CN107667865B - 一种岷江蓝雪花继代快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种岷江蓝雪花继代快繁方法，其包括如下步骤：将经预先组培繁育所得岷江蓝雪花子代的无菌苗，剪成各茎段带一个叶片的外植体，置于无外源激素的培养基中进行扩繁增殖培养；所述无外源激素的添加蔗糖和琼脂的MS培养基；所述预先组培繁育的方法为：取岷江蓝雪花枝条上半部分幼嫩带芽的茎段作为外植体，依次经过腋芽诱导培养、腋芽增殖培养和生根培养。本发明缩短了岷江蓝雪花的繁育生产周期，降低了生产成本。本发明的繁殖系数大、生长迅速，操作简单易行，可随时取材进行无菌快繁。

Description

一种岷江蓝雪花继代快繁方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，涉及岷江蓝雪花快繁技术，具体涉及一种岷江蓝雪花继代快繁方法。
背景技术
岷江蓝雪花(Ceratostigma willomottianum Stapf)是中国特有种，是隶属于白花丹科蓝雪花属的落叶半灌木，又称为紫金莲。作为兼具观赏和药用价值的一种新型园林观赏药用植物，因其清淡雅致的紫色小花、开散的分枝、花序上花团锦簇等特点而备受青睐，或作为盆栽供人观赏，亦或作为庭院绿化苗木广泛使用。此外，其内含有多种植物化学活性成分，是传统的民族用药，长久以来一直被广泛使用。加之，主要存在于其根部的萘醌类化合物白花丹素，因具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、放疗增敏以及避孕等功效而表现出良好的药用前景，逐渐引人关注。
目前，对于岷江蓝雪花的研究相对有限，大多仅停留在初步的培育方面，如硕士学位论文《药用观赏植物岷江蓝雪花地理分布及种子萌发初步研究》和申请号为201110349706.5的中国专利仅仅研究了种子萌发和常规的育苗方法。现有技术对于岷江蓝雪花组织培养技术的研究还相对较少，这可能与对该植物的研究尚未深入有关。
岷江蓝雪花作为一种极具研发潜力的新型花卉，其根部所含的药用活性成分，尤其是白花丹素提取的依赖于以牺牲整个植株为代价，不能满足日益增长的市场供给需求，而繁殖迅速、增殖系数大、生产周期短且不受季节限制的组织培养技术可以有效的解决这一问题。可见，寻求一种快速有效的繁殖方式是迫切而又重要的课题。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种岷江蓝雪花无菌快繁方法，该方法包括如下步骤：
将经预先组培繁育所得岷江蓝雪花子代的无菌苗，剪成各茎段带一个叶片的外植体，置于无外源激素的培养基中进行扩繁增殖培养；所述无外源激素的培养基为添加蔗糖和琼脂的MS培养基；
所述预先组培繁育的方法为：
对岷江蓝雪花盆栽进行杀菌，然后取岷江蓝雪花枝条上半部分幼嫩带芽的茎段作为外植体，对外植体进行消毒，再依次经过腋芽诱导培养、腋芽增殖培养和生根培养；
进行所述腋芽诱导培养时，采用的培养基为添加6-BA和NAA的MS培养基；
进行所述腋芽增殖培养时，采用的培养基为添加6-BA和NAA的MS培养基；
进行所述生根培养时，采用的培养基为添加IBA的1/2MS培养基。
所述岷江蓝雪花子代为经预先组培繁育所得岷江蓝雪花子代第1代至第9代中的任何一代。
本发明发现，通过本发明的预先组培繁育后，进行后续的继代繁育时，不用添加任何激素，便可实现很好的效果，这与适用于其它植物的快繁体系的研究结论是相反的。如在《大花蕙兰组织培养快繁技术》、《不同培养基对大花蕙兰组织培养和快速繁殖的影响》、《大苞鞘石斛组织培养快繁研究》和《高山石斛再生体系的建立》等研究中，所涉及的植物均需要添加相应的外源激素才能诱导生根。
在对岷江蓝雪花子代的无菌苗剪成各茎段带一个叶片的外植体时，所述外植体上的叶片仅保留其1/3部分。
作为优选方案，进行所述腋芽诱导培养时，将进行消毒后所得外植体剪成1.5～2cm长小段，每个小段上保留1～2个叶芽；并将其接种在添加1.0mg·L-16-BA和0.1mg·L- 1NAA的MS培养基上，进行腋芽诱导培养。
作为优选方案，进行所述腋芽增殖培养时，将诱导出的1～2cm长腋芽转接至添加2.0mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA的MS增殖培养基上，进行腋芽增殖培养。
作为优选方案，进行所述生根培养时，选取茎长2.0cm以上的健壮无根单苗接种至添加0.5mg·L-1的IBA的1/2MS培养基上进行生根培养。
作为本发明可选的一个方案，进行所述杀菌时，采用的方法为：取材开始前的一个月，每周对岷江蓝雪花盆栽进行一次多菌灵400倍叶面喷施和浇灌，共计4次。
作为本发明优选的一个方案，进行所述消毒时，采用的方法为：用流水清除表面多余杂质和污垢后，用洗洁精浸泡30min，随后用毛刷轻轻刷去其表面已被软化的顽固杂质，最后用温和的流水冲洗2～3h，自然沥干；之后在超净工作台上使用75％的乙醇处理30s，接着用无菌水冲洗3～4次，然后用0.1％的升汞进行连续两次4min的消毒。
作为本发明的一个优选方案，所述无外源激素的培养基中添加30g·L-1蔗糖、6g·L-1琼脂，pH为5.8。
进行所述扩繁增殖培养时，培养条件为：培养温度20～28℃，光照度1500～2500Lx，光照时间8～12h/d。
本发明的有益效果：
本发明缩短了岷江蓝雪花的繁育生产周期，降低了生产成本。本发明的繁殖系数大、生长迅速，可随时取材进行无菌快繁。
附图说明
图1为岷江蓝雪花原材料；
图2为岷江蓝雪花预先组培繁育时腋芽诱导的结果图；
图3为岷江蓝雪花预先组培繁育时腋芽增殖培养的结果图；
图4为岷江蓝雪花预先组培繁育时生根培养的结果图；
图5为岷江蓝雪花在无激素MS培养基上扩繁增殖培养的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
外植体的体外杀菌和消毒：用400倍多菌灵每周喷施和浇灌岷江蓝雪花实生播种苗盆栽一次(共计四次)。于晴朗上午9～10点选取当年生优良健壮、无病虫害岷江蓝雪花母株枝条的上半部分幼嫩带芽茎段，稍留叶柄去叶片并剪成3～5cm小段，在温和的流水下用毛刷轻轻刷去其表面多余杂质和污垢后，用洗洁精浸泡30min，随后用毛刷轻轻刷去其表面已被软化的顽固杂质，最后用温和的流水冲洗2～3h，自然沥干。完成以上步骤后，在超净工作台上使用75％的乙醇处理30s，接着用无菌水冲洗3～4次，处理完后，用0.1％的升汞连续两次进行(4+4)min的消毒。用大量无菌水温和地冲洗5～6次后接种。上述操作简单方便，步骤科学合理，消毒剂易获得，所用浓度及处理时间，既有很好的消毒效果，又对外植体不会造成太大伤害，可进一步降低实验污染率而保证成活率。
腋芽诱导：用无菌滤纸吸干外植体表面残余水分，剪成1.5～2cm长小段，每个小段上保留1～2个叶芽，并将其接种在腋芽诱导培养基上，拟选6-BA和NAA按表1进行随机处理，各处理重复3次。最佳腋芽诱导培养基组合配方为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1。
腋芽增殖：将诱导出的1～2cm长腋芽转接至增殖培养基，拟选6-BA和NAA按表2进行随机处理，各处理重复3次。最佳增殖培养基组合配方为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，诱导率在82％以上。
生根培养：选取茎长2.0cm以上的健壮无根单苗接种至生根诱导培养基上，拟选IBA按表3进行随机处理，各处理重复3次。最佳生根培养组合配方为1/2MS+IBA0.5mg·L-1，生根率94％以上。
扩繁增殖培养：将获得的8cm左右高的无菌苗，剪成各茎段带一个叶片(叶片保留1/3)的外植体，接种在无激素的MS培养基上进行扩繁增殖培养。生长状况良好，且生根率100％。
在本发明中，进行扩繁增殖培养时，培养周期约20天左右。在培养期中，岷江蓝雪花的生长情况良好，自主生根。目前，已经良好的扩繁至第9代，生长和生根情况均没有出现下降趋势。
若无特别说明，培养基添加30g·L-1蔗糖、6g·L-1琼脂，pH为5.8。培养温度为20-28℃，光照度为1500-2500Lx，光照时间为8-12h/d。培养30d统计诱导率、增殖率和生长情况。
表1岷江蓝雪花预先组培繁育腋芽诱导的激素筛选
表2岷江蓝雪花预先组培繁育腋芽增殖的激素筛选
表3岷江蓝雪花预先组培繁育生根培养的激素筛选
注：+++表示生长情况良好，++表示生长情况一般，+表示生长情况较差。

Claims (10)

1.一种岷江蓝雪花继代快繁方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将经预先组培繁育所得岷江蓝雪花子代的无菌苗，剪成各茎段带一个叶片的外植体，置于无外源激素的培养基中进行扩繁增殖培养；所述无外源激素的培养基为添加蔗糖和琼脂的MS培养基；
所述预先组培繁育的方法为：
对岷江蓝雪花盆栽进行杀菌，然后取岷江蓝雪花枝条上半部分幼嫩带芽的茎段作为外植体，对外植体进行消毒，再依次经过腋芽诱导培养、腋芽增殖培养和生根培养；
进行所述腋芽诱导培养时，采用的培养基为添加6-BA和NAA的MS培养基；
进行所述腋芽增殖培养时，采用的培养基为添加6-BA和NAA的MS培养基；
进行所述生根培养时，采用的培养基为添加IBA的1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岷江蓝雪花子代为经预先组培繁育所得岷江蓝雪花子代第1代至第9代中的任何一代。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对岷江蓝雪花子代的无菌苗剪成各茎段带一个叶片的外植体时，外植体上的叶片仅保留其1/3部分。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述腋芽诱导培养时，将进行消毒后所得外植体剪成1.5～2cm长小段，每个小段上保留1～2个叶芽；并将其接种在添加1.0mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA的MS培养基上，进行腋芽诱导培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述腋芽增殖培养时，将诱导出的1～2cm长腋芽转接至添加2.0mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA的MS增殖培养基上，进行腋芽增殖培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述生根培养时，选取茎长2.0cm以上的健壮无根单苗接种至添加0.5mg·L-1IBA的1/2MS培养基上进行生根培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述杀菌时，采用的方法为：取材开始前的一个月，每周对岷江蓝雪花盆栽进行一次多菌灵400倍叶面喷施和浇灌，共计4次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述消毒时，采用的方法为：用流水清除表面多余杂质和污垢后，用洗洁精浸泡30min，随后用毛刷轻轻刷去其表面已被软化的顽固杂质，最后用温和的流水冲洗2～3h，自然沥干；之后在超净工作台上使用75％的乙醇处理30s，接着用无菌水冲洗3～4次，然后用0.1％的升汞进行连续两次4min的消毒。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无外源激素的培养基中添加30g·L-1蔗糖、6g·L-1琼脂，pH为5.8。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述扩繁增殖培养时，培养条件为：培养温度20～28℃，光照度1500～2500Lx，光照时间8～12h/d。
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