CN109757376B - 一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法 - Google Patents
一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，包括以下步骤：制备不定芽诱导培养基和生根培养基；外植体处理；不定芽的接种和诱导培养；生根接种和培养；移栽。本发明通过直接以华肖菝葜的茎段为外植体进行不定芽的诱导和幼苗的生产，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带3‑4条根，根长为3‑5cm，移栽后成活率达95％以上，大大缩短了繁育周期，显著提高了培养效率，降低了育苗成本，有效缓解了常规繁育体系生产不能满足市场需求的问题，可作为华肖菝葜种苗生产的一个重要途径。
Description
技术领域
本发明属于种苗培养技术领域，具体涉及一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法。
背景技术
白土苓为菝葜科植物华肖菝葜的干燥根状茎，其为攀援灌木，全株除老茎、叶柄、花被外，或多或少具短硬毛。药用华肖菝葜归肝、脾、膀胱经，具有健脾除湿、祛风、解毒的功效，主要用于风湿关节疼痛、脾虚泻泄、恶疮肿毒、梅毒、汞制剂慢性中毒、瘰疬溃烂的治疗。
药用华肖菝葜目前以野生资源为主，尚未形成规范化种植，还没有相关华肖菝葜组织培养技术方面的报道，因此，其繁殖速度较慢，资源有限，再加上人们掠夺式的采挖，致使种苗资源严重匮乏。如何通过组织培养技术来加快华肖菝葜种苗的繁育速度，为人工栽培华肖菝葜提供优良种苗，是缓解目前市场供不应求难题的有效途径。
发明内容
本发明提供了一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，解决了现有技术中华肖菝葜以野生资源为主，尚未形成规范化种植，以及由此导致的华肖菝葜繁殖速度较慢，资源有限，供不应求的问题。
本发明提供了一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，包括以下步骤：
步骤1，制备培养基
步骤1.1，制备不定芽诱导培养基
以MS培养基为基本培养基A，每升基本培养基A中添加6-苄氨基嘌呤4mg、α-萘乙酸0.7mg、琼脂粉8g、活性炭1g、柿子皮汁5-10g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.8-6.0，即得到所述不定芽诱导培养基；将配制好的不定芽诱导培养基分装于培养瓶中备用；
步骤1.2，制备生根培养基
以MS培养基为基本培养基B，每升基本培养基B中添加6-苄氨基嘌呤3mg、α-萘乙酸0.5mg、琼脂粉8g、活性炭1g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.6-6.0，即得到所述生根培养基；将配制好的生根培养基分装于培养瓶中备用；
步骤2，外植体处理
选择自然生长、无病虫害的健壮华肖菝葜植株茎段，先用肥皂水清洗，再用流水冲洗；冲洗完毕后，在无菌条件下，将华肖菝葜植株茎段在质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润，浸润完毕后用无菌水洗5遍，接着放入消毒液中浸泡，浸泡完毕后再用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌培养皿中备用；
其中，所述消毒液中含有质量份数为0.5-1％的Tween-20、质量份数为15-20％的次氯酸钠，余量为水；
步骤3，接种培养
步骤3.1，不定芽的接种和诱导培养
将步骤2中处理后的华肖菝葜植株茎段在无菌条件下切成至少含一个腋芽的若干茎段，再接种于步骤1.1中制好的不定芽诱导培养基中，每个培养瓶中接2个华肖菝葜植株茎段；
将接好种的培养瓶先移入培养室于25±1℃下进行黑暗培养，然后将培养瓶移至光照强度为2500LX、光照时间为16h/d、温度为25±1℃的条件下培养，直至得到颜色浓绿、高度不一、成簇的不定芽；
步骤3.2，生根接种和培养
将步骤3.1中生长良好的不定芽接种到步骤1.2中制好的生根培养基上，每个培养瓶中接1个不定芽；
将接种有不定芽的培养瓶先移入温度为25±1℃的温室黑暗培养24h，然后转入光照强度为2500LX、光照时间为16h/d的条件下培养，待产生不定根后再培养6-8周，有无毒苗形成；
步骤4，移栽
选苗高4-6cm、叶2片以上、发根3-4条的无毒苗，于室外散射光下进行常规炼苗5-7d，取出炼苗，洗净附着在炼苗根系上的培养基，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至装有蛭石和黑土混合基质的育苗小盆钵中，在常规浇水、施肥管理条件下，生长50-60d后，即得到移栽苗；
其中，所述混合基质中蛭石与黑土的质量比为2:1。
优选的，所述步骤1.1中柿子皮汁的制备方法如下：将柿子皮捣碎成柿子皮泥，加入相当于柿子皮泥总重量10倍的水，浸泡30min后过滤，滤液即为柿子皮汁。
优选的，所述步骤1.1中的不定芽诱导培养基和步骤1.2中的生根培养基均是加热至琼脂完全溶解后再趁热均匀地分装于培养瓶中，稍凉后加盖、备用。
优选的，所述步骤1.1中分装有不定芽诱导培养基的培养瓶和步骤1.2中分装有生根培养基的培养瓶在分装完后均进行灭菌处理。
优选的，所述灭菌处理条件如下：121℃、105kPa下灭菌15min。
优选的，所述步骤2中华肖菝葜植株茎段在质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润10-30S，在消毒液中浸泡10-20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明直接以华肖菝葜的植株茎段为外植体进行不定芽的诱导和幼苗的生产，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带3-4条根，根长为3-5cm，移栽后成活率达95％以上，大大缩短了繁育周期，显著提高了培养效率，降低了育苗成本，有效缓解了常规繁育体系生产不能满足市场需求的问题，可作为华肖菝葜种苗生产的一个重要途径。
附图说明
图1为实施例1的华肖菝葜植株茎段培养15d时产生的愈伤组织图片；
图2为实施例1的华肖菝葜植株茎段培养40d时形成的不定芽图片；
图3为实施例1的华肖菝葜植株茎段培养40d后得到的高度不一的不定芽图片；
图4为实施例1的不定芽生根培养后形成的无毒苗图片；
图5为实施例1的无毒苗移栽至育苗小盆钵后的图片。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所用MS培养基为市售MS培养基，不含琼脂和蔗糖，所用的试验方法和材料，如无特殊说明，均为常规方法和常规市售材料。
实施例1
一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，包括以下步骤：
步骤1，制备培养基
步骤1.1，制备不定芽诱导培养基
以MS培养基为基本培养基A，每升基本培养基A中添加6-苄氨基嘌呤4mg、α-萘乙酸0.7mg、琼脂粉8g、活性炭1g、柿子皮汁5g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.8，即得到不定芽诱导培养基；将不定芽诱导培养基加热至琼脂完全溶解后再趁热均匀地分装于培养瓶中，稍凉后加盖，然后将培养瓶于121℃、105kPa下灭菌15min，备用；
步骤1.2，制备生根培养基
以MS培养基为基本培养基B，每升基本培养基B中添加6-苄氨基嘌呤3mg、α-萘乙酸0.5mg、琼脂粉8g、活性炭1g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.6，即得到生根培养基；将生根培养基加热至琼脂完全溶解后再趁热均匀地分装于培养瓶中，稍凉后加盖，然后将培养瓶于121℃、105kPa下灭菌15min，备用；
步骤2，外植体处理
选择自然生长、无病虫害的健壮华肖菝葜植株茎段，先用肥皂水清洗，再用流水冲洗；冲洗完毕后，在无菌条件下，将华肖菝葜植株茎段在质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润30S，浸润完毕后用无菌水洗5遍，接着放入消毒液中浸泡20min，浸泡完毕后再用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌培养皿中备用；
其中，消毒液中含有质量份数为1％的Tween-20、质量份数为20％的次氯酸钠，余量为水；
步骤3，接种培养
步骤3.1，不定芽的接种和诱导培养
将步骤2中处理后的华肖菝葜植株茎段在无菌条件下切成至少含一个腋芽的若干茎段，再接种于步骤1.1中制好的不定芽诱导培养基中，每个培养瓶中接2个华肖菝葜植株茎段；
将接好种的培养瓶先移入培养室于25±1℃下进行黑暗培养，培养15d时有愈伤组织产生，到20d时长出大量的不定芽，然后将培养瓶移至光照强度为2500LX、光照时间为16h/d、温度为25±1℃的条件下培养，培养40d，得到颜色浓绿、高度不一、成簇的不定芽；
步骤3.2，生根接种和培养
将步骤3.1中生长良好的不定芽接种到步骤1.2中制好的生根培养基上，每个培养瓶中接1个不定芽；
将接种有不定芽的培养瓶先移入温度为25±1℃的温室黑暗培养24h，然后转入光照强度为2500LX、光照时间为16h/d的条件下培养，20d时有不定根产生，培养8周后，有无毒苗形成；
步骤4，移栽
选苗高4-6cm、叶2片以上、发根3-4条的无毒苗，于室外散射光下进行常规炼苗7d，取出炼苗，洗净附着在炼苗根系上的培养基，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至装有蛭石和黑土混合基质的育苗小盆钵中，生长60d后，即得到移栽苗；
其中，混合基质中蛭石与黑土的质量比为2:1。
实施例2
一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，包括以下步骤：
步骤1，制备培养基
步骤1.1，制备不定芽诱导培养基
以MS培养基为基本培养基A，每升基本培养基A中添加6-苄氨基嘌呤4mg、α-萘乙酸0.7mg、琼脂粉8g、活性炭1g、柿子皮汁10g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为6.0，即得到不定芽诱导培养基；将不定芽诱导培养基加热至琼脂完全溶解后再趁热均匀地分装于培养瓶中，稍凉后加盖，然后将培养瓶于121℃、105kPa下灭菌15min，备用；
步骤1.2，制备生根培养基
以MS培养基为基本培养基B，每升基本培养基B中添加6-苄氨基嘌呤3mg、α-萘乙酸0.5mg、琼脂粉8g、活性炭1g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为6.0，即得到生根培养基；将生根培养基加热至琼脂完全溶解后再趁热均匀地分装于培养瓶中，稍凉后加盖，然后将培养瓶于121℃、105kPa下灭菌15min，备用；
步骤2，外植体处理
选择自然生长、无病虫害的健壮华肖菝葜植株茎段，先用肥皂水清洗，再用流水冲洗；冲洗完毕后，在无菌条件下，将华肖菝葜植株茎段在质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润10S，浸润完毕后用无菌水洗5遍，接着放入消毒液中浸泡10min，浸泡完毕后再用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌培养皿中备用；
其中，消毒液中含有质量份数为0.5％的Tween-20、质量份数为15％的次氯酸钠，余量为水；
步骤3，接种培养
步骤3.1，不定芽的接种和诱导培养
将步骤2中处理后的华肖菝葜植株茎段在无菌条件下切成至少含一个腋芽的若干茎段，再接种于步骤1.1中制好的不定芽诱导培养基中，每个培养瓶中接2个华肖菝葜植株茎段；
将接好种的培养瓶先移入培养室进行黑暗培养，培养13d时有愈伤组织产生，到18d时长出大量的不定芽，然后将培养瓶移至光照强度为2500LX、光照时间为16h/d、温度为25±1℃的条件下培养，培养35d，得到颜色浓绿、高度不一、成簇的不定芽；
步骤3.2，生根接种和培养
将步骤3.1中生长良好的不定芽接种到步骤1.2中制好的生根培养基上，每个培养瓶中接1个不定芽；
将接种有不定芽的培养瓶先移入温度为25±1℃的温室黑暗培养24h，然后转入光照强度为2500LX、光照时间为16h/d的条件下培养，18d时有不定根产生，培养6周后，有无毒苗形成；
步骤4，移栽
选苗高4-6cm、叶2片以上、发根3-4条的无毒苗，于室外散射光下进行常规炼苗5d，取出炼苗，洗净附着在炼苗根系上的培养基，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至装有蛭石和黑土混合基质的育苗小盆钵中，在常规浇水、施肥管理条件下，生长50d后，即得到移栽苗；
其中，混合基质中蛭石与黑土的质量比为2:1。
需要说明的是，步骤1.1中柿子皮汁的制备方法如下：将柿子皮捣碎成柿子皮泥，加入相当于柿子皮泥总重量10倍的水，浸泡30min后过滤，滤液即为柿子皮汁。
为了进一步说明本发明的效果，本发明还设置了对比例，具体如下。
对比例1
一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，具体操作步骤同实施例1，不同之处在于，对比例1的不定芽诱导培养基中不含柿子皮汁。
对比例2
一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，具体操作步骤同实施例1，不同之处在于，对比例1的不定芽诱导培养基中不含柿子皮汁，但是生根培养基中含有5g的柿子皮汁。
对实施例1-2和对比例1-2的华肖菝葜幼苗的性能进行测试，以对本发明的效果进行说明，具体结果见表1。
表1华肖菝葜幼苗性能参数
从表1可以看出，在无菌条件下将含有腋芽的茎段接种于不定芽诱导培养基上，经过40d左右的培养就会有成簇、高度不一的不定芽长出；再将生长健壮的单个不定芽转移到生根培养基上进行根的诱导，生长6-8周后，每个不定芽都能分化出2-3片叶和4-5条根；生根后的组培苗移栽至基质中生长良好，2个月后植株成活率达95％以上。
实施例1-2的不定芽诱导培养基中添加有柿子皮汁，试验中发现，柿子皮汁对于诱导华肖菝葜植株茎段产生不定芽具有很好的促进作用，推测柿子皮中含有能够促进华肖菝葜植株茎段产生不定芽的活性物质，为了进一步验证柿子皮汁的效果，我们设置了对比例1和对比例2，对比例1的操作步骤和实施例1完全相同，不同之处仅在于对比例1的不定芽诱导培养基中没有添加柿子皮汁，试验结果发现，对比例1中愈伤组织诱导率仅为78.6％，不及实施例1-2的100％，充分证明了柿子皮汁对不定芽具有很好的促进作用。
为了进一步验证柿子皮汁对不定芽分化生根的影响，对比例2将柿子皮汁添加到了生根培养基中，发现添加了柿子皮汁后，分化率、生根率基本和实施例1-2相当，说明柿子皮汁对不定芽的分化、生根效果不明显。
本发明还对实施例1华肖菝葜整个组培快繁过程中得到的不同阶段的植株体状态进行了拍照，具体见图1-图5，从图1到图5可以看出，实施例1华肖菝葜整个组培快繁过程中各个阶段得到的植株体的状态均较好，说明本发明的组培快繁方法培育出了性状非常好的华肖菝葜幼苗。
本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备培养基
步骤1.1，制备不定芽诱导培养基
所述不定芽诱导培养基由以下成分组成：MS培养基1L，6-苄氨基嘌呤4mg、α-萘乙酸0.7mg、琼脂粉8g、活性炭1g、柿子皮汁5-10g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.8-6.0，即得到所述不定芽诱导培养基；
步骤1.2，制备生根培养基
所述生根培养基由以下成分组成：MS培养基1L，6-苄氨基嘌呤3mg、α-萘乙酸0.5mg、琼脂粉8g、活性炭1g和蔗糖30g，混合均匀后调节pH值为5.6-6.0，即得到所述生根培养基；
步骤2，外植体处理
选择健壮华肖菝葜植株茎段，用水洗净，然后置于质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润，浸润完毕后用无菌水洗，再置于消毒液中浸泡，浸泡完毕后再用无菌水清洗，沥干水分，备用；
其中，消毒液中含有质量份数为0.5-1％的Tween-20、质量份数为15-20％的次氯酸钠，余量为水；
步骤3，接种培养
步骤3.1，不定芽的接种和诱导培养
将步骤2处理后的华肖菝葜植株茎段切成至少含一个腋芽的茎段，再接种于步骤1.1制好的不定芽诱导培养基中；
接种后的华肖菝葜植株茎段先在黑暗条件下培养，培养至长出不定芽后，再将长出不定芽的华肖菝葜植株茎段移至光照条件下培养，直至得到颜色浓绿、成簇的不定芽；
步骤3.2，生根接种和培养
将步骤3.1得到的不定芽接种到步骤1.2制好的生根培养基中；将接种后的不定芽先在黑暗条件下培养24h，然后转入光照条件下培养，待有不定根产生后再培养6-8周后，形成无毒苗；
步骤4，移栽
将无毒苗炼苗后用质量浓度为0.1％的多菌灵溶液消毒，然后移栽至装有蛭石和黑土混合基质的育苗钵中，生长55-60d后，即得到移栽苗；
其中，所述混合基质中蛭石与黑土的质量比为2:1。
2.根据权利要求1所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤1.1中柿子皮汁的制备方法如下：将柿子皮捣碎成柿子皮泥，加入相当于柿子皮泥总重量10倍的水，浸泡30min后过滤，滤液即为柿子皮汁。
3.根据权利要求2所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤1.1中得到的不定芽诱导培养基和步骤1.2中得到的生根培养基在接种前均进行灭菌处理。
4.根据权利要求3所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述灭菌处理条件如下：121℃、105kPa下灭菌15min。
5.根据权利要求1所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤2中华肖菝葜植株茎段在质量浓度为70％的乙醇溶液中浸润10-30S，在消毒液中浸泡10-20min。
6.根据权利要求1所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤3.1和步骤3.2中黑暗条件下培养温度均为25±1℃。
7.根据权利要求6所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤3.1和步骤3.2中光照培养条件均为光照强度为2500LX、光照时间为16h/d、温度为25±1℃。
8.根据权利要求1所述的华肖菝葜幼苗组培快繁方法，其特征在于，所述步骤4中选苗高4-6cm、叶2片以上、发根3-4条的无毒苗炼苗。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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