CN101967522A - 一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)从外周血、肝组织等样本中检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的方法及其试剂盒。该方法包括：(1)采集样本；(2)提取DNA；(3)双色荧光定量PCR体外扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据各标本扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中HBV cccDNA存在，并能对通过阳性质控品的标准曲线对其进行准确定量，实现了对HBVcccDNA的实时快速定量检测。

Description

一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用

一、技术领域

本试发明涉及乙型肝炎病毒cccDNA的检测方法，特别是涉及使用双色荧光定量PCR技术快速准确地检测出病人血液和肝组织中乙型肝炎病毒cccDNA的方法。本发明进一步涉及用于乙型肝炎病毒cccDNA检测的试剂盒。

二、背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV，hepatitis B virus)感染引起的一种传染性疾病。据WHO相关统计，全世界无症状乙型肝炎病毒携带者超过2亿。而我国的乙肝病毒感染率约为60％；无症状乙肝病毒携带者约占总人口的7％，其中1/3出现肝损害的临床表现，目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的发病特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型乙型肝炎多见。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。

乙型肝炎病毒(HBV，hepatitis B virus)属嗜肝DNA病毒科，病毒较小，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。基因组共有四个开放读码框(ORF)：(1)S基因区，由S基因、前S2基因、前S1(pre-S1)基因组成，分别编码HBsAg、pre-S、pre-S1等抗原以及多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)；(2)C基因区，由前C基因和C基因组成，分别编码HBeAg及HBcAg抗原；(3)P基因区，编码HBV-DNAp，并具有逆转录酶活性；(4)X基因区，编码HbxAg抗原，并具有激活HBcAg基因的作用。

乙型肝炎病毒HBV cccDNA即乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(Covalentlyclosed circular DNA，cccDNA)是乙型肝炎病毒复制过程中最为关键的中间体形态，为HBV前基因组RNA的转录模板。在复制过程中，HBV基因组在聚合酶作用下将部分双链开环结构补足成完整双链结构，然后在细胞核内连接酶作用下把双链中缺口补平，形成共价闭合环状DNA结构，即HBV cccDNA。HBVcccDNA在细胞核内RNA聚合酶作用下，转录产生多种RNA，其中中间体RNA是形成子代HBV Dane颗粒的前体RNA，中间体RNA和病毒其它RNA分别在细胞浆内翻译产生HBsAg、HBeAg、HBcAg、HbxAg、DNA聚合酶等多种蛋白，进一步用于组装HBV。从复制过程来看HBV cccDNA是病毒复制以及致病机理的核心环节。

HBV cccDNA存在于肝细胞以及外周血淋巴细胞中。在肝细胞中HBVcccDNA可与细胞核内的核蛋白结合，形成稳定的微染色体结构。每个肝细胞内只有约5-50个拷贝的HBV cccDNA，对乙肝病毒的复制具有决定性意义。细胞内HBV cccDNA的维持有两个来源，一是肝细胞感染的HBVDane颗粒，二是在肝细胞内新形成的成熟核衣壳。目前临床使用的核昔类药物能有效抑制HBV病毒复制，但是对于HBV cccDNA效果却不佳。而临床上认为只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，这也是抗病毒治疗的目标。据研究人体免疫性清除HBV cccDNA主要通过两种途径，一是通过非溶细胞途径，降低肝细胞内的cccDNA的量；二是通过增加清除已感染肝细胞的能力并启动肝细胞逆转来实现。所以临床上用以抗HBV的药物和正在研究的治疗乙肝的药物的应以清除HBV cccDNA为目的。但是目前尚没有高效、可靠、灵敏度高的药物和治疗方法可以供临床应用。

HBV cccDNA和细胞外乙型肝炎病毒松弛环状双链DNA(Relaxed circularDNA，RcDNA)分子有一些结构和功能的不同：首先，HBV cccDNA的两条链是完整的，闭合的，而且两条链呈共价互补，而松弛环状RcDNA在正链与负链上均有缺口或缺刻，只是部分区域互补故即使能形成环状结构也不是超螺旋结构；其次，HBV cccDNA则不能与蛋白质共价结合，而RcDNA能够与蛋白质共价结合；再者，由于缺口或缺刻的存在，RcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶III等降解成寡核苷酸，而HBV cccDNA则由于是超螺旋结构且双链结构均是完整的，一般难以被降解。

临床上对乙肝患者进行HBV cccDNA的定量检测具有重要意义。首先，可以评价抗乙肝病毒药物的疗效。治疗前后进行肝细胞内乙肝病毒cccDNA的含量的检测，可以用于评价干扰素、核苷类似物等抗乙肝病毒药物的治疗效果以及判断患者病情。并对于指导临床医生如何选用抗乙肝病毒药物、判断何时停药、停药后乙肝病毒是否会恢复复制导致乙肝复发具有重要意义。其次，HBV cccDNA定量检测是评价乙肝病毒能否感染肝外组织的客观指标之一，乙肝病毒不仅是一种嗜肝病毒，一些肝外组织，如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞等中也可检测到乙肝病毒cccDNA，并可以作为判断HBV感染的一个标准。再次，对乙肝患者肝组织以及外周血中HBVcccDNA进行定量分析能够对判断病情提供重要依据。

目前针对HBV cccDNA的检测主要是普通PCR或者巢式PCR的方法，但是难以定量。而HBV cccDNA定量检测方法在检测技术上有许多问题需要解决，比如有必要进一步提高检测的灵敏度以便能够准确的检测出血液中的HBV cccDNA；进一步提高检测的特异性，避免同时检测到松弛环状双链HBV DNA(RcDNA)而干扰检测结果等等。本发明基于双色荧光定量PCR技术原理，研制了一种用于HBV cccDNA的定量检测的方法，能够快速准确的检测出病人肝组织和血液中HBV cccDNA并且进行定量。双色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增两个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测，所以称为双色荧光。探针的荧光标记可以是FAM、VIC、JOE、NED、HEX等其中的两种，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。利用该原理和方法发明的试剂盒在同一个标本的检测中，不但可以准确检测HBV cccDNA还可以对其进行定量。该试剂盒使用方便，而且该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强。

三、发明内容

基于双色荧光定量PCR的原理，本发明提供了检测HBVcccDNA的方法，特别是提供了一种使用双色荧光定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出人外周血和肝组织中HBV cccDNA的方法。本发明进一步提供了用于该病毒快速准确检测的试剂盒。

本发明的检测方法和试剂盒的具体步骤包括：(1)采集和运送样本(全血或者肝组织等)；(2)样本预处理和提取DNA；(3)双色荧光定量PCR体外扩增法对样本进行扩增检测；(3)扩增反应结束后根据每个反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断HBV cccDNA的存在，并根据扩增过程中阳性质控品的标准曲线判断标本中HBV cccDNA的拷贝数。

从Genbank上检索HBV cccDNA的基因序列，经过比对分析，用专门的引物探针设计软件，设计检测HBV cccDNA的特异性引物和荧光探针。由于松弛环状双链HBV DNA(RcDNA)的双链在正链与负链上均有缺口，只是部分区域互补才能形成环状结构，而长链和短链的5’端在基因组中的位置固定，并均为粘性末端，通过223个核苷酸碱基相互配对。这样如果将上游引物和探针设计在正链缺口的上游，下游引物设计在负链缺口的下游，或者将上游引物设计在正链缺口的上游，下游引物和探针设计在负链缺口的下游，这样整套引物跨越正负链两个缺口。根据荧光定量PCR的原理，如果模板为RcDNA，因模板有缺口，则不可能扩增，也没有扩增信号；如果模板为cccDNA，则可以扩增，有扩增信号。本发明选择后一种方法设计引物和探针，原理见图1。同时选用用人3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate ehydrogenase，GAPDH)基因作为内参照基因，用于HBV cccDNA的检测试验过程的监控，双色荧光PCR特异性引物和荧光探针设计如下：

(1)HBV cccDNA：

上游引物：5’-CGACCGACCTTGAGGCATAC-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-AGAGTAACTCCACAGAT/AGCTCC-3’(SEQ ID NO.2)

荧光探针：FAM-5’CACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTC 3’-TAMRA(SEQ ID NO.3)

(2)H-GAPDH：

上游引物：5’-AAGCGTTTTCTCCCTAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)

下游引物：5’-ACAAGCTTTGTACATGGTAT-3’(SEQ ID NO.5)

荧光探针：VIC-5’CTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCC3’-TAMRA(SEQ ID NO.6)

根据本发明的一个优选实施方案，其中所检测的是针对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA即HBV cccDNA的特异性检测，而不检测乙型肝炎病毒松弛环状双链DNA(RcDNA)。HBV cccDNA是乙型肝炎病毒复制过程中最为关键的中间体形态，为HBV前基因组RNA的转录模板。其结构和功能不同于细胞外乙型肝炎病毒松弛环状双链DNA。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测HBV cccDNA的方法，同时用人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为参照基因，在同一反应体系中进行扩增，用于HBV cccDNA的检测试验过程的监控。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双色荧光标记是指检测HBVcccDNA基因的探针的荧光标记为FAM，检测GAPDH基因的探针的荧光标记为VIC，淬灭基团均为TAMRA。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法首先采集标本，该发明的检测方法适用的标本类型有全血和肝组织等。全血标本的采集可用无菌注射器抽取受检者静脉血2-3毫升，注入无菌5ml枸橼酸钠的抗凝管中，反复颠倒3-5次以充分混匀。检测肝组织可以在无菌条件下取受检者肝组织约100-500mg左右，转入洁净的1.5ml离心管中，保存待检。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法，用检测上述标本中HBV cccDNA的PCR扩增体系按照如下方式配制，

5×FQ PCR buffer    6ul

上游引物(10uM)      各1ul

下游引物(10uM)      各1ul

荧光探针(10uM)      各0.5ul

dNTPs(10mM)         1ul

Taq酶               2ul

模板DNA             4ul

ddH₂O               12ul

                                

Total               30μl

根据本发明的一个优选实施方案，上述扩增反应体系中的5×FQ PCR buffer含以下成分：250mM Tris-HCl(pH8.0)、25mM MgCl₂、250mM KCl以及10％的DMSO等。

根据本发明的一个优选实施方案，上述PCR扩增体系中：6ul 5×FQ PCRbuffer、1ul各上游引物(10uM)、1ul各下游引物(10uM)、0.5ul各荧光探针(10uM)、1ul dNTPs(10mM)、12ul ddH₂O总计24ul，即为检测体系的PCR MIX，可以批量配制，并同时配以扩增用的Taq酶系，可满足大量检测的需要。

本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测HBV cccDNA的试剂盒，该试剂盒包括核酸提取液、Taq酶系、HBV cccDNA双色PCR MIX、HBV cccDNA阳性质控品(1×10⁷copies/ml)和阴性质控品等。

根据本发明的一个优选实施方案，上述“核酸提取液”是用来提取待测标本中的DNA，该提取液由以下成分构成：25mM NaOH、50mMTris-HCl(PH8.0)、0.1％TritonX-100、0.05mM EDTA(PH8.0)。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是指HBV cccDNA的特异性扩增片段，经过克隆连接到载体上，构建的重组质粒。经过绝对定量，其浓度为10⁷copies/ml。对HBV cccDNA阳性质控品进行梯度稀释，其扩增的等距平行的“S”型动力学曲线，如图2。

根据本发明的一个优选实施方案，稀释阳性质控品(10⁷copies/ml)浓度梯度为每ml1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹copies，进行灵敏度实验，结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×10²copies/ml，该荧光定量PCR的方法敏感性和精确性优于普通PCR方法。

为了完成本发明的方法，首先要提取DNA。对于外周血，首先将抗凝血摇匀，取500μl转至一洁净的1.5ml离心管中，编号标记。加入1ml 1×红细胞裂解液，剧烈震荡30s，3000g离心5min，弃上清。重复两次至无明显红色沉淀。若沉淀明显，需要再重复一次。然后加入1ml生理盐水，剧烈震荡15s，10000g离心5min，弃上清。沉淀加50μl核酸提取液，100℃水浴10min，13,000g离心3min，上清液即为提取的DNA。对于肝组织首先用生理盐水洗净肝组织表面的血液，取约50mg左右的组织，加入核酸提取液50μl充分混匀，用研磨器充分研磨，后100℃水浴10分钟，然后13,000rpm离心3分钟，上清液即为提取的DNA。DNA短时间可4℃保存，长时间需要-20℃保存。

根据本发明的再一个优选实施方案，从试剂盒取出上述配制的HBV cccDNAPCR MIX反应液、Taq酶系等室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。每个测试反应体系配制如下：HBV cccDNA PCR MIX 24ul、Taq酶系2ul。

计算好各试剂的使用量，将配制好的反应液按照每份26ul加入洁净的0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入处理后样品即提取的DNA、HBV cccDNA阳性质控品和阴性质控品均为4μl，10,000rpm瞬时离心10秒。将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阳性质控品、阴性质控品以及未知标本，设置样品名称并标记好荧光基团种类：报告基团设置为FAM和VIC、淬灭基团TAMRA。

根据本发明的再一个优选实施方案，该乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测试剂盒适用仪器和扩增条件为：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等荧光定量PCR仪器，扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒(检测荧光信号)，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒(检测荧光信号)，共40个循环。反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时要注意以下问题：阴性质控品应为阴性；HBV cccDNA阳性质控品扩增的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线；用于检测H-GAPDH基因的VIC荧光在每一个标本中均应当有信号即要有标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应当重新进行。

根据本发明的一个优选实施方案，用其它病毒感染的阳性标本(如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒以及HBV RcDNA病毒等)进行特异性实验，结果证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100％。

本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。在-20℃条件下试剂盒可有效期可以达12个月。

四、附图说明

图1下图显示松弛环状双链HBV DNA(RcDNA)的双链在正链与负链上均有缺口，RcDNA(+)链DNA的缺口用虚线表示，(-)链DNA的缺口用空缺表示，这样本发明将上游引物设计在正链缺口的上游，下游引物和探针设计在负链缺口的下游，如此整套引物就跨越正负链两个缺口。根据双色荧光定量PCR的原理，如果模板为RcDNA，则不可能扩增，结果为阴性；如果模板为cccDNA，如图1上图所示，则能够扩增，结果为阳性。图2显示一个扩增反应可以设置两种荧光，一种为FAM荧光，用于检测HBV cccDNA，另一种为VIC荧光，用于检测H-GAPDH基因并作为HBV cccDNA检测反应的内参照。图3为阳性质控品扩增动力学曲线，从10⁷copies/ml的原始浓度进行梯度稀释，扩增结果的动力学曲线呈等距离平行的“S”型。

五、具体实施方式

实施例1：标本采集和运送

本试剂盒的标本类型包括全血和肝组织等。采集全血可用无菌注射器抽取受检者静脉血2-3毫升，注入无菌5ml枸橼酸钠的抗凝管中，反复颠倒3-5次以充分混匀，保存待检。对于肝组织，需要在无菌条件下取受检者肝组织约100-500mg左右，转入洁净的1.5ml离心管中，保存待检。上述处理后的标本可保存于-20℃，但不要超过6个月，-70℃可长期保存。送检时需要用0℃冰壶储存。

实施例2：DNA提取

为了完成本发明的方法，需要进行DNA提取。对于外周血，首先将抗凝血摇匀，取500μl转至一洁净的1.5ml离心管中，编号标记。加入1ml 1×红细胞裂解液，剧烈震荡30s，3000g离心5min，弃上清。重复两次至无明显红色沉淀。若仍有红色沉淀，需要再重复洗涤细胞沉淀一次。然后再加入1ml生理盐水，剧烈震荡15s，10000g离心5min，弃上清。沉淀加入50μl核酸提取液，100℃水浴10min，13,000g离心3min，上清液即为提取的的DNA溶液。对于肝组织需要用生理盐水洗净肝组织表面的血液，取约50mg左右的组织，加入核酸提取液50μl充分混匀，并用研磨器充分研磨组织，然后100℃水浴10分钟充分裂解细胞，13,000rpm离心3分钟，上清液即为提取的DNA。DNA短时间可4℃保存，长时间需要-20℃保存。

实施例3：双色荧光PCR扩增检测HBV cccDNA

取出双色荧光PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。每个测试反应体系配制如下：

试剂	PCRMIX	Taq酶系
			用量	24μl	2μl

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的PCR反应管中分别加入26μl体系，然后向每管中加入处理后样品或阳性质控品或阴性质控品4μl。加样前阳性质控品预先进行10倍、100倍、1000倍梯度稀释，连同阳性质控品原液分别标记为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴copies/ml。加样后10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品、阳性定量质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(FAM和VIC)和设置循环条件：ABIPRISM7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等荧光定量PCR仪器，扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒(检测荧光信号)，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒(检测荧光信号)，共40个循环。

实施例4：结果分析和判定

反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时需要满足如下条件：阴性质控品应为全部阴性；梯度稀释的各阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线；各提取的标本检测H-GAPDH内参基因VIC荧光必须有信号。以上条件同时满足，试验结果才可靠；否则此次试验将视为无效，全部试验应重新进行。本试剂盒结果的定性判断有如下几种情况，见表1。

表1.HBV cccDNA双色荧光定量PCR检测试剂盒结果判断

阳性质控	阴性质控	FAM荧光	VIC荧光	结果判断
					+	-	+	+	HBV cccDNA阳性
+	-	-	+	HBV cccDNA阴性

+

-

-

-

DNA提取失败

六、序列表

SEQUENCE LISTING

<110>北京索奥生物医药科技有限公司

<120>一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cgaccgacct tgaggcatac        20

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

agagtaactc cacagatagc tcc    23

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cacctctgcc taatcatctc ttgttc    26

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

aagcgttttc tccctaaagg           20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

acaagctttg tacatggtat           20

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

ctgagctagg cagcagcaag cattcc    26

Claims (4)

1.本发明为一种乙型肝炎病毒cccDNA(HBV cccDNA)双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用，从外周血或者肝组织等样品中提取DNA，通过双色荧光定量PCR的方法对标本中的HBV cccDNA进行扩增，达到实时快速定量检测之目的。

2.根据权利要求1所述的一种HBV cccDNA双色荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，特征在于试剂盒中同时引入了人3-磷酸甘油醛脱氢酶(H-GAPDH)基因作为参照基因，用于HBV cccDNA的检测试验过程的监控。该检测试剂盒的双色荧光PCR特异性引物序列和荧光探针标记如下：

(1)HBV cccDNA：

上游引物：5’-CGACCGACCTTGAGGCATAC-3’；

下游引物：5’-AGAGTAACTCCACAGAT/AGCTCC-3’；

荧光探针：FAM-5’CACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTC 3’-TAMRA；

(2)H-GAPDH：

上游引物：5’-AAGCGTTTTCTCCCTAAAGG-3’；

下游引物：5’-ACAAGCTTTGTACATGGTAT-3’；

荧光探针：VIC-5’CTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCC3’-TAMRA。

HBV cccDNA和H-GAPDH的荧光探针分别标记为FAM和VIC，所以称为双色荧光PCR检测方法，淬灭基团均为TAMRA。

3.根据权利要求1所述的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，该试剂盒组成成分包括核酸提取液、Taq酶系、HBV cccDNA双色荧光PCR MIX、经绝对定量的阳性质控品(1×10⁷copies/ml)和阴性质控品等。每个检测反应的PCR MIX由6ul 5×FQPCR buffer、各1ul上游引物(10uM)、各1ul下游引物(10uM)、各0.5ul荧光探针(10uM)、1uldNTPs(10mM)、12ulddH₂O组成。其中5×FQ PCR buffer由250mMTris-HCl(pH8.0)、25mM MgCl2、250mM KCl以及10％的DMSO等组成。

4.根据权利要求1所述的一种试剂盒其适用仪器和扩增条件为：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等荧光定量PCR仪扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃30秒→55℃45秒(采集荧光信号)，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器扩增条件为93℃→2分钟，然后93℃5秒→58℃45秒(检测荧光信号)，共40个循环。

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