CN113079854A - 一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，属于植物抗病鉴定技术领域，包括以下步骤：S1、菌种准备：将纹枯病菌株放置在PDA(土豆葡萄糖琼脂)培养基，其中添加0.005％(W/V)四环素，活化培养3‑5天，获得菌丝，待用；S2、扩大培养：将配置好的PDA培养基灭菌后，在超净工台中倒入塑料培养皿，凝固待用，然后将菌丝饼接种至PDA培养基中心，待其表面长满菌丝后，待用；S3、待鉴定水稻材料的准备：挑选待鉴定材料和抗感对照品种的饱满种子浸种催芽，待种子破胸露白；S4、将催芽后的种子播于育秧盘，2叶1心期进行间苗；S5、准备接种鉴定平台；S6、3‑4叶期接种；S7、当80％感病对照品种Lemont的病斑生长高度/株高相对值达到1，鉴定纹枯病抗性。

Description

一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法
技术领域
本发明属于植物抗病鉴定技术领域，具体涉及一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法。
背景技术
纹枯病(Sheathblight)，也称“花脚病”，由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引发的水稻三大主要世界性病害之一，严重影响水稻的产量和品质(桑海旭，等.水稻纹枯病对水稻产量及米质的影响.北方水稻，2012,43(1):10-13)。随着高产、矮秆、多蘖、耐肥品种的应用推广，种植密度提高以及施氮量增加，水稻纹枯病的危害日趋严重。该病发生面积广，危害程度高，已上升为我国南方稻区的第一大病害(张偕正，等.我国南方稻区水稻骨干亲本纹枯病抗性鉴定与分析.植物保护，2008,34(1):45-48)，一般造成水稻产量损失10％-30％，严重时可达50％。据统计，2006、2007年，纹枯病导致我国水稻分别损失109.66万吨和109.27万吨(曾宇翔，等.水稻纹枯病抗性基因定位及抗性资源发掘的研究进展.中国水稻科学，2010,24(5):544-550)。因此，挖掘水稻纹枯病抗性基因，培育抗纹枯病新品种是水稻纹枯防治的最环保有效途径，是水稻抗纹枯病遗传育种和分子生物学领域持续关注的热点。
培育并推广应用抗纹枯病品种是水稻纹枯病防治的重要途径，但是前提是需要正确精准评价现有水稻种质的纹枯病抗感表型，并鉴定其中的数量抗性基因，从而将其应用于纹枯病抗性育种中(曾宇翔，等.水稻纹枯病抗性基因定位及抗性资源发掘的研究进展.中国水稻科学，2010,24(5):544-550)。目前供研究利用的水稻抗纹枯病材料主要是少数抗性较高的种质或品种，如Jasmine 85、特青、Tetep、LSBR-5、LSBR-33、YSBR1和窄叶青8号等(王玲，等.对中国南方部分籼型杂交水稻纹枯病抗性的评价.作物学报，2011,37(2):263-270；左示敏，等.水稻不同类群品种间的纹枯病抗性评价和抗病新种质筛选.植物病理学报，2014,44(6):658-670)，抗性水稻种质十分有限。水稻对纹枯病的抗性受多基因控制，导致仅依赖少数抗病品系难以培育优异的抗病新品种(Zuo S M,et al.Comparison andconfirmation of quantitative trait loci conferring partial resistance to ricesheath blight on chromosome 9.Plant Disease,2014,98(7):957-964)，应进一步加强资源的搜集与鉴定。
水稻纹枯病是一种土传真菌病害，病原菌寄主广泛，容易受到环境影响。因此建立快捷高效稳定的水稻纹枯病评价体系对纹枯病抗病育种和分子遗传研究至关重要。目前有关水稻纹枯病抗性筛选及评价，主要采用雾室法(Correa-Victoria F,et al.Sheathblight screening of two breeding populations at CIAT.Rice CAPNews,2007,3(8):2-5)、微室法(JiaYL,et al.Rapid determination of rice cultivar responses to thesheath blight pathogen Rhizoctonia solani using a micro-chamber screeningmethod.Plant Disease,2007,91:485-489；徐国娟，等.水稻苗期纹枯病抗性鉴定微室接种技术的改良.中国水稻科学,2015,29(1):97-105.)、菌碟套入法(房舒，等.水稻苗期纹枯病菌人工接种方法研究.江苏农业科学，2009,4:146-147)、快速鉴定法(王艳丽，等.一种水稻纹枯病抗性苗期鉴定的方法.中国发明专利，CN200910153517.3)、离体叶片鉴定法(马晨燕，等.水稻离体叶片抗纹枯病接种方法的研究[J].浙江农业学报，2016,28(10):1730-1737；杨晓贺，等.东北地区水稻种质资源抗纹枯病研究初报.植物保护，2020,46(6):205-208)、离体茎秆鉴定法(左示敏，等.一种利用水稻离体茎秆鉴定纹枯病抗性的方法.中国发明专利，CN201910312932.2)，成株期温室接种鉴定方法(Park D S,et al.Amethod forinoculation and evaluation ofrice sheathblight disease.Plant Disease,2008,92:25-29)以及苗期、成株期鉴定相结合(王子斌，等.水稻抗纹枯病苗期快速鉴定技术研究[J].植物病理学报，2009,39(2):174-182)等等。相应地，也提出相对病斑高度的0-9级标准、病斑大小和数目等作为主要的水稻苗期筛选指标，而“叶鞘位”的0-9级标准及相对病斑面积标准等作为成株期鉴定指标(左示敏，等.水稻抗纹枯病遗传育种研究进展.中国科学:生命科学，2010,40(11):1014-1023)。上述鉴定方法各有优缺点，如成株期抗性鉴定受环境因素影响大，评价系统不稳定等问题；离体鉴定法和嵌入法牙签接菌，在实际的操作过程中，过于繁琐，而且容易损伤植株；而微室法在大量鉴定时则占用空间大。综上，目前接种环境不太稳定，接种时水稻苗龄及接种方法等水稻抗纹枯病筛选及评价体系尚无统一，且实验数据的可重复性不高，很大程度上阻碍了抗纹枯病基因的充分发掘与利用。可见，适宜的鉴定时期、方法及评价指标是纹枯病表型鉴定成败的重要因素。因此，有必要开发、建立一套高效快捷、精准稳定和高通量的水稻纹枯病抗性苗期鉴定体系，在环境可控条件下，用合适的接种方法、较为科学的病情评价标准评价水稻品种的抗性差异，为水稻纹枯病抗病育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，解决现有技术中成株期抗性鉴定受环境因素影响大，评价系统不稳定等问题；离体鉴定法和嵌入法牙签接菌，在实际的操作过程中，过于繁琐，而且容易损伤植株；而微室法在大量鉴定时则占用空间大的技术问题。
本发明公开了一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，包括以下步骤：
S1、菌种准备：将纹枯病菌株放置在PDA[土豆葡萄糖琼脂+0.005％浓度(W/V)四环素]培养基，活化培养3-5天，获得菌丝，待用；
S2、扩大培养：将配置好的PDA(四环素土豆葡萄糖琼脂)培养基灭菌后，培养基凝固前在超净工倒入塑料培养皿(直径为9cm)中，凝固待用，然后将菌饼接种至PDA培养基，待培养基表面长满白色菌丝后，待用；
S3、待鉴定水稻种质材料的准备：挑选待鉴定水稻材料、感病对照Lemont以及抗病对照Jasmine85和Tetep的饱满种子，浸种催芽，待种子破胸露白；
S4、将破胸露白的鉴定材料种子播于育秧盘，秧苗生长至2叶1心进行间苗；
S5、准备接种鉴定平台：组培架每层装有多个荧光灯管每层组培架四周用塑料薄膜进行密封，一侧开口，再用透明胶密封，以方便日常操作，组培室中组培架(长、宽、高规格为129cm×100cm×194cm)共分3层，层高60cm，荧光灯管光照时长由德力西集团生产的时控开关控制，将其改造为纹枯病鉴定实验平台，其可一次性鉴定234份水稻材料；
S6、接种：待步骤S3水稻材料秧苗长3-4叶期，播种14-16d后，在步骤S2活化扩大培养的菌落边缘，切取切取生长活跃的直径约为7mm的菌饼，将菌饼的菌丝面附着在植株基部，确保菌丝体与秧苗茎秆的完全接触,然后将接种后育秧盘放入步骤S5鉴定平台，塑料膜内早晚用喷壶喷水2次，保持相对湿度大于80％，组培架的每层光照周期为昼/夜12小时,昼夜空调温度分别设定为30℃和25℃；
S7、纹枯病苗期抗性鉴定评价。
进一步的，步骤S3中所述浸泡为将饱满种子装入牛皮纸袋浸种20-28小时，烘干为放入烘箱中35-45℃催芽24-36小时。
进一步的，步骤S4中所述育秧盘为128孔，所述育秧盘规格为54cm×28cm×5.0cm，孔穴规格为3cm×3cm×5.0cm，并且需将所述育秧盘放入规格为55cm×28.5cm×6.5cm的无孔托盘，保水深度为5cm，保持泥土湿润。
进一步的，步骤S4中播种方法为每个材料播5个穴，每穴播2粒种子，间苗方法为待长至2叶1心(播种后11-13d)，每穴去除1株弱苗，株行距为3cm×6cm，待用。
进一步的，整个实验过程中，育秧底部都保持有5cm深度的水，植株可以通过育秧盘底部的小孔吸收水分，保持正常生长。
进一步的，所述纹枯病菌株为ZJ03。
进一步的，步骤S7中接种后每天观察纹枯病发生状况，当感病对照品种Lemont的80％秧苗的病斑生长高度/株高相对值达到1，开展测量参试材料植株的病斑生长高度和秧苗株高，进行纹枯病抗性鉴定。
进一步的，
Figure BDA0003018310160000051
其中病斑生长高度由土表测量至最高病斑的上界，秧苗株高由土表测量至最新完全叶的叶枕处。
进一步的，将待鉴定的水稻品种或品系等水稻材料的种子按步骤S2-S7至少再进行1次重复鉴定，以平均值作为待鉴定材料的最终纹枯病抗性值。
进一步的，所述PDA培养基添加四环素的浓度(W/V)为0.005％。
本发明的有益效果为：
1.本发明能够精准稳定(温湿度、光照等环境因子精准控制)、高通量(核算鉴定1份水稻材料所需占地面积为0.0055m2)和高效快捷地鉴定评价水稻种质资源和遗传群体等大批量水稻种质材料的苗期纹枯病抗性，缩短纹枯病鉴定周期(从浸种催芽至纹枯病评价结束时间为21-23天)，提高筛选鉴定效率；且实验数据的可重复性高。此外，其鉴定温湿度、光照等环境因子精准可控、所需占地面积小(充分利用纵向空间)、操作便捷、工作量小和改造费用低等优点；可大量广泛挖掘鉴定水稻纹枯病抗性种质资源，为水稻纹枯病抗性遗传机理及抗病育种研究打下基础；
2.本发明装置在组培室内空调保障适宜温度，薄膜封闭来保湿，时控开关控制光照时长，其中分别维持昼夜间温度为30℃和25℃，维持昼/夜光照时长为12小时，通过早晚用喷壶喷水2次来维持湿度大于80％，不仅实现了纹枯病鉴定温湿度、光照等环境因子精准可控，还提高了不同批次鉴定结果的稳定性和一致性；
3.与叶鞘接菌采用牙签法、离体叶片鉴定法接菌等方法相比，本发明消除因植株受到伤害而造成对实验结果的影响，提高了鉴定结果的准确性和科学性；
4.相比于菌碟套入法、微室法及其改良法，本发明方法操作较为简便且鉴定环境可控稳定，不仅减少在各盆钵倒扣料塑料可乐瓶以形成微室环境的高强度工作，且组培架塑料膜内的小空间比温室大空间更容易精准监控温湿度，进而提高了纹枯病鉴定的工作效率和精准稳定性。此外，微室法(Jia YL,et al.2007)及其改良法(徐国娟，等，2015)鉴定1份水稻材料需要2个直径14.5cm的盆钵，所需占地面积为0.04205m2(29cm×14.5cm)；而本发明充分利用组培架的纵向空间，所需占地面积1.29m2(129cm×100cm)的组培架(三层实际可利用面积为3.87m2，每层放置6个育秧盘，每盘鉴定13份水稻材料)，单个改造后组培架可一次性鉴定234份水稻材料，经核算鉴定1份水稻材料所占地面积为0.0055m2，所需占地面积仅为上述2种方法的13.09％。综上，本发明提高了纹枯病鉴定的通量性、精准性和工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施方式，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明除去弱苗后的水稻材料图；
图2为本发明扩大培养纹枯病菌饼图；
图3为本发明纹枯病菌株接种后秧苗图；
图4为本发明水稻秧苗接种纹枯病鉴定平台图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和展示的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
实施例1
一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，如图1-4所示，水稻纹枯病病原菌：水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)菌株ZJ03由中国水稻研究所提供，下同；
将菌株ZJ03在超净工作台上接种于新的PDA培养基上，盖上黑布，在28℃下进行黑暗活化扩大培养3d后，待用；
2019年6月10日将水稻Jasmine 85、Tetep、Tsilaitranakoho 706和感病对照Lemont的种子装入浸种牛皮纸袋，浸泡24小时，放入烘箱中40℃催芽48小时，待种子露白。选出芽好的种子播于入预先消毒的泥土在128孔(孔穴规格为3cm×3cm×5cm)育秧盘(尺寸规格为54cm×28cm×5.0cm)中。每品种播种1行，每行8穴，每穴3粒种子，播种规格3cm×3cm；不同品种隔行播种，每盘8行。播种3盘。播种后育秧盘放置无孔托盘(规格为55cm×28.5cm×6.5cm)中，保水深度为5cm。待长至2叶1心(播种后11-13d)，每穴除去2株弱苗(图1)，株行距为3cm×6cm，直至苗长至3-4叶期(播种后14-16d)，待用；
待苗长至3-4叶期，用1mL枪头在活化扩大培养的菌落边缘切取，生长活跃的直径约为7mm的菌饼(图2)，用镊子将菌饼的菌丝面附着在植株基部，确保菌丝体与秧苗茎秆的完全接触(图3)。将接种后育秧盘放入组培架改造塑料膜内(图4)。塑料膜内早晚用喷壶喷水2次，保持相对湿度大于80％，膜内的温湿度由电子温湿度计(逸品博洋)监测。组培架的每层光照周期为昼/夜12小时。昼夜空调温度分别设定为30℃和25℃。整个实验过程中，育秧底部都保持有5cm深度的水，植株可以通过育秧盘底部的小孔吸收水分，保持正常生长；
当感病对照品种Lemont的80％秧苗的病斑生长高度/株高相对值达到1，开展测量参试材料植株的病斑生长高度和秧苗株高，进行纹枯病抗性鉴定。
为了消除排除不同水稻材料苗高对抗病评级标准的影响，参试水稻纹枯病苗期抗性值按如下公式计算：
Figure BDA0003018310160000081
表1水稻纹枯病抗性类型划分
Figure BDA0003018310160000082
计算Jasmine 85、Tetep、Tsilaitranakoho 706和Lemont等4份水稻纹枯病苗期抗性值分别为3.72级、3.66级、2.88级和9.43级，说明Tsilaitranakoho 706为高抗、Lemont为高感，Jasmine 85和Tetep分别为中抗。从浸种催芽至纹枯病评价结束的整个纹枯病鉴定周期为21天，鉴定周期短、鉴定效率高。
实施例2
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，2019年8月15日采用与实施例1相同的鉴定方法，对3份对照品种(感病对照品种Lemont和抗病对照Jasmine85与Tetep)和152份赣香B/Tsilaitranakoho 706F5代重组自交系群体及其双亲(Tsilaitranakoho 706和赣香B)共计157份水稻种子进行水稻苗期纹枯病抗性鉴定。
表2赣香B/Tsilaitranakoho 706重组自交系群体苗期纹枯病抗性表现
Figure BDA0003018310160000091
由表2可见，Jasmine 85、Tetep、Tsilaitranakoho 706、赣香B和Lemont等4份水稻纹枯病苗期抗性值分别为3.56级、3.04级、2.32级、8.98级和9.05级，说明Tsilaitranakoho706为高抗，赣香B和Lemont为高感，而Jasmine 85和Tetep分别为中抗。而群体苗期抗性值表现为连续正态分布，为多基因控制数量性状；其中11份苗期抗性值小于3.0，为高抗，23份苗期抗性值大于6.0，为高感，中抗材料55份，中感材料63份。从浸种催芽至纹枯病评价结束的整个纹枯病鉴定时间为23天，纹枯病鉴定周期短、鉴定效率高。
由实施例1和2中对照品种苗期纹枯病抗性结果相关性很高(Pearson相关分析结果表明，2次纹枯病表型值间相关系数达0.99)，从而说明本发明鉴定结果的重复稳定性高。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
S1.菌种准备：将纹枯病菌株放置在PDA培养基，活化培养3-5天，获得菌丝，待用；
S2.扩大培养：将配置好的PDA培养基灭菌后，将菌丝饼接种至PDA培养基中间，待培养基表面长满白色菌丝后，待用；
S3.待鉴定水稻种质材料的准备：挑选待鉴定水稻种质材料和感病对照品种的饱满种子，浸种烘箱催芽，待种子破胸露白；
S4.将破胸露白的鉴定材料种子播于育秧盘，秧苗生长至2叶1心时进行间苗；
S5.准备接种鉴定平台：组培架每层装有多个荧光灯管，每层组培架四周用塑料薄膜进行密封，一侧开口，再用透明胶将开口密封；
S6.接种：待步骤S3水稻材料秧苗长至3-4叶期，在步骤S2活化扩大培养的菌落边缘，切取生长活跃的菌饼，将菌饼的菌丝面附着在植株基部，确保菌丝体与秧苗茎秆的完全接触,然后将接种后育秧盘放入步骤S5鉴定平台，塑料膜内早晚用喷壶喷水2次，保持相对湿度大于80％，组培架的每层光照周期为昼/夜12小时,昼夜空调温度分别设定为30℃和25℃；
S7.纹枯病苗期抗性鉴定评价。
2.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，步骤S3中所述浸泡为将饱满种子装入牛皮纸袋浸种20-28小时，放入烘箱中35-45℃催芽24-36小时。
3.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，步骤S4中所述育秧盘为128孔，所述育秧盘规格为54cm×28cm×5.0cm，孔穴规格为3cm×3cm×5.0cm，并且需将所述育秧盘放入规格为55cm×28.5cm×6.5cm的无孔托盘，保水深度为5cm，保持泥土湿润。
4.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，步骤S4中播种方法为每个材料播5个穴，每穴播2粒种子，间苗方法为待长至2叶1心，播种后11-13d，每穴去除1株弱苗，株行距为3cm×6cm，待用。
5.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，整个实验过程中，育秧底部都保持有5cm深度的水。
6.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，所述纹枯病菌株为ZJ03。
7.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，步骤S7中接种后每天观察纹枯病发生状况，当感病对照品种的80％秧苗的病斑生长高度/株高相对值达到1，开始测量参试材料植株的病斑生长高度和秧苗株高，进行纹枯病抗性鉴定。
8.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，纹枯病评价标准采用病情指数
Figure FDA0003018310150000021
级，其中病斑生长高度由土表测量至最高病斑的上界，秧苗株高由土表测量至最新完全叶的叶枕处。
9.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，将待鉴定的水稻品种或品系等水稻材料的种子按步骤S2-S7至少再进行1次重复鉴定，以平均值作为待鉴定材料的最终纹枯病抗性值。
10.根据权利要求1所述的一种可控环境下水稻纹枯病抗性的苗期鉴定方法，其特征在于，所述PDA培养基添加四环素的浓度为0.005％。
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