l^-16-BA+0.2～0.5mg·l^-1NAA+0.5～0.8mg·l^-1ZT+25.0～30.0g·l^-1蔗糖+6.0～8.0g·l^-1琼脂，pH5.7～6.0。25±1℃、每日500～1000lx弱光照射10～12h的条件下培养25～30d后，待外植体上先后分化出2～5个乳白色原球茎时进行增殖培养。

(2)金线莲原球茎的增殖培养

将由金线莲带节茎段诱导出的原球茎切成2～4块移植于原球茎增殖培养基上，增殖培养基组成与诱导培养基相同；增殖培养，待分化出新的团块状丛生形原球茎增殖群体后(约20～25d)，将其用作建立原球茎悬浮系的材料。

2.建立原球茎悬浮系以获得人工种子繁殖体

将原球茎团块分散后按3～5g/瓶鲜重的接种量接种于盛有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为1/2MS+2.0～3.0mg·l-1 6-BA+0.2～0.3mg·l-1 NAA+0.4～0.6mg·l-1 ZT+25.0～30.0g·l-1蔗糖，pH5.7～6.0；25±1℃、摇床转速60r·min^-1、漫射光下培养，每10d更换培养基1次，培养30d后，用尼龙网从原球茎悬浮系中筛选适宜大小的原球茎供作金线莲人工种子制作的繁殖体。

3.金线莲人工种子的制作与贮藏

(1)金线莲人工种子的制作

以金线莲原球茎为繁殖体，4.0％海藻酸钠+2.0％壳聚糖+2.0％CaCl₂为人工种皮基质，0.1mg·l^-1NAA+0.2mg·l^-1GA₃+0.3mg·l^-16-BA+0.3mg·l^-1青霉素+0.4％多菌灵粉剂+0.3％苯甲酸钠+1.5％的蔗糖+1.5％的活性炭为人工胚乳成分，制作金线莲人工种子。其具体操作方法为：将金线莲的原球茎均匀悬浮于人工胚乳溶液后，一同注入用于包埋人工种子的双重管的内管中，再将用1/2 MS液体培养基配制的4.0％海藻酸钠和2.0％壳聚糖溶液注入双重管的外管；从内管滴出的浸没在人工胚乳中的单个繁殖体(原球茎)，被外管流出的人工种皮凝胶包裹形成球状体后，滴入2.0％ CaCl₂溶液中固化30min，即得金线莲人工种子(图1)。

将金线莲人工种子播种于MS固体培养基上，(25±1)℃、每日1000lx光照12h，25d后统计其萌发率，40d后考查成苗率，结果见表1和表2。

表1不同人工种皮基质对金线莲人工种子萌发率和成苗率的影响

人工种皮基质	萌发率(％)	成苗率(％)
人工种皮基质	萌发率(％)	成苗率(％)	4％海藻酸钠+2％CaCl₂+2％壳聚糖固形基质¹⁾+2％壳聚糖4％海藻酸钠+2％CaCl₂固形基质	74.8a²⁾6.9d60.3c66.4b	62.4a1.5c43.7b49.3b

¹⁾固形基质，即粘土∶蛭石∶MS培养液＝2∶1∶2。

²⁾新复极差检验，不同字母表示处理平均数之间在α＝0.05水平差异显著。下同。

表2不同组分人工胚乳对金线莲人工种子萌发和成苗的影响

人工胚乳成分(溶剂为1/2MS培养液)								萌发率(％)	成苗率(％)
人工胚乳成分(溶剂为1/2MS培养液)										NAA	BA	GA₃	青霉素	苯甲酸钠	多菌灵	蔗糖	活性炭
0.20.20.20.20.20.20.20.2	0.50.50.50.50.50.50.50.5	0.10.10.10.10.10.10.10.1	0.40.40.40.40.40.40.40.4	0.20.20.20.20.20.20.20.2	0.30.30.30.30.30.30.30.3	1.01.01.01.01.01.01.01.0	1.01.01.01.01.01.01.01.0			NAA	BA	GA₃	青霉素	苯甲酸钠	多菌灵	蔗糖	活性炭	82.6a75.7ab63.2cd65.9c55.6d69.7bc66.8c63.1cd70.8bc	76.3a64.3b59.8bc61.9bc54.3c67.7b60.6bc61.8bc62.9bc

注：种皮基质为4％海藻酸钠+2％CaCl₂+2％壳聚糖；激素和抗生素的单位为mg·l^-1，苯甲酸钠、多菌灵粉剂、蔗糖及活性炭的加入量为占人工胚乳总量的百分率。

(2)金线莲人工种子的贮藏

将制成的金线莲人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存。不同贮温和贮期对金线莲人工种子萌发和成苗的影响见表3。

表3不同贮温和贮期对金线莲人工种子萌发和成苗的影响

贮藏温度(℃)	贮藏时间(d)	萌发率(％)	成苗率(％)
贮藏温度(℃)	贮藏时间(d)	萌发率(％)	成苗率(％)	41225	204060204060204060	58.3a46.7bc32.8de54.2ab38.9cd24.6e40.1c d25.4e9.7f	55.5a40.3b22.6de48.8a29.9cd13.7f36.4bc17.8ef1.3g

Claims

1.一种金线莲人工种子制作方法，其特征在于用金线莲茎段诱导产生的原球茎作为繁殖体制作人工种子，具体步骤为：

(1)原球茎的诱导：将新鲜野生金线莲全草用自来水冲洗1～2h，再用肥皂水振荡3～5min，洗去肥皂水后，以无菌水冲洗一遍，用75％乙醇浸泡0.5～1min，再在0.1％HgCl₂溶液中浸泡10～15min，无菌水冲洗3～5遍，吸干表面水分，去掉根和叶，剪成约1cm长的带节茎段，无菌保存备用；在无菌环境下，将消毒后的金线莲带节茎段接种在原球茎诱导培养基上，培养基组成为MS+2.0～3.0mg·l^-16-BA+0.2～0.5mg·l^-1NAA+0.5～0.8mg·l^-1ZT+25.0～30.0g·l^-1蔗糖+6.0～8.0g·l^-1琼脂，pH 5.7～6.0；25±1℃、每日500～1000lx弱光照射10～12h的条件下培养25～30d后，外植体上先后分化出2～5个乳白色原球茎；

(2)原球茎的增殖：将由金线莲带节茎段诱导出的原球茎切成2～4块移植于原球茎增殖培养基上，增殖培养基组成与诱导培养基相同；增殖培养20～25d后，分化出新的团块状丛生形原球茎增殖群体；

(3)原球茎悬浮系的建立及人工种子繁殖体的获得：将原球茎团块分散后按3～5g/瓶鲜重的接种量接种于盛有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为1/2MS+2.0～3.0mg·l^-16-BA+0.2～0.3mg·l^-1NAA+0.4～0.6mg·l^-1ZT+25.0～30.0g·l^-1蔗糖，pH 5.7～6.0；25±1℃、摇床转速60r·min^-1、漫射光下培养，每10d更换培养基1次，培养30d后，悬浮系中的原球茎用作金线莲人工种子的繁殖体；

(4)金线莲人工种子的制作与贮藏：

(a)金线莲人工种子的种皮基质为：3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖+1.5～3.0％CaCl₂；

(b)金线莲人工种子的胚乳成分为：0.1～0.2mg·l^-1NAA+0.1～0.2mg·l^-1GA3+0.3～0.5mg·l^-16-BA+0.3～0.5mg·l^-1青霉素+0.3～0.5％多菌灵粉剂+0.2～0.4％苯甲酸钠+1.0～1.5％的蔗糖+1.0～1.5％的活性炭；

(c)金线莲人工种子制作过程为：将金线莲人工种子的繁殖体，即原球茎，均匀悬浮于人工胚乳溶液后，一同注入特制的用于包埋人工种子的双重管的内管中，再将用1/2 MS液体培养基配制的3.0～5.0％海藻酸钠和1.0～3.0％壳聚糖溶液注入双重管的外管；从内管滴出的浸没在人工胚乳中的单个繁殖体，被外管流出的人工种皮凝胶包裹形成球状体后滴入1.5～3.0％CaCl₂溶液中固化25～30min，即得人工种子；

(d)金线莲人工种子的贮藏条件为：将金线莲人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存。