CN109988815A - 一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，剪取在正常自然环境下生长的处于孕穗期的水稻主分蘖，转移至人工气候室内的特定接种装置中，利用嵌入法接种水稻纹枯病菌，根据接种后7天病斑在叶鞘上扩展的相对长度，鉴定水稻的纹枯病抗性。与田间成株期接种鉴定方法和苗期温室接种鉴定方法相比，本发明解决了不同品种因生育期或农艺性状不同而难以获得可靠抗病表型的问题，同时具有高通量和操作简单的特点，可用于快速评定不同地域来源的大规模水稻自然品种或种质的纹枯病抗性水平。与离体叶片接种法相比，本方法接种成功率达100%，茎秆可较长时间存活，使品种抗、感表型差异最大化，更有利于普通技术人员判断水稻对纹枯病的抗性。

Description

一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法

技术领域

本发明属于植物抗病鉴定技术领域，具体地说属于一种鉴定水稻对纹枯病抗性的方法。

背景技术

水稻纹枯病是由土传真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的(Wamish等,Frontiers of Agriculture in China,2007,1(4):361-367.)。自然界中，R.solani以菌核形式在土壤里存活。春季溶田时，菌核漂浮在水面并接触到水稻植株基部。菌核萌发形成菌丝，沿着水稻叶鞘移动，并在营养生长之后侵染叶鞘(ref)。由于半矮杆水稻品种的大规模种植和秸秆全量还田、密植高肥等栽培技术的推广，纹枯病的发生日趋加重，每年均造成严重的产量损失(Jia et al.,Methods in Molecular Biology,2013,956(956):257.)。目前，纹枯病已成为世界范围内最具破坏性的水稻病害之一(廖皓年等,广西植保,1997(3):35-38.)。培育和推广抗纹枯病品种是水稻纹枯病防治的重要途径，但是这需要正确评定现有种质资源的抗感病表型，并鉴定其中的数量抗病基因，从而将其运用于育种工作(陈宗祥等，中国水稻科学，2000，12(1)：15-18)。

目前，水稻纹枯病抗性鉴定采用的方法主要有大田成株期鉴定法，温室苗期鉴定法和离体叶片鉴定法等(潘学彪等.水稻抗纹枯病主效QTL_s的分子标记研究[J].扬州大学学报(自然科学版),1998(01):18.；王子斌等.水稻抗纹枯病苗期快速鉴定技术研究[J].植物病理学报,2009,39(02):174-182.；马晨燕等.水稻离体叶片抗纹枯病接种方法的研究[J].浙江农业学报,2016,28(10):1730-1737.)。

大田成株期鉴定法：该方法最早由潘学彪等提出，进而由左示敏等(左示敏等.田间水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立与完善[J].扬州大学学报,2006(04):57-61+111.)进行了进一步完善与标准化，该方法的核心是在田间对不同水稻品种的纹枯病抗性表型进行鉴定，具体为在田间水稻分蘖后期用嵌入法，撒施法等进行纹枯病菌接种，抽穗后30天调查病级(根据病斑垂直扩展的程度进行分级)进行抗病性鉴定。该方法的优点是接种鉴定过程就在是自然环境下进行的，符合实际需求，是目前应用最广的方法。但是，该方法的最大缺点是鉴定结果易受气候条件和生育期的影响，导致结果准确性不高。例如：接种后的气温过低或过高、雨水过多或过少等都会影响田间温湿度，进而影响病情发展和最终的表型评定；在生育期上，一般抽穗前后20天是水稻最感纹枯病的生育阶段，此阶段如果恰巧与最适病原菌侵染的气候条件相重叠，植株的发病程度就会明显加重，相反，如果因生育期长短不同而导致其易感阶段避开最适病原菌侵染的气候阶段，则植株的发病程度会明显减轻，造成最终的抗性表型不够真实。因此，对于生育期差异较大的全国各地来源的水稻自然品种或种质而言，田间鉴定很难进行，另外，田间鉴定往往都需要多年多点鉴定，工作量大、周期长。

温室苗期鉴定法：温室播种的水稻长到4叶1心期时，将接种物贴在基部，接种7天后调查病斑垂直扩展长度，比较不同品种间的差异进行抗病性评定。温室苗期鉴定相对大田成株期鉴定的优点是操作方便、周期短、有一定通量，温湿度的环境控制总体较易。但是，该方法的最大缺点是，苗期抗性鉴定结果并不能完全反映成株期抗性鉴定结果，这也是该方法目前应用比较少的重要原因；另外，苗期鉴定易受苗期植株农艺性状的影响，如苗期生长较快、株高较高等品种，往往会表现出抗性强于生长慢和相对矮小的品种。

离体叶片鉴定法：在田间水稻分蘖期，选取叶色浓绿，无病虫害，生长健壮的分蘖上完全展开的倒1叶或倒2叶。剪取叶片中间长4-5cm的片段，铺在含有苯并咪唑(0.0001g.mL-1)的水琼脂培养基(0.005g.mL-1agar)上。用打孔器取直径7mm带菌丝的PDA琼脂块置于离体叶片的中部，带菌丝的一面紧贴叶片背轴面。28℃培养72h后，利用扫描仪获取离体叶片图像，再使用Photoshop软件对病斑面积进行像素换算，计算相对病斑面积作为衡量病害程度的指标。离体方法具有快捷方便和易于重复的优点。然而离体叶片实验周期短，实验材料的生物量小，难以区分抗感差异较小的中感品种和感病品种，只能用于筛选抗性水平较高的水稻材料。

综上所述，传统活体方法难以对生育性状、农艺性状差异较大的品种展开鉴定，以及离体叶片法精度低等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，以实现可在人工环境条件下具有较高通量、且结果相对可靠的鉴定水稻纹枯病抗性，可简便、快速鉴定纹枯病抗性。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案是在田间正常生长状态下的水稻孕穗期，剪取具有完整的倒2叶叶鞘的分蘖茎秆，转移至人工气候室内本方案设计的接种装置中，用嵌入法进行纹枯病菌接种。接种7天后调查发病情况，依据叶鞘上病斑扩展的相对长度鉴定水稻的纹枯病抗性。本发明采用的具体技术方案如下。

一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，在水稻孕穗期从田间稻株中剪取主茎分蘖；

步骤二，在稳定可控的环境内培养；

步骤三，用嵌入法进行水稻纹枯病菌接种；

步骤四，接种后第7天测量茎秆长度和病斑长度，以相对病斑长度评价水稻对纹枯病的抗性。

所述的步骤一在水稻孕穗期从田间稻株中剪取主茎分蘖是指：在大田正常生长条件下生长到孕穗期的水稻，健康无病虫害、叶鞘表面光洁无斑痕；在傍晚选取长短一致的具有完全倒二叶叶鞘的分蘖茎秆，从倒二叶叶鞘的茎节下部约1cm剪断，茎秆的创口在接种完毕前不能连续暴露于空气中超过10分钟。

所述的步骤二在稳定可控的环境内培养具体为：由人工气候室提供可控的温光条件，由以下装置组成接种环境：

接种架包括铝合金型材框架、托盘和聚酯薄膜；框架由横截面20mm*20mm的铝合金柱拼接组成，所述框架的长*宽*高＝800*400*800，单位mm；托盘的长*宽*高＝925*625*140,单位mm；框架的侧面及顶面覆以聚酯薄膜并固定、无需密封，而后放置于托盘内，托盘内水深7cm；

接种盒包括塑料盒、试管架、花泥和营养液；接种盒的长*宽*高＝340*270*130，单位mm；试管架孔径15mm，有单排10孔和三排30孔两种规格；花泥为花鸟市场上用于插花的商品花泥，使用前要浸水泡透；营养液按国际水稻所配方配置；

加湿器包括亚克力容器、风扇和超声波雾化器；其它还包括定时开关、12V电源和电线。

所述的步骤三用嵌入法进行水稻纹枯病菌接种具体为：

选择步骤一所获得的孕穗期长势一致的健康茎秆，去除叶片，保留倒二叶叶鞘和茎节，茎节浸水并放置于步骤二所描述的可控环境内培养24小时；插入塞有塑料花泥的试管架中，用镊子将培养好的带菌木质短棒插入叶鞘内1cm处，并确保接种后叶鞘的抱茎状态不变，将试管架放入接种盒中，盒中盛有营养液，淹没茎节，将接种盒放在铝合金型材框架内，整个接种培养装置位于盛水的托盘内，通过加湿器和覆盖聚酯薄膜以保温，温度为26-32℃，相对湿度为75-95％。

所述的步骤四具体为：在接种后第7天傍晚测量最高叶枕至最低茎节之间的长度作为茎秆长度，测量茎秆上的病斑最高点至最低点间长度作为病斑长度；以相对病斑长度的大小判断该水稻品种对纹枯病抗性的强弱；相对病斑长度大于0，小于等于0.3为高抗品种；相对病斑长度大于0.3，小于等于0.5为中抗品种；相对病斑长度大于0.5，小于等于0.7为中感品种；相对病斑长度大于0.7，小于等于1为高感品种。

所述的嵌入法使用的接种物为带菌木质短棒，包括以下过程：

过程一，活化。取出纹枯病菌株，用挑针从斜面中挑取一块菌块于新的斜面培养基中，时间为48-60h，温度为28℃；

过程二，扩繁。从活化的斜面中挑取一块菌块到PDA培养基中央，用湿纱布包好，倒置培养皿，时间为48h，温度为28℃；

过程三，接种物培养。挑选50根大小一致的木质短棒放入直径6cm的玻璃培养皿中，所述木质短棒长*宽*高＝8*2*1，单位mm；121℃环境下湿热灭菌20min；向灭菌后的培养皿内缓缓倒入PDB培养液直至浸没木质短棒；用打孔器在过程二扩繁的培养基中取直径7mm的菌块，放置在玻璃培养皿中央；用灭菌的湿纱布盖好保湿，28℃下培养2-3天后即可作为接种物。

判断水稻纹枯病抗性鉴定方法体系的优劣的主要技术指标有：水稻纹枯病受环境影响很大，能否保障稳定的温湿度；接种鉴定时水稻的生育期是否一致，孕穗期抗性更能反应水稻植株抗病稳产的能力；纹枯病菌接种方法的易操作性、通量；调查标准是否科学可靠，尽量避免主观性误差；是否环境友好。

本发明具有有益效果。对比传统的大田成株期鉴定法，温室苗期鉴定法和离体叶片鉴定法，和本发明在上述5个技术指标方面的差异，本发明具有以下优势和积极效果。

1.大田成株期鉴定易受环境温度和湿度的影响；人工环境下多采用薄膜密封，通过被动的水分蒸腾来维持高湿。本发明装置在人工气候室内保障适宜温度，由加湿器保障湿度，无需薄膜封闭来保湿，日间温湿度分别维持在26-32℃和75-95％，夜间温湿度分别维持在29℃和95％，避免了传统的薄膜覆盖保湿导致的日间高温问题，提高了稳定性和一致性；

2.由于自然群体往往生育期差异较大，大田接种会导致生育期偏短或偏长的水稻品种在孕穗期错过最佳发病的环境条件，这导致无法获得准确的抗感表型。本发明的采用的纹枯病菌主要在成株期危害水稻叶鞘，大田水稻进入孕穗期即可获取茎秆进行离体实验，这不仅统一了接种时期，而且茎秆上的叶鞘比叶片更能反应品种的真实抗性；

3.相比于大田和温室接种，本发明方法较简便，既不需要田间高强度的接种工作，也无需温室培苗，且接种箱内的小空间比温室大空间更容易精准调控温湿度。傍晚采集大田水稻茎秆，田间工作少，同时接种箱占地面积小，一个箱子最多可同时收纳200根茎秆，平均8天就可完成从接种到鉴定，通量高。

4.田间环境变化多端，误差较大，所以大田鉴定多采用病级划分病情。离体叶片一般采用病斑长度或面积作为病情指标，然而离体叶片容易衰老黄化，病斑判定相对困难。本发明使用离体茎秆在营养液中培养，下部茎节生长出新根，叶鞘持绿，病斑边界清晰易观察，使用相对病斑长度表征病情，精度高。

5.本方法在气候室内无土实验，相对大田和温室安全，避免将病原菌释放到自然界中。

附图说明

图1：本发明接种架

图2：本发明试管架

图3：本发明加湿器

图4：接种架内24小时的温度和相对湿度变化曲线图

图5A：离体茎秆接种的绝对与相对病斑长度间的相关性分析

图5B：田间成株期接种病级与离体茎秆的绝对病斑长度的相关性分析

图5C：田间成株期接种病级与离体茎秆的相对病斑长度的相关性分析

图中：1.铝合金型材框架；2.聚酯薄膜；3.托盘；4.亚克力容器；5.风扇；6.超声波雾化器

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明。

本发明所用到的接种架如图1所示，包括铝合金型材框架、托盘和聚酯薄膜；试管架如图2所示；加湿器如图3所示，包括亚克力容器、风扇和超声波雾化器。水稻材料

所用水稻品种分别为YSBR1、Lemont、徐稻3号、泰粳394、Ming Hui、Shinriki、Taipei 309、盐丰2号、连粳6号、武陵粳1号、成农水晶、香丝苗2号、雅京11短粒、中旱221、扬稻3号、扬稻4号、满仓515、水晶3号、云粳9号、扬育粳3号、镇稻14号、J85。其中，YSBR1是较为抗病的品种，Lemont是感病品种。

大田水稻种植

所有水稻植株于2018年5-9月在扬州大学农学院实验农场种植。每个水稻品种分为三重复，每重复为3行区，分别种植在不同田块，其中两个重复用于田间纹枯病病级鉴定，一个重复用于成株期离体茎秆鉴定。试验材料均于5月7日左右播种，6月5日左右移栽，7月中下旬至8月中旬进行田间成株期接种和离体茎秆接种。

病原菌菌株

纹枯病菌是从江苏水稻纹枯病病株中分离得到的中强致病菌株YN-7。

纹枯病菌的培养

(1)培养基的配制

PDB培养液：以1L蒸馏水溶解24克马铃薯葡萄糖肉汤粉末，121℃高压灭菌。

PDA培养基：以1L蒸馏水溶解24克马铃薯葡萄糖肉汤粉末和20克琼脂粉，121℃高压灭菌。

(2)接种物的培养

a)活化培养：将纹枯病菌株用接种针挑到PDA培养基上，28℃下倒置培养2-3天，待培养基表面长满白色菌丝后拿出。

b)扩大培养：将活化培养的菌块接种到PDA培养基中，28℃下倒置培养2-3天，待白色菌丝铺满培养皿后，备用。

c)准备接种物：挑选50根大小一致的长8mm，宽2mm，高1mm的木质短棒放入直径6cm的玻璃培养皿中，121℃环境下湿热灭菌20min。向灭菌后的培养皿内缓缓倒入PDB培养液直至浸没木质短棒。用打孔器在培养皿相同半径处取7mm的菌块，放置在培养皿中央，与排布好的木质短棒距离大致相近。用灭菌的湿纱布盖好，28℃下培养2-3天后即可作为接种物用于试验。

接种及调查方法

(1)田间成株期纹枯病抗性鉴定

在水稻分蘖末期进行接种。每份材料种植3行，前后两行为保护行，中间一行为接种行，每行种12株，接种时接中间10株，每株接种3个茎秆(包括主茎杆和两个较大的分蘖)，共2重复。每茎秆以镊子将接种物嵌入自上而下第3叶鞘内侧，并确保接种后叶鞘处于抱茎状态不变。记录各供试材料的抽穗期，在各材料抽穗后30天调查病级。以左示敏等(左示敏等.田间水稻纹枯病抗性鉴定体系的确立与完善[J].扬州大学学报,2006(04):57-61+111.)改进优化的0-9级病级评价记录病级，如表1所示。

表1改进后的纹枯病病级评价标准

(2)成株期离体茎秆接种

每种材料选择孕穗期长势一致的健康茎秆，去除叶片，保留倒二叶鞘和茎节，插入塞有塑料花泥的试管架中。用镊子将培养好的带菌木质短棒插入叶鞘内1cm处，并确保接种后叶鞘处于抱茎状态不变。将试管架放入接种盒中，盒中盛有营养液，淹没茎节。将接种盒放在铝合金型材框架内，整个接种培养装置位于盛水的托盘内，通过超声波雾化器和风扇以及覆盖聚酯薄膜保温保湿(温度：26-32℃，湿度：75-95％，图1)，接种7天后调查病斑长度。平均病斑长度使用了两种计量方式：绝对病斑长度是茎秆表面病斑最高点至最低点间的长度，相对病斑长度＝绝对病斑长度/茎秆长度。

接种架内24小时的温度和相对湿度变化曲线图如图4所示，温度变化范围26-32℃，相对湿度变化范围75-95％。

数据统计分析

用Excel2016软件统计所有参测的水稻品种调查结果的平均数，并对病级和绝对/相对病斑长度做相关性分析。

结果与分析

为了验证离体茎秆接种法的可行性，选取18份地方品种同时进行田间成株期和离体茎秆纹枯病接种鉴定。表2列出这些地方品种田间调查的病级数据和离体茎秆的绝对/相对病斑长度数据。在所试18份地方品种中，没有高抗品种(相对病斑长度大于0，小于等于0.3)，2份中抗品种(相对病斑长度大于0.3，小于等于0.5)，7份中感品种(相对病斑长度大于0.5，小于等于0.7)，9份高感品种(相对病斑长度大于0.7，小于等于1)。相关性分析显示供试材料产生的纹枯病病斑的绝对长度和相对长度间决定系数为0.89，说明我们保证品种内所有参测茎秆长势一致，消除因茎秆长度的差异而导致调查结果的偏差，如表2所示。

表2 2017年18个地方品种的田间和离体茎秆接种结果

目前，田间表型鉴定和0-9级病级标准是目前最为可靠的纹枯病抗性鉴定体系。通过对田间病级和离体茎秆的病斑长度做相关性分析，发现无论绝对病斑长度还是相对病斑长度，与病级相比都是线性正相关，由此说明成株期温室离体茎秆接种方法可应用于水稻抗纹枯病的育种工作中。

本发明的田间成株期与离体茎秆接种鉴定数据间的相关性分析结果如图5A、图5B和图5C所示，其中：图5A为离体茎秆接种的绝对与相对病斑长度间的相关性分析结果；图5B为田间成株期接种病级与离体茎秆的绝对病斑长度的相关性分析结果；图5C为田间成株期接种病级与离体茎秆的相对病斑长度的相关性分析结果。绝对病斑长度是指每个参测品种的病斑长度的均值(mm)；相对病斑长度是每个品种的病斑长度/茎秆长度比值的均值。

Claims (6)

1.一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，在水稻孕穗期从田间稻株中剪取主茎分蘖；

步骤二，在稳定可控的环境内培养；

步骤三，用嵌入法进行水稻纹枯病菌接种；

步骤四，接种后第7天测量茎秆长度和病斑长度，以相对病斑长度评价水稻对纹枯病的抗性。

2.根据权利要求1所述的一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法其特征在于所述的步骤一在水稻孕穗期从田间稻株中剪取主茎分蘖是指：在大田正常生长条件下生长到孕穗期的水稻，健康无病虫害、叶鞘表面光洁无斑痕；在傍晚选取长短一致的具有完全倒二叶叶鞘的分蘖茎秆，从倒二叶叶鞘的茎节下部约1cm剪断，茎秆的创口在接种完毕前连续暴露于空气中时间小于10分钟。

3.根据权利要求1所述的一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的步骤二在稳定可控的环境内培养具体为：由人工气候室提供可控的温光条件，由以下装置组成接种环境：

接种架包括铝合金型材框架、托盘和聚酯薄膜；框架由横截面20mm*20mm的铝合金柱拼接组成，所述框架的长*宽*高＝800*400*800，单位mm；托盘的长*宽*高＝925*625*140,单位mm；框架的侧面及顶面覆以聚酯薄膜并固定、无需密封，而后放置于托盘内，托盘内水深7cm；

接种盒包括塑料盒、试管架、花泥和营养液；接种盒的长*宽*高＝340*270*130，单位mm；试管架孔径15mm，有单排10孔和三排30孔两种规格；花泥为花鸟市场上用于插花的商品花泥，使用前要浸水泡透；营养液按国际水稻所配方配置；

加湿器包括亚克力容器、风扇和超声波雾化器；其它还包括定时开关、12V电源和电线。

4.根据权利要求1所述的一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的步骤三用嵌入法进行水稻纹枯病菌接种具体为：

选择步骤一所获得的孕穗期长势一致的健康茎秆，去除叶片，保留倒二叶叶鞘和茎节，茎节浸水并放置于步骤二所描述的可控环境内培养24小时；插入塞有塑料花泥的试管架中，用镊子将培养好的带菌木质短棒插入叶鞘内1cm处，并确保接种后叶鞘的抱茎状态不变，将试管架放入接种盒中，盒中盛有营养液，淹没茎节，将接种盒放在铝合金型材框架内，整个接种培养装置位于盛水的托盘内，通过加湿器和覆盖聚酯薄膜以保温，温度为26-32℃，相对湿度为75-95％。

5.根据权利要求1所述的一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征是：所述的步骤四具体为：在接种后第7天傍晚测量最高叶枕至最低茎节之间的长度作为茎秆长度，测量茎秆上的病斑最高点至最低点间长度作为病斑长度；以相对病斑长度的大小判断该水稻品种对纹枯病抗性的强弱；相对病斑长度大于0，小于等于0.3为高抗品种；相对病斑长度大于0.3，小于等于0.5为中抗品种；相对病斑长度大于0.5，小于等于0.7为中感品种；相对病斑长度大于0.7，小于等于1为高感品种。

6.根据权利要求4所述的一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的嵌入法使用的接种物为带菌木质短棒，包括以下过程：

过程一，活化

取出纹枯病菌株，用挑针从斜面中挑取一块菌块于新的斜面培养基中，时间为48-60h，温度为28℃；

过程二，扩繁

从活化的斜面中挑取一块菌块到PDA培养基中央，用湿纱布包好，倒置培养皿，时间为48h，温度为28℃；

过程三，接种物培养

挑选50根大小一致的木质短棒放入直径6cm的玻璃培养皿中，所述木质短棒长*宽*高＝8*2*1，单位mm；121℃环境下湿热灭菌20min；向灭菌后的培养皿内缓缓倒入PDB培养液直至浸没木质短棒；用打孔器在过程二扩繁的培养基中取直径7mm的菌块，放置在玻璃培养皿中央；用灭菌的湿纱布盖好保湿，28℃下培养2-3天后即可作为接种物。