CN104004856A - 检测乙型肝炎病毒的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

检测乙型肝炎病毒的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法，该试剂盒含有高敏感度检测的引物组和探针，可以检测出单拷贝HBVDNA，在血清标本中定量检测限可达2IU/mL，比进口试剂罗氏的COBAS更敏感；本发明的检测方法可以检测出世界范围内各种不同亚型的乙型肝炎病原体；且加入内控系统，可有效防止假阴性；加入UNG酶体系，可有效避免污染；可应用于乙型肝炎的诊断、抗乙型肝炎新药研发筛选的评价、抗乙型肝炎治疗成效和复发的评估等，具有广泛的临床应用作用，有利于推广应用。

Description

检测乙型肝炎病毒的 PCR 引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染呈全球性分布，其感染者已超过二十亿，是我国目前危害最严重的传染病之一。2010年开展的全国乙肝流行病学调查显示，我国目前仍有乙肝表面抗原携带者约9300万人，乙肝和肝癌患者约占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，并且每年导致100余万人死亡，造成极大的社会及经济危害。
乙肝病毒复制是慢乙肝活动的根本原因，有效的抗病毒治疗可延缓疾病的进展，改善肝脏的生化学及组织学损害，降低肝硬化与肝细胞癌的发病率，降低病死率。抗病毒治疗是慢乙肝治疗史上的里程碑，从病原学角度控制病情的进展，使慢乙肝的治疗取得巨大的进步，但仍存在疗程不确定，停药后复发等问题，其中停药后复发是临床上亟需解决的问题。取得e抗原血清学转换的患者停药后复发率较低，是最可能实现停药的人群。但实际上，即使达到指南停药标准的e抗原（+）患者，仍有相当部分患者出现反弹，其机制尚不明确。有些文献报道停药后HBeAg血清学转换持久率达80-90%，然而也有文献报道停药后复发率达70%。我国最近发表的一项研究，对拉米夫定，阿德福韦和恩替卡韦治疗获得血清学转换后再平均治疗7个月的42 名病人平均随访59个月，只有31%的病人能够维持持续应答（HBeAg消失和HBV DNA < 10,000cp/ml），且复发多发生于停药半年后。如何减少停药后复发，提高停药后持久应答率，是临床上十分重要的问题。
停药时的HBV DNA水平可能是影响停药后复发的因素之一，在临床上可观察到，对HBV DNA抑制能力强的药物停药后复发出现较迟，而对HBV DNA抑制作用较弱的药物，停药后复发出现较早。日本的一项研究15对22例复发的病例及11例获得持久应答的病例进行对比，发现治疗过程中HBV-DNA水平<0.7logIU/ml持续6个月以上可降低停药后复发率。因此，采用高敏感的HBV DNA检测方法来检测停药时的HBV DNA载量，并探讨停药时的HBV DNA水平对复发率的影响，有着重要的临床意义。
目前国内大多数医院普遍采用国产的荧光定量PCR试剂来检测血清HBV DNA载量，其价格便宜，但敏感性较差，检测下限一般为100 IU/ml，对于低于此下限的HBV DNA载量不能再进一步区分，而且对于较高的HBV DNA载量，检测准确性欠佳，检测值往往低于实际水平。目前在国内应用的进口试剂主要有罗氏的COBAS amplicor及COBAS Taqman，其中COBAS Taqman HBV DNA是美国FDA批准的唯一一种采用Taqman技术的试管诊断自动控制技术，是慢性乙型肝炎临床实践指南中推荐的HBV DNA检测方法，它具有灵敏度高、线性范围宽、实时监控、重复性好等优点，检测范围可达20 IU/mL～1.7×108 IU/mL，因其设备昂贵，检测费用高，目前还难以在临床广泛应用。而且，停药时的HBV DNA水平可能低于罗氏的试剂的检测下限20 IU/mL。因此，目前亟需建立一种更加敏感的HBV DNA检测方法，以指导慢乙肝的临床治疗。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，及特定的PCR反应程序和条件，构建了高敏感PCR检测试剂盒及检测方法，定量检测限可达2 IU/mL，比进口试剂罗氏COBAS HBV检测更敏感。
本发明的目的在于提供检测乙型肝炎病毒的PCR引物。
本发明的另一目的在于提供检测乙型肝炎病毒的PCR引物组。
本发明的再一目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
检测乙型肝炎病毒的PCR引物，其引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；或者为该些序列的核苷酸互补序列；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:3：TGACGCAACCCCCACTG，
SEQ ID NO:4：GCTGCGAGCAAAACAAG，
SEQ ID NO:5：GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:6：GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC，
SEQ ID NO:7：GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG，
SEQ ID NO:8：GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT，
SEQ ID NO:9：GCTGACGCAACCCCCAC，
SEQ ID NO:10：CGGCTGCGAGCAAAACA，
SEQ ID NO:11：CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:12：CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC。
检测乙型肝炎病毒的PCR引物组，引物组为引物组1或引物组2，其中，
引物组1 由引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成；
引物组2由引物序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成。
检测乙型肝炎病毒的PCR检测探针，其序列如下所示：
SEQ ID NO:13：CCGATCCATACTGCGGAACT，
SEQ ID NO:14：CCGATCCATACTGCGGAAC ，
SEQ ID NO:15：GCCGATCCATACTGCGGAACT，
SEQ ID NO:16：GCCGATCCATACTGCGGAAC；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
上述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的PCR检测引物组。
进一步的，该试剂盒还含有至少1条上述所述的检测探针。
进一步的，该试剂盒还包含内控引物组和内控探针，其核苷酸序列分别为：
内控引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:17：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:18：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:19：CCACACTGTGCCCATCTACGA，
SEQ ID NO:20：GCGCTCGGTGAGGATCTT C；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:21：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT；或者为其核苷酸互补序列。
内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于前面所述探针的荧光基团。
进一步的，该试剂盒还含有：DNA浓缩液和裂解液；内标；PCR反应液；Taq 酶 和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品；阳性定量参考品。
进一步的，所述的PCR反应液含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测方法，包括以下步骤：
1）DNA提取：
取样本、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200ul，分别加入HBV内标0.5ul和DNA浓缩液200ul，震荡混匀10s，12000rpm，离心10min，弃上清，加入DNA裂解液20ul，震荡混匀30s，100±5℃，孵育10min，12000rpm离心5min，取上清即为模板DNA；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 43.2μl
5U/ul Taq 酶 0.8μl
1U/ul UNG酶 0.06μl
DNA模板 6μl；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
根据分析后图像调节Baseline 的start值、stop值以及Threshold的Value值，点击Analyze进行分析，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0~-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
实验结果需同时满足以下质量控制，否则，本次实验无效，需重新进行：
①HBV阴性质控品：无CT值显示；HBV内标检测为阳性，且CT值＜28；
②HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×102~1×103IU/ml；
③HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×105~1×106IU/ml；
④5个HBV定量参考品均为阳性，且线性相关系数0.98≤r≤1。
本发明的有益效果是：
1）本发明的高敏感PCR检测试剂盒可以检测出单拷贝HBV DNA，在血清标本中定量检测限可达2 IU/mL，比进口试剂罗氏的COBAS更敏感；
2）本发明的检测方法可以检测出世界范围内各种不同亚型的乙型肝炎病原体；
3）本发明的检测方法加入内控系统，可有效防止假阴性；
4）本发明的检测方法加入UNG酶体系，可有效避免污染；
5）本发明技术开发的高敏感PCR检测试剂盒及其检测方法由于高敏感等特性，其临床应用广泛，可用于：①抗乙型肝炎治疗成效和复发的评估；②指导抗乙型肝炎药物治疗；③乙型肝炎潜伏感染诊断；④乙型肝炎病情进展包括疾病复发的评估；⑤早期乙型肝炎的诊断；⑥乙型肝炎辅助诊断；⑦抗乙型肝炎新药研发筛选的评价；⑧新的治疗乙型肝炎方法、手段的再评价。
附图说明
图1 为HBV DNA及内控（HBV-IC）扩增图；
图2 为实施例5的特异性实验图；
图3 为实施例5的灵敏度实验图；
图4 为线性检测范围内的PCR扩增图；
图5为线性回归标准曲线图（R2=0.997）；
图6为检测HBV DNA阳性血浆标本（n=400例）及阴性血浆标本（n=100例）结果比较图：左图为罗氏COBSA HBV DNA检测与我们开发的高敏HBV DNA检测试剂盒定量相关性图；右图为不同HBV 拷贝数浓度下（包括阴性标本）COBAS与高敏HBV DNA检测试剂盒检测阳性结果数量；
图7为预测抗HBV治疗再停药后复发的阈值（cut-off）为2.24 IU/ml，灵敏度和特异性分别为0.553和0.84（ROC曲线）；
图8为Kaplan-Meier分析图，在HBV DNA≥2.24 IU/ml时停药的病人复发几率远高于HBV DNA<2.24 IU/ml时停药的病人（P<0.0001）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此
实施例 1 ：检测乙型肝炎病毒的 PCR 引物组
本发明前期通过多种计算机程序及引物设计原则并结合我们实际经验情况，设计出大量检测乙型肝炎病毒的PCR引物约80条，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，最终选取检测乙型肝炎病毒效果最佳的PCR引物组，其中包括2组，其核苷酸序列分别如下所示：
引物组1：
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:3：TGACGCAACCCCCACTG，
SEQ ID NO:4：GCTGCGAGCAAAACAAG，
SEQ ID NO:5：GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:6：GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC，
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
引物组2：
SEQ ID NO:7：GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG，
SEQ ID NO:8：GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT，
SEQ ID NO:9：GCTGACGCAACCCCCAC，
SEQ ID NO:10：CGGCTGCGAGCAAAACA，
SEQ ID NO:11：CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:12：CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC，
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
实施例 2 ：检测乙型肝炎病毒的 PCR 检测试剂盒
检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒包括以下成份：
1）含有实施例1中所述的引物组中的至少一组引物组；
2）检测探针：检测探针选自以下探针序列中的至少一种：
SEQ ID NO:13：CCGATCCATACTGCGGAACT
SEQ ID NO:14：CCGATCCATACTGCGGAAC
SEQ ID NO:15：GCCGATCCATACTGCGGAACT
SEQ ID NO:16：GCCGATCCATACTGCGGAAC；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中任意一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中任意一种。
3）内控引物组和内控探针，其序列分别为：
内控引物组序列为：
SEQ ID NO:17：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:18：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:19：CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20：GCGCTCGGTGAGGATCTT C；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列为：
SEQ ID NO:21：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT，或者为其核苷酸互补序列；
内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于2）中所述探针的标记荧光基团。
4）PCR反应液：含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
5）DNA浓缩液及裂解液；内控（为防止假阴性，内控为阳性并保证在一定Ct值范围内，才表示该标本及操作过程无问题）；Taq酶和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品；阳性定量参考品；其中，阴性对照为质粒保存液；强阳性对照品、临界阳性及阳性定量参考品为含HBV基因序列的质粒，强阳性对照品和临界阳性对照品的浓度分别为 2E5和200 IU/ml，阳性定量参考品的浓度梯度分别为E7、E6、E5、E4、和E3 IU/ml。
实施例 3 ：检测乙型肝炎病毒的 PCR 检测方法
利用实施例2建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）DNA提取：
取待测样本、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200ul，分别加入内标0.5ul和DNA浓缩液200ul，震荡混匀10s，12000rpm，离心10min。弃上清，加入DNA裂解液20ul，震荡混匀30s，100±5℃，孵育10min。12000rpm，离心5min；分别取上清，获得各样品的模板DNA；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 43.2μl
5U/ul Taq 酶 0.8μl
1U/ul UNG酶 0.06μl
DNA模板 6μl。
3）PCR反应程序为（以ABI7500为例）：
第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
根据分析后图像调节Baseline 的start值、stop值以及Threshold的Value值，点击Analyze进行分析，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0~-0.98。然后到Plate窗口下记录定量结果。
质量控制
（1）HBV阴性质控品：无CT值显示；HBV内标检测为阳性，且CT值＜28。
（2）HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×102~1×103IU/ml。
（3）HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×105~1×106IU/ml。
（4）5个HBV定量参考品均为阳性，且线性相关系数0.98≤r≤1。
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
实施例 4 ：
一、检测乙型肝炎 病毒 的 PCR 试剂盒（优先用于检测 HBV B/C 亚型 DNA ）的建立
1）合成乙型肝炎病毒高敏感PCR检测的引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
引物组1：
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:3：TGACGCAACCCCCACTG，
SEQ ID NO:4：GCTGCGAGCAAAACAAG，
SEQ ID NO:5：GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:6：GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC，
2）合成检测探针，其序列为：
SEQ ID NO:13：FAM-CCGATCCATACTGCGGAACT-MGB
3）内控引物组和内控探针，其序列分别为：
内控引物组
SEQ ID NO:17：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:18：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:19：CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20：GCGCTCGGTGAGGATCTT C
内控探针序列
SEQ ID NO:21：VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-TAMRA
4）PCR反应液：PCR反应液含有25mM Tris-HCl (pH8.0)，25mM KCl，2.5mM (NH4)SO4，2mM MgCl2，0.5mM dNTP/UTP Mix，引物组1中的6条引物浓度均为200nM，100nM 探针，内控引物中的4条引物均为200nM，100nM内控探针；
5）DNA浓缩液及裂解液；内控；Taq 酶和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品；阳性定量参考品；其中，阴性对照为质粒保存液；强阳性对照品、临界阳性及阳性定量参考品为含HBV基因序列的质粒，强阳性对照品和临界阳性对照品的浓度分别为 2E5和200 IU/ml，阳性定量参考品的浓度梯度分别为E7、E6、E5、E4、和E3 IU/ml。
二、检测乙型肝炎 病毒 的 PCR 检测方法（优选为用于检测 HBV B/C 亚型 DNA ）
利用“一”中建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）DNA提取：取待检测的样本，按实施例3所述的DNA提取方法进行模板DNA的提取；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 43.2μl
5U/ul Taq 酶 0.8μl
1U/ul UNG酶 0.06μl
DNA模板 6μl。
3）PCR反应程序为：第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒，64 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 10 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时设置FAM和VIC荧光通道采集荧光；
4）结果分析：
根据分析后图像调节Baseline 的start值、stop值以及Threshold的Value值，点击Analyze进行分析，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0~-0.98。然后到Plate窗口下记录定量结果。
质量控制
（1）HBV阴性质控品：无CT值显示；HBV内标检测为阳性，且CT值＜28。
（2）HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×102~1×103IU/ml。
（3）HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×105~1×106IU/ml。
（4）5个HBV定量参考品均为阳性，且线性相关系数0.98≤r≤1。
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
本实施例中所述的检测试剂盒和检测方法优选为用于检测HBV B/C亚型DNA。
实施例 5：
一、检测乙型肝炎 病毒 PCR 检测试剂盒（检测所有 HBV 亚型 DNA ）的建立
1）合成乙型肝炎病毒高敏感PCR检测的引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
引物组2：
SEQ ID NO:7：GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG，
SEQ ID NO:8：GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT，
SEQ ID NO:9：GCTGACGCAACCCCCAC，
SEQ ID NO:10：CGGCTGCGAGCAAAACA，
SEQ ID NO:11：CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:12：CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC，
2）合成检测探针，其序列为：
SEQ ID NO:13：FAM-CCGATCCATACTGCGGAACT-MGB
3）内控引物组和内控探针，其序列分别为：
内控引物组
SEQ ID NO:17：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:18：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:19：CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20：GCGCTCGGTGAGGATCTT C
内控探针序列
SEQ ID NO:21：VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-TAMRA
4）PCR反应液：含有25mM Tris-HCl (pH8.0)，25mM KCl，2.5mM (NH4)SO4，2mM MgCl2，0.5mM dNTP/UTP Mix，引物组2中的6条引物浓度均为200nM，100nM 探针，内控引物中的4条引物均为200nM，100nM内控探针；
5）DNA浓缩液及裂解液；内控；Taq 酶和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品；阳性定量参考品；其中，阴性对照为质粒保存液；强阳性对照品、临界阳性及阳性定量参考品为含HBV基因序列的质粒，强阳性对照品和临界阳性对照品的浓度分别为 2E5和200 IU/ml，阳性定量参考品的浓度梯度分别为E7、E6、E5、E4、和E3 IU/ml。
二、检测乙型肝炎 病毒 的 PCR 检测方法（检测所有 HBV 亚型 DNA ）
利用“一”中建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）DNA提取：取待检测的样本，按实施例3所述的DNA提取方法进行模板DNA的提取；
2）PCR反应体系：（请补充）
PCR反应液 43.2μl
5U/ul Taq 酶 0.8μl
1U/ul UNG酶 0.06μl
DNA模板 6μl。
3）PCR反应程序为：第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒，63－69 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 10 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时设置FAM和VIC荧光通道采集荧光；
4）结果分析：同实施例4。
下面对本发明的PCR检测试剂盒作进一步的效果检测。
首先按照实施例2和3所述的试剂盒和检测方法对HBV阳性对照品和内控（HBV-IC）进行检测，确认本发明的可行性，检测结果如图1所示，从中可以看出本发明可以对HBV的阳性对照品和定量参考品进行准确的检测，并含有内控（HBV IC），可应用于HBV的检测。
一）特异性实验
利用HBV不同亚型（包括A、B、C、D、E、F、G、H 8个HBV亚型）的临床标本提取DNA，按照实施例5所述的检测试剂盒及检测方法对不同亚型的HBV进行检测（每种亚型各15例，每例重复测试5次），结果均为阳性（阳性率100%）（如图2所示）。
同时对103例HBV临床阴性标本进行检测，阴性标本分别为1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒、6型单纯疱疹病毒、HIV、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型、柯萨奇病毒B3、登革热病毒1-4以及大肠杆菌提取的核酸进行检测，结果显示为阴性（100%）（如图2所示）。以上结果证明本发明方法具有很好的特异性。
另外，我们对HBV定量国家标准品中的8份阴性参考品及9份阳性参考品进行检测。8份阴性参考品检测符合率为8/8，9份阳性参考品符合率为9/9，即阴阳性参考品符合率为100%（17/17）。
二）灵敏度实验
（ 1 ）乙型肝炎病毒高敏感 PCR 检测试剂盒灵敏度分析
将HBV定量国家标准品用阴性血清稀释成系列梯度浓度(1~100 IU/ml)，采用实施例5的试剂盒及检测方法对HBV DNA进行检测，检测结果如图3所示，从中可以看出，本发明的最低检出限可达2 IU/ml，通过多次重复检测，在2 IU/ml浓度检出率为96.2%。
（ 2 ）检测乙型肝炎病毒 PCR 检测试剂盒的线性范围
采用已用国家参考品标定的HBV定量标准品进行稀释检测，稀释浓度由1.2×108IU/ml进行梯度稀释，稀释后的浓度分别为：1.2×108IU/ml、1.2×107IU/ml、1.2×106IU/ml、1.2×105IU/ml、1.2×104IU/ml、1.2×103IU/ml、1.2×102IU/ml、2IU/ml；取其检测值及均值进行结果计算和判断。进行数据经可用性检查和多项回归分析，并经精密度检验后，确定在检测范围内，本试剂结果为线性。最终结果显示线性覆盖范围为2~1.2×107IU/ml（如图4所示），线性回归曲线图如图5所示R2=0.997。
（ 3 ）本发明检测试剂盒与上市产品的比较（准确度及灵敏度）
利用实施例5所述的检测试剂盒和检测方法监测HBV患者（分为接受抗病毒治疗、不接受抗病毒治疗或中止抗病毒治疗）的病毒载量。在250例HBV DNA病毒载量为20~1×107IU/ml的临床样本中，用实施例5的检测方法与罗氏COBAS HBV DNA检测系统进行平行检测并对比，两者定量结果具有良好的相关性（斜率为0.976，95％CI为0.92〜1.01）（图6左）。然而，在150例接受治疗后病毒载量<20 IU/ml的患者样本，本发明的HBV DNA PCR检测方法检测出134例阳性，而罗氏COBAS HBV DNA检测仅检测出38例阳性（图6 右），说明本发明具有更好的灵敏度，更能确保临床的检出率。对100例阴性血浆标本进行本发明的HBV DNA检测和罗氏COBAS检测，二者均未有检出，都具有高特异性（图6右）。
三）临床应用
本发明检测方法在评估抗病毒治疗效果临床应用的初步研究
通过和中山大学第三附属医院合作，用本发明的HBV DNA 检测试剂，研究在停止抗病毒药物治疗时，乙型肝炎病毒感染者复发和血浆中低水平的HBV DNA载量之间的关系。在停止治疗后，乙肝病毒DNA残留量显示复发病人组(n = 41)和不再复发病人组(n = 31)之间有显著差异(130.4±420.90 IU/ml vs 44.6±155.16 IU/ml, P = 0.001)。分别通过ROC曲线方法评估显示，停止抗病毒药物治疗时，乙型肝炎病毒DNA为2.24 IU/ml 时（临界值），预测病人复发的敏感性为0.553，特异性为0.840(图7)。Kaplan-Meier分析显示，停药时HBV DNA≥2.24 IU/ml 的病人复发几率远高于停药时HBV DNA<2.24 IU/ml 的病人（P<0.0001）(图8)。这些初步数据表明了本发明的高敏PCR在抗病毒药物疗效评估上应用可行性。这些结果提出临床研究方案进一步研究高敏感HBV DNA检测在抗病毒药物疗效和治愈评估上应用可行性。
<110> 广州海力特生物科技有限公司
<120> 检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
<130>
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ggcaacggcc tggtctgtgc caagtgt 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
ggcaacggtc aggtctctgc caagtgt 27
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
tgacgcaacc cccactg 17
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
gctgcgagca aaacaag 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
gcgcaggatc cagttggcag caca 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
gtcccgcgca ggatccagtt ggcagc 26
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
gccgacagta tctgaacctt taccccgttg 30
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
gcaacggtca ggtctgtgcc aagtgttt 28
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
gctgacgcaa cccccac 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
cggctgcgag caaaaca 17
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
ccgcgcagga tccagttggc agcaca 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
cccgcgcagg atccagttgg cagcac 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 13
ccgatccata ctgcggaact 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 14
ccgatccata ctgcggaac 19
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<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 15
gccgatccat actgcggaac t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工探针
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gccgatccat actgcggaac 20
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 17
cggggtcacc cacactgtgc ccatctacg 29
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 18
ggtcacccac actgtgccca tctacg 26
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 19
ccacactgtg cccatctacg a 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 20
gcgctcggtg aggatcttc 19
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 21
atgccctccc ccatgccatc ct 22

Claims (10)

1.检测乙型肝炎病毒的PCR引物，其引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；或者为该些序列的核苷酸互补序列；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT，
SEQ ID NO:3：TGACGCAACCCCCACTG，
SEQ ID NO:4：GCTGCGAGCAAAACAAG，
SEQ ID NO:5：GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:6：GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC，
SEQ ID NO:7：GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG，
SEQ ID NO:8：GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT，
SEQ ID NO:9：GCTGACGCAACCCCCAC，
SEQ ID NO:10：CGGCTGCGAGCAAAACA，
SEQ ID NO:11：CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA，
SEQ ID NO:12：CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC。
2.检测乙型肝炎病毒的PCR引物组，引物组为引物组1或引物组2，其中，
引物组1 由引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成；
引物组2由引物序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成。
3.检测乙型肝炎病毒的PCR检测探针，其序列如下所示：
SEQ ID NO:13：CCGATCCATACTGCGGAACT，
SEQ ID NO:14：CCGATCCATACTGCGGAAC ，
SEQ ID NO:15：GCCGATCCATACTGCGGAACT，
SEQ ID NO:16：GCCGATCCATACTGCGGAAC；
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
4.根据权利要求3所述的检测乙型肝炎病毒的PCR检测探针，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
5.一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求2所述的PCR检测引物组。
6.根据权利要求5所述的一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有至少1条权利要求3所述的检测探针。
7.根据权利要求5所述的一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含内控引物组和内控探针，其核苷酸序列分别为：
内控引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:17：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:18：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:19：CCACACTGTGCCCATCTACGA，
SEQ ID NO:20：GCGCTCGGTGAGGATCTT C；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:21：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT；或者为其核苷酸互补序列；
内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于权利要求3所述探针的荧光基团。
8.根据权利要求5所述的一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有：DNA浓缩液和裂解液；内标；PCR反应液；Taq 酶 和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品；阳性定量参考品。
9.根据权利要求8所述的一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应液含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
10.一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DNA提取：
取样本、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200ul，分别加入HBV内标0.5ul和DNA浓缩液200ul，震荡混匀10s，12000rpm，离心10min，弃上清，加入DNA裂解液20ul，震荡混匀30s，100±5℃，孵育10min，12000rpm离心5min，取上清即为模板DNA；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 43.2μl
5U/ul Taq 酶 0.8μl
1U/ul UNG酶 0.06μl
DNA模板 6μl；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 63~69 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
根据分析后图像调节Baseline 的start值、stop值以及Threshold的Value值，点击Analyze进行分析，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0~-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
实验结果需同时满足以下质量控制，否则，本次实验无效，需重新进行：
①HBV阴性质控品：无CT值显示；HBV内标检测为阳性，且CT值＜28；
②HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×102~1×103IU/ml；
③HBV临界阳性质控品：检测浓度值介于1×105~1×106IU/ml；
④5个HBV定量参考品均为阳性，且线性相关系数0.98≤r≤1。
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