CN113207698B - 一种利用西南远志一步成苗的组培育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药用植物组织培养领域，具体公开一种西南远志一步成苗的组培育苗方法，其步骤包括外植体的选择与清洁、外植体消毒、诱导成苗、驯化，其中外植体诱导培养：将消毒好的外植体用改良MS为基本培养基，添加NAA、TDZ，成苗培养：将诱导出的丛生芽用改良MS培养基，添加NAA，油菜素内脂，TDZ，所述改良MS培养基为将MS培养基中的大量元素中硝酸钾改为1200mg/L、硝酸铵改为1200mg/L、磷酸二氢钾改为210mg/L、硫酸镁改为130mg/L、氯化钙改为150mg/L，同时蔗糖浓度下调至20g/L，其他元素不变，本发明在外植体诱导时产生愈伤，同时又将愈伤再分化成从生芽，减少了培养过程中需经过愈伤组织诱导培养和丛生芽的分化培养，最终减少了生产环节，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物组织培养领域，具体涉及一种西南远志一步成苗的组培育苗方法。
背景技术
西南远志（Polygala crotalarioides Buch.-Ham.）又名西藏远志，娘母良，猪大肠等，为远志科远志属多年生草本植物，生于海拔1100～2300m的山坡草地或灌丛中，国内主要分布于云南北部及西部、四川西南部、西藏南部等地。西南远志以根入药，主要有祛痰止咳，宁心安神的功效，主要用于治疗咳嗽咳痰不爽，心悸，失眠多梦等症。同时该药材为云南佤族民间流传的一种珍奇民族药，有促进性功能亢进、强筋健骨和增进食欲的功效，长期服用能使眉须秀长，有颜容光泽和痣斑消退之效。现代医药药理研究表明，其具有抗疲劳，抗低温，抗缺氧，提高机体应激和对不良环境适应能力等功效。
由于在壮阳方面功效较为明显以及野生资源的消耗，在云南临沧、普洱、西双版纳等地区开始成一定规模的种植，但其大部分种源均来资源野生采挖后人工大田驯化种植，并有少量开始采用种子以及扦插等方式进行繁殖。由于种子数量较少、发芽率低，扦插繁殖成苗率极低等因素，使得种植规模一直较小。近年来部分单位进行了组培苗繁殖技术研究，通过文献查阅，发现其增殖系数低，生产技术繁琐，同时通过对云南地区市场调查发现，仅有少量西南远志组培苗上市，且价格一般在3～5元/株，极大的限制了西南远志种植及深加工产业的发展。
发明内容
本发明根据西南远志发展趋势以及针对现今种苗繁殖技术的不足，提供了一种生产工艺简单、生产成本低廉、能短期内提供充足优质的西南远志种苗繁育技术。
本发明具体是通过以下技术方案实现的：
一种利用西南远志一步成苗的组培育苗方法，其步骤包括外植体的选择与清洁、外植体消毒、诱导成苗、驯化，所述诱导成苗包括以下步骤：
（1）外植体诱导培养：将消毒好的外植体用改良MS为基本培养基，添加NAA、TDZ，在温度25±2 ℃，全黑暗条件下诱导15天；后在温度25±2 ℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养20天；
（2）成苗培养：将诱导出的丛生芽用改良MS培养基，添加NAA，油菜素内脂，TDZ，在温度25±2℃，全黑暗条件下培养7天；后在温度25±2 ℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天；
所述改良MS培养基为将MS培养基中的大量元素中硝酸钾改为1200mg/L、硝酸铵改为1200mg/L、磷酸二氢钾改为210mg/L、硫酸镁改为130mg/L、氯化钙改为150mg/L，同时蔗糖浓度下调至20g/L，其他元素不变。优选的，外植体为健壮、无病虫害西南远志的幼嫩叶片。
优选的，外植体消毒为依次使用75%酒精25～35s、饱和漂白粉溶液20～30min、0.05%升汞溶液10～12min浸泡外植体后，使用无菌水清洗备用。
优选的，诱导培养基的NAA浓度为0.05～0.15mg/L，TDZ浓度为0.8～1.1mg/L。
优选的，NAA浓度为0.3～0.5mg/L，油菜素内脂浓度为1.5～2.5mg/L，TDZ浓度为0.1～0.3mg/L。
本发明有益效果在于
1、较常规消毒方法增加了饱和漂白粉溶液，很大程度的增加了消毒效果，同时将升汞溶液的消毒浓度较常规降半而延长消毒时间，一方面降低了升汞对外植体的伤害，另一方面亦能达到同样的消效果。最终降低了消毒污染率以及消毒死亡率，从而达到高效的外植体无菌苗培养效果，一定程度的降低了组培苗生产成本。
2、本发明在外植体诱导时产生愈伤，同时又将愈伤再分化成从生芽，减少了培养过程中需经过愈伤组织诱导培养和丛生芽的分化培养，最终减少了生产环节，降低了生产成本。
3、本发明将诱导的芽接种到增殖生根培养基中，通过对基本培养基的改良以及植物生长调节剂的有效配比使用，可直接获得健壮的生根苗，减少了组培过程中的壮苗及生根的环节，亦可用其继续进行扩繁，其增殖系数可达23，较现组培技术高近9.0，同时本发明可一步成苗，较现有组培技术简化了生产工艺，缩短了生产周期，最大程度的降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明，本发明中使用的激素TDZ全名为苯基噻二唑基脲（Thidiazuron, TDZ）是一种人工合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物，本发明中使用的MS基均采用表1所示的改良MS培养基大量元素配比，其余的铁盐、有机物、微量元素等浓度均不变。
实施例1
1、外植体的选择与清洁：将选择健壮、无病虫害植株移栽至室内，每天用多菌灵溶液2000倍液喷施叶面1次，7天后取幼嫩叶片，置于肥皂液中清洗20min后用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温-80，震摇10min，最后用自来水冲淋60min。
2、外植体的消毒：将清洁好的幼嫩叶片，转移至超净工作台，用75%酒精消毒30s，无菌水涮洗2次；再用饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3次；最后用0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次。7天消毒污染率为19.9%，15天叶片死亡率为2.7%。
3、外植体的初代诱导：将消毒好的叶片，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉叶柄伤口切面，后在叶片正面用刀片划5～8条伤口，并将其平铺于改良MS+NAA 0.05mg/L+TDZ0.8mg/L的诱导培养基上，在25±2℃温度下暗培养15天，叶片伤口处开始萌动并较多出愈，后在温度为25±2℃，光照强度2000～3000LX，光周期12h条件下光暗交替培养20天可诱导出大量丛生芽，诱导率为99.7%。
4、扩繁：将诱导的丛生芽叶片及愈伤组织切成约0.5cm2，茎段切成约1cm，平铺在改良MS+NAA 0.3mg+油菜素内脂 1.5mg/L+TDZ0.1mg/L，在温度25±2 ℃，黑暗条件下培养7天；后在温度25±2℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天，增殖系数可达22.6，同时苗已全部生根。
5、成苗：将增殖芽的叶片及愈伤组织切成约0.5cm2，茎段切成约1cm，平铺在改良MS+NAA 0.5mg+油菜素内脂 1.5mg/L+TDZ0.1mg/L，在温度25±2 ℃，黑暗条件下培养7天；后在温度25±2℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天，生根率为98.9%，根长2-3厘米，每颗植株均带有3条以上健壮根，且植株健壮鲜绿。
6、驯化：将生根苗带瓶置于75%遮阳率的阳光下晒苗7天，移栽于5：1的泥炭土+珍珠岩中，覆小拱棚，30天后驯化成活率为96.4%。
实施例2
1、外植体的选择与清洁：将选择健壮、无病虫害植株移栽至室内，每天用多菌灵溶液2000倍液喷施叶面1次，7天后取幼嫩叶片，置于肥皂液中清洗25min后用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温-80，震摇12min，最后用自来水冲淋70min。
2、外植体的消毒：将清洁好的幼嫩叶片，转移至超净工作台，用75%酒精消毒35s，无菌水涮洗2次；再用饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗3次；最后用0.05%升汞溶液消毒12min，无菌水涮洗8次。7天消毒污染率为17.8%，15天叶片死亡率为4.1%。
3、外植体的初代诱导：将消毒好的叶片，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉叶柄伤口切面，后在叶片正面用刀片划5～8条伤口，并将其平铺于MS+NAA 0.10mg/L+TDZ 1.1mg/L的诱导培养基上，在25±2 ℃温度下暗培养，15天叶片伤口处开始萌动并较多出愈，后在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，光周期12h条件下光暗交替培养20天可诱导出大量丛生芽，诱导率为99.8%。
4、一步成苗：将丛生芽，叶片及愈伤组织切成约0.5cm2，茎段切成约1cm，平铺在改良MS+NAA0.5mg+油菜素内脂 2.5mg/L+TDZ0.3mg/L，其中MS培养基使用如表1所示的改良大量元素配比，其余的铁盐、有机物、微量元素等浓度均不变，在温度25±2℃，黑暗条件下培养7天；后在温度25±2℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天，生根率为97.5%，且植株健壮鲜绿。
5、驯化：将生根苗带瓶置于75%遮阳率的阳光下晒苗7天，移栽于5：1的泥炭土+珍珠岩中，覆小拱棚，30天后驯化成活率为97.3%。
实施例3
1、外植体的选择与清洁：将选择健壮、无病虫害植株移栽至室内，每天用多菌灵溶液2000倍液喷施叶面1次，7天后取幼嫩叶片，置于肥皂液中清洗25min后用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温-80，震摇12min，最后用自来水冲淋70min。
2、外植体的消毒：将清洁好的幼嫩叶片，转移至超净工作台，用75%酒精消毒35s，无菌水涮洗2次；再用饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗3次；最后用0.05%升汞溶液消毒12min，无菌水涮洗8次。7天消毒污染率为17.8%，15天叶片死亡率为4.1%。
3、外植体的初代诱导：将消毒好的叶片，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉叶柄伤口切面，后在叶片正面用刀片划5～8条伤口，并将其平铺于MS+NAA 0.15mg/L+TDZ 1.0mg/L的诱导培养基上，在25±2 ℃温度下暗培养，15天叶片伤口处开始萌动并较多出愈，后在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，光周期12h条件下光暗交替培养20天可诱导出大量丛生芽，诱导率为98.8%。
4、一步成苗：将丛生芽，叶片及愈伤组织切成约0.5cm2，茎段切成约1cm，平铺在改良MS+NAA0.4mg+油菜素内脂 2.0mg/L+TDZ0.2mg/L，其中MS培养基使用如表1所示的改良大量元素配比，其余的铁盐、有机物、微量元素等浓度均不变，在温度25±2 ℃，黑暗条件下培养7天；后在温度25±2 ℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天，生根率为98.2%，且植株健壮鲜绿。
5、驯化：将生根苗带瓶置于75%遮阳率的阳光下晒苗7天，移栽于5：1的泥炭土+珍珠岩中，覆小拱棚，30天后驯化成活率为96.8%。
Claims (3)
1.一种利用西南远志一步成苗的组培育苗方法，其步骤包括外植体的选择与清洁、外植体消毒、诱导成苗、驯化，其特征在于，所述外植体为健壮、无病虫害西南远志的幼嫩叶片，外植体消毒为依次使用75%酒精25～35s、饱和漂白粉溶液20～30min、0.05%升汞溶液10～12min浸泡外植体后，使用无菌水清洗备用；所述诱导成苗包括以下步骤：
（1）外植体诱导培养：将消毒好的外植体用改良MS为基本培养基，添加NAA、TDZ，在温度25±2 ℃，全黑暗条件下诱导15天；后在温度25±2 ℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养20天；
（2）成苗培养：将诱导出的丛生芽用改良MS培养基，添加NAA，油菜素内脂，TDZ，在温度25±2 ℃，全黑暗条件下培养7天；后在温度25±2 ℃，光照2000-3000LX、光照12小时条件下光暗交替培养30天；
所述改良MS培养基为将MS培养基中的大量元素中硝酸钾改为1200mg/L、硝酸铵改为1200mg/L、磷酸二氢钾改为210mg/L、硫酸镁改为130mg/L、氯化钙改为150mg/L，同时蔗糖浓度下调至20g/L，其他元素不变；
所述步骤（1）中，诱导培养基的NAA浓度为0.05～0.15mg/L，TDZ浓度为0.8～1.1mg/L；
所述步骤（2）中NAA浓度为0.3～0.5mg/L，油菜素内脂浓度为1.5～2.5mg/L，TDZ浓度为0.1～0.3mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种利用西南远志一步成苗的组培育苗方法，其特征在于，所述步骤（2）中还包括扩繁培养，将诱导的丛生芽叶片及愈伤组织使用改良MS+NAA 0.3 mg/L+油菜素内脂 1.5mg/L+TDZ 0.1mg/L进行扩繁培养。
3.根据权利要求1所述的一种利用西南远志一步成苗的组培育苗方法，其特征在于，所述驯化方法为将生根苗带瓶置于75%遮阳率的阳光下晒苗7天，移栽于5：1的泥炭土+珍珠岩中，覆小拱棚，30天后移除小拱棚。
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