CN105420410A - 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents

检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105420410A
CN105420410A CN201510903524.6A CN201510903524A CN105420410A CN 105420410 A CN105420410 A CN 105420410A CN 201510903524 A CN201510903524 A CN 201510903524A CN 105420410 A CN105420410 A CN 105420410A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
probe
primer
nucleic acid
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510903524.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105420410B (zh
Inventor
吴燕
邓京
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Original Assignee
Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Livzon Diagnostics Inc filed Critical Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Priority to CN201510903524.6A priority Critical patent/CN105420410B/zh
Publication of CN105420410A publication Critical patent/CN105420410A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105420410B publication Critical patent/CN105420410B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法，其涉及乙型肝炎病毒核酸的检测，其涉及针对HBV多个保守基因序列的特异性引物、引物组和/或探针；还涉及包含HBV特异性引物组和/或探针的用于特异性检测HBV核酸的组合物；还涉及包含所述组合物的HBV高灵敏性检测试剂盒，以及用于高灵敏特异性检测HBV核酸的方法。本发明的引物组和探针可以同时检测HBV基因的三个保守基因区域，因此可解决因HBV其中一个或两个基因序列突变而产生漏检的问题。此外，为了解决由于不同基因型之间扩增效率差异而敏感度不同的问题，本发明在引物和探针的变异位置引入了核苷类似物I碱基，提高了引物和探针对不同基因序列的包容性，以保证不同基因型都具有较高的敏感性。

Description

检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)核酸的检测。更具体地，本发明涉及针对HBV多个保守基因序列的特异性引物、引物组和/或探针，包含HBV特异性引物组和/或探针的用于特异性检测HBV核酸的组合物，包含所述组合物的HBV高灵敏性检测试剂盒，以及用于高灵敏特异性检测HBV核酸的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，我国属于乙型肝炎感染地方性流行区。HBV感染是多种肝脏疾病的主要原因，长期HBV感染易引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌等疾病。因此，对慢性乙型肝炎进行积极的治疗或干预具有重要的意义。乙肝病毒复制是慢性乙型肝炎活动的根本原因。因此，需要定期对乙肝患者体内的HBV病毒水平进行准确地定量检测，以确定慢性乙型肝炎的治疗时机和治疗方案。
HBV病毒水平的定量检测除用于慢性乙肝的监测外，感染者外周血中HBV的病毒载量也是决定是否需要抗病毒治疗的重要指标，用药后病毒载量的变化也是判断抗病毒治疗效果的重要依据，对判断疗效、预后和耐药发生至关重要，是对治疗方案进行优化和调整的重要依据。因此，高敏感高特异的HBV核酸定量检测方法对乙肝的治疗具有重要的临床指导意义。
目前国内大多数医疗机构普遍采用国产的荧光定量PCR试剂来监测患者外周血中的HBV病毒载量。此类国产试剂相比进口试剂往往价格较便宜，但普遍存在灵敏度不高，重复性较差，对于较低水平的病毒载量(低于30IU/ml)往往不能准确地检出等问题。目前在国内应用较多的进口试剂主要有罗氏的COBASamplicor及COBASTaqman，其中COBASTaqmanHBVDNA检测是美国批准的唯一一种采用Taqman技术的自动控制技术，是慢性乙型肝炎临床实践指南中推荐的HBVDNA检测方法。该方法具有灵敏度高、线性范围宽、重复性好等优点，检测范围可达20IU/ml～1.7×108IU/ml，但其设备昂贵，检测费用高，目前还难以在临床上广泛应用，特别是经济欠发达地区。另外，其检测下限为20IU/ml，治疗后病人体内的HBVDNA水平可能低于其检测下限而被漏检。因此，目前亟需一种更加高灵敏、高特异、重复性好的HBV核酸的检测方法，以指导慢性乙型肝炎的临床治疗。
此外，目前市场上的HBVDNA检测试剂一般针对HBV基因中遗传变异较小的基因区进行检测，如S区，C区，X区等。虽然这些区域较为保守，但也具有低概率的变异，如突变，且不同亚型之间的序列也存在多态性。如果在引物探针结合的碱基序列中发生变异或存在多态性，就有可能导致PCR扩增失败而出现假阴性结果，影响对HBV感染的诊断及慢性乙型肝炎的治疗。如果同时针对HBV的两个或多个保守基因进行检测，则可以避免上述假阴性结果的出现，从而大大提高检测试剂盒的灵敏度和准确性。目前已有针对HBV两个基因区同时进行检测的报道，如凯杰生物工程(深圳)有限公司在专利“用于检测人乙型肝炎病毒的引物组和探针”中的关于同时检测HBVS区及前核心区的报道。虽然相比于单基因检测，双基因检测能大大降低漏检的风险，但当两个基因同时存在突变时，也可能会导致扩增失败而漏检。另外，目前的方法仍存在检测灵敏度低(检测限仅为20IU/ml)、定量限低(仅为40IU/ml)等问题。因此，仍然需要一种灵敏度更高、特异性更好、突变包容性更好的HBV核酸定量检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目标在于提供能满足上述要求的用于高灵敏检测HBV核酸的引物组、探针以及包含所述引物组和探针的试剂盒。本发明的引物组和探针可以同时检测HBV基因的三个保守基因区域，因此可解决因HBV其中一个或两个基因序列突变而产生漏检的问题。此外，为了解决由于不同基因型之间扩增效率差异而敏感度不同的问题，本发明在引物和探针的变异位置引入了核苷类似物I碱基，提高了引物和探针对不同基因序列的包容性，以保证不同基因型都具有较高的敏感性。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明的一个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物组，所述引物组包括至少一种选自以下的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的探针，所述探针包括至少一种选自以下的探针，或者包括至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上用于检测HBV核酸的探针的一个末端标记荧光基团，且用于检测HBV核酸的探针的另一个末端标记淬灭基团。其中用于检测HBV核酸的探针的一个末端所标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种,但并不限于上述几种；用于检测HBV核酸的探针另一个末端所标记的淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种,但并不限于上述几种。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7的探针；在另一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.8的探针；在再一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.8的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针。此外，上述组合物还均包含对HBV检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO.10的内标探针，或者其反向互补序列。该内标探针的一个末端标记荧光基团，且该内标探针的另一个末端标记淬灭基团，其中所述内标探针的上述一个末端标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并不限于上述几种，且该内标探针所标记的荧光基团不同于用于检测HBV核酸的探针末端所标记的荧光基团。
本发明的第四个目的是提供一种用于特异性检测HBV核酸的试剂盒，其含有本发明的上述至少一种引物组和/或上述至少一种探针。具体为，该试剂盒包含至少一种选自以下所述的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物。
该试剂盒还包含至少一种选自以下的探针，或者包含至少一种以下序列的反向互补序列：(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上所述探针的一个末端标记荧光基团，且另一个末端标记淬灭基团，其中荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并不限于上述几种；淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种，但并不限于上述几种。
该试剂盒还包含有一条对HBV的检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO.10的内标探针，或者其反向互补序列，该内标探针的一个末端标记荧光基团，且该内标探针的另一个末端标记淬灭基团，其中所述内标探针的上述一个末端标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并不限于上述几种，且该内标探针所标记的荧光基团不同于用于检测HBV核酸的探针末端所标记的荧光基团。
该试剂盒还包含有内标；PCR反应预混液；强阳性质控品、临界阳性质控品及阴性质控品；和阳性定量参考品。其中所述PCR反应预混液含有PCR缓冲液、DNA聚合酶、UNG酶、dNTP和dUTP。
本发明的第五个目的是提供一种检测样本中HBV核酸的方法，所述方法包括：
(1)提取和纯化样本中的核酸：
(2)使用上述的任一引物组进行特异性扩增和/或使用上述任一探针进行特异性检测；
具体的为，其中引物组为包括至少一种选自以下所述的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物；
其中所述探针为包含至少一种选自以下的探针，或者包含至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上所述探针的一个末端标记荧光基团，且另一个末端标记淬灭基团，其中荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并不限于上述几种；淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种，但并不限于上述几种。所采用的特异性检测为PCR检测，优选为荧光定量PCR检测。
本发明的有益技术效果是：
本发明针对目前已有方法的不足进行创新性改进，提供了灵敏度高、假阴性率低、线性范围广、突变包容性好、定量准确且精密度高的用于HBV核酸特异性检测的引物组和探针，包含所述引物组和探针的HBV定量检测试剂盒以及HBV定量检测的方法。
附图说明
图1为本发明试剂盒的线性范围，从图中可知本发明试剂盒的线性范围为10IU/ml～4×108IU/ml；
图2为本发明三组引物探针合并与两组引物探针分别合并的检测效果的比较之一，本图为检测组合1通过荧光定量PCR方法检测4个浓度的临床样本稀释液(100、1000、10000、100000IU/ml)的结果图；
图3为本发明三组引物探针合并与两组引物探针分别合并的检测效果的比较之二，本图为检测组合2通过荧光定量PCR方法检测4个浓度的临床样本稀释液(100、1000、10000、100000IU/ml)的结果图；
图4为本发明三组引物探针合并与两组引物探针分别合并的检测效果的比较之三，本图为检测组合3通过荧光定量PCR方法检测4个浓度的临床样本稀释液(100、1000、10000、100000IU/ml)的结果图；
图5为本发明三组引物探针合并与两组引物探针分别合并的检测效果的比较之四，本图为检测组合4通过荧光定量PCR方法检测4个浓度的临床样本稀释液(100、1000、10000、100000IU/ml)的结果图；
图6为本发明上述图2至图4中各组检测结果的合并图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于高灵敏地检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的特异性引物组。所述HBV核酸可以是HBVDNA，也可以是HBVRNA。在一个实施方式中，所述引物组包括至少一种选自以下的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的引物。
根据本发明的一个方面，所述引物对为特异性扩增HBVS区基因或HBVC区基因或HBVX区基因的引物。本发明的引物对包含正向引物和反向引物，其与HBV的基因序列互补且具有10-45个碱基的序列，优选15-35个碱基的序列。特别地，可用具有碱基序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对来特异性扩增HBVS区基因，可用具有碱基序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对来特异性扩增HBVC区基因，可用具有碱基序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对来特异性扩增HBVX区基因。所述引物可用本领域公知的方法进行修饰，此类修饰的非限定性实例包括甲基化、通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰、在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基或将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基等。当使用本发明提供的具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4以及SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物进行PCR扩增时，可以高灵敏度且高特异性地检测各个HBV基因型。因此，上述引物可以用于对HBV感染的诊断、对HBV病毒水平的长期监测和对HBV治疗药物疗效的评估。
本发明中，引物的具体序列描述在表1中。
表1
名称 碱基序列(5’-3’) 长度
SEQ ID NO.1 TGGATGTITCTGCGGCGTTITATC 24
SEQ ID NO.2 TAGAGGACAIACGGGCAACATAC 23
SEQ ID NO.3 GCAACTTTTTCACCTCTGCCTAITCA 26
SEQ ID NO.4 GGAAAGAAGTCAGIAGGCAAAAAIGAGA 28
SEQ ID NO.5 TCAGCGCATGCGIGGAICCTT 21
SEQ ID NO.6 CGCTCCAGACCIGCIICGAGC 20
本发明还涉及一种用于检测HBV核酸的特异性探针。在一个实施方式中，所述探针包括至少一种选自以下的探针，或者包括至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明还涉及用于检测无干扰性内标的探针，其具有如SEQIDNO.10所示的核苷酸序列，或者其反向互补序列。
所述探针与HBV的基因序列互补且具有12-50个碱基的序列，优选15-35个碱基的序列。特别地，可用具有碱基序列为SEQIDNO.7的探针来特异性检测引物组1扩增得到的产物，可用具有碱基序列为SEQIDNO.8的探针来特异性检测引物组2扩增得到的产物，可用具有碱基序列为SEQIDNO.9的探针来特异性检测引物组3扩增得到的产物。所述探针可用本领域公知的方法进行修饰，此类修饰的非限定性实例包括甲基化、通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰、在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基或将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基等。特别地，对探针的修饰还包括在5’端和/或3’端增加几个碱基使其形成某种二级结构，如分子信标的颈-环结构，但不限于此。
所述探针通过标记物来标记。在一个实施方式中，上述探针的一个末端(如5’末端或3’末端)标记荧光基团，且探针的另一个末端(如3’末端或5’末端)标记淬灭基团。所述的荧光基团可以是FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但不限于此；所述的淬灭基团可以是BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种，但不限于此。内标探针所标记的荧光基团不同于HBV探针所标记的荧光基团。
在本发明中，探针的具体碱基序列描述于表2中。
表2
名称 碱基序列(5’-3’) 修饰 长度
SEQ ID NO.7 TGAGGCAIAGCAGCAGGATGIAGAGG 5’FAM，3’BHQ1 26
SEQ ID NO.8 CCAAGCTGTGCCTTGGITGGCTTT 5’FAM，3’BHQ1 24
SEQ ID NO.9 CCTGCCIATCCATACIGCGGAACTCCT 5’FAM，3’BHQ1 27
SEQ ID NO.10 ACCAGACACACGCTCACACCTCCC 5’ROX，3’BHQ2 24
根据另一个方面，本发明还涉及一种用于高灵敏地检测HBV核酸的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7的探针；在另一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.8的探针；在再一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.8的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针。此外，所述组合物还包含对HBV检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO.10的内标探针，或者其反向互补序列。
具体地，所述用于HBV核酸检测的组合物包含特异于HBVS区基因的引物和探针，所述引物由具有碱基序列SEQIDNO.1的正向引物和/或具有碱基序列SEQIDNO.2的反向引物组成，所述探针由具有碱基序列SEQIDNO.7的探针组成。另外，所述组合物还包含特异于HBVC区的引物对和探针，所述引物由具有碱基序列SEQIDNO.3的正向引物和/或具有碱基序列SEQIDNO.4的反向引物组成，所述探针由具有碱基序列SEQIDNO.8的探针组成。此外，所述组合物还包含特异于HBVX区的引物对和探针，所述引物由具有碱基序列SEQIDNO.5的正向引物和/或具有碱基序列SEQIDNO.6的反向引物组成，所述探针由具有碱基序列SEQIDNO.9的探针组成。除此之外，本发明还提供了用于检测内标的组合物，其引物对为扩增HBVS区基因的引物对或扩增HBVC区基因的引物对或扩增HBVX区基因的引物对，其特异性探针为具有碱基序列SEQIDNO.10的探针。优选地，内标引物由具有碱基序列SEQIDNO.1的正向引物和/或具有碱基序列SEQIDNO.2的反向引物组成。在其它实施方式中，本发明还可包含作为内标的其它引物和探针序列。
与特异性检测单个或两个HBV基因的技术相比，本发明优选针对HBVS区基因、HBVC区基因和HBVX区基因的特异性引物和探针对样本中的HBV进行高特异性和高灵敏度地检测。对三个基因区段同时进行检测，能够避免由于其中一个或两个基因序列发生突变而出现的假阴性结果，从而提高了检测的灵敏度，降低了假阴性率，提高了检测结果的可靠性。
根据再一个方面，本发明还涉及一种用于高灵敏高特异地检测HBV核酸的试剂盒，其含有本发明中的上述至少一种引物组和/或上述至少一种探针。优选地，本发明的试剂盒包含引物组1和探针1、引物组2和探针2以及引物组3和探针3。进一步地，该试剂盒还含有碱基序列如SEQIDNO.10所示的内标探针，或者其反向互补序列。更进一步地，该试剂盒还含有内标、PCR反应预混液、强阳性质控品、临界阳性质控品及阴性质控品以及阳性定量参考品。所述PCR反应预混液包含PCR缓冲液、DNA聚合酶、UNG酶、dNTP、dUTP等。所述PCR缓冲液、DNA聚合酶、UNG酶、dNTP可以是相关领域内任一种常用的溶液和酶。优选地，DNA聚合酶可采用热启动Taq酶。
根据另一个方面，本发明还涉及一种用于检测HBV核酸的方法，所述方法包括：
(1)提取和纯化生物样本中的核酸：
(2)使用特异性检测HBV的组合物对生物样本中的HBV核酸进行扩增反应，以获得扩增产物，并进行特异性检测。
所述的生物样本包括来自于人体的组织、细胞、全血、血浆、血清、唾液、尿液、痰液，但不局限于此。本发明优选来自于人体的血液样本。
用于扩增HBV核酸的方法包括但不局限于PCR、NASBA、滚环扩增等，只要此方法使用本发明中所述的引物和/或探针。优选使用PCR方法对HBV基因进行扩增。PCR方法是本领域公知的方法，包括但不限于反转录PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR和实时荧光定量PCR等。优选使用实时荧光定量PCR方法对HBV核酸进行特异性扩增和定量检测。
本发明的目的、特征及优点将结合实施例，参照附图作进一步详细阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法进行。
具体实施例1
本发明所采用的材料如下所述：
1.试剂盒
本发明试剂盒包含以下组分：PCR反应预混液、HBVoligomix、内标、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品和定量校准品。
PCR反应预混液包含以下组分：10×PCR缓冲液、30mMMgCl2、2.5mMdNTP、0.5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶。
HBVoligomix包含以下组分：引物组1(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)、探针1(SEQIDNO.7)、引物组2(SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)、探针2(SEQIDNO.8)、引物组3(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)、探针3(SEQIDNO.9)以及内标探针(SEQIDNO.10)。
2.HBV标准品及样本
2.1WHO定量标准品
用WHO标准品(3rdWHOInternationalStandardforHepatitisBVirusforNucleicAcidAmplificationTechniques，NIBSCcode：10/264)进行制备。首先按照说明书要求用0.5mlDEPC水将标准品复融，得到850000IU/ml的样本。然后用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适的浓度。
2.2高值临床样本
由罗氏公司的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest(version2.0)试剂盒进行定量，使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适的浓度。
2.3A-G基因型样本
1stWHOInternationalReferencePanelforHepatitisBVirusGenotypesforNucleicAcidAmplificationTechniques-BasedAssays(PEIcode:5086/08)中的A-G基因型样本，使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适的浓度。
2.4HBV全基因组质粒
人工构建，含HBVC基因型的全长序列，使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适的浓度。
3.HBV质控品及定量校准品
3.1HBV阴性对照
市售阴性且外观澄清的血浆。
3.2HBV临界阳性质控品
使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在10～100IU/ml(溯源至WHO定量标准品)。
3.3HBV强阳性质控品
使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在104～105IU/ml(溯源至WHO定量标准品)。
3.4HBV定量校准品
包括SPC1～SPC5，使用市售阴性且外观澄清的血浆对HBV全基因组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度在102～107IU/ml之间(溯源至WHO定量标准品)，每个定量校准品浓度值相差10倍。
4.DNA样本的制备试剂盒
样本的提取纯化采用QIAGEN的QIAampDNAMiniKit(货号：51304)进行制备。
5.实验方法：
5.1HBVDNA样本的制备
使用QIAGEN的QIAampDNAMiniKit提取纯化待检样本、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品和定量校准品中的核酸。具体步骤如下：
1)在1.5ml离心管中加入20μl蛋白酶K。
2)在1.5ml离心管中加入200μl样本。
3)加入200μlAL缓冲液，振荡混匀15秒。
4)56℃温育10分钟。
5)短暂离心，收集管盖上的液体。
6)加入200μl无水乙醇，振荡混匀15秒并短暂离心。
7)将液体转移到离心柱中，8000rpm离心1分钟；将离心柱转移到一个新的2ml收集管中，丢弃废液。
8)在离心柱中加入500μlAW1缓冲液，8000rpm离心1分钟；将离心柱转移到一个新的2ml收集管中，丢弃废液。
9)在离心柱中加入500μlAW2缓冲液，14000rpm离心3分钟；将离心柱转移到一个新的2ml收集管中，丢弃废液。
10)14000rpm离心1分钟。
11)将离心柱转移到一个新的1.5ml离心管中，丢弃废液。加入50μlAE缓冲液，室温静置5分钟，8000rpm离心1分钟，收集纯化好的DNA。作好标记，得到的DNA样本在4℃保存备用。
5.2荧光定量PCR反应
在使用本发明试剂盒进行荧光定量PCR反应时，使用以下引物和探针：
引物组1：SEQIDNO.1TGGATGTITCTGCGGCGTTITATC
SEQIDNO.2TAGAGGACAIACGGGCAACATAC
探针1：SEQIDNO.7TGAGGCAIAGCAGCAGGATGIAGAGG(标记：5’FAM，3’BHQ1)
引物组2：SEQIDNO.3GCAACTTTTTCACCTCTGCCTAITCA
SEQIDNO.4GGAAAGAAGTCAGIAGGCAAAAAIGAGA
探针2：SEQIDNO.8CCAAGCTGTGCCTTGGITGGCTTT(标记：5’FAM，3’BHQ1)
引物组3：SEQIDNO.5TCAGCGCATGCGIGGAICCTT
SEQIDNO.6CGCTCCAGACCIGCIICGAGC
探针3：SEQIDNO.9CCTGCCIATCCATACIGCGGAACTCCT(标记：5’FAM，3’BHQ1)
内标探针：SEQIDNO.10ACCAGACACACGCTCACACCTCCC(标记：5’ROX，3’BHQ2)
按照表3配制HBVoligomix：
表3
名称 剂量(1个测试) 终浓度
SEQ ID NO.1 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.2 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.3 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.4 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.5 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.6 20pmol 0.4μM
SEQ ID NO.7 10pmol 0.2μM
SEQ ID NO.8 10pmol 0.2μM
SEQ ID NO.9 10pmol 0.2μM
SEQ ID NO.10 10pmol 0.2μM
DEPC水 加水至5μL /
按照表4配制荧光定量PCR反应液：
表4
名称 剂量(1个测试)
PCR反应预混液 5μL
HBV oligo mix 5μL
HBV DNA 40μL
反应条件如下：50℃2min；95℃5min；95℃5s，55℃30s，采集荧光(FAM，ROX)，50个循环；25℃1min。反应体系为50μL。
具体实施例2
本发明试剂盒的最低检出限(LOD)
使用实施例1中所述的WHO定量标准品，用阴性血浆稀释到10、5、3、2IU/ml。通过实施例1中所述的方法制备标准品DNA。使用本发明试剂盒对每个浓度的样本重复检测23次。计算各浓度下本发明试剂盒的检出率，从而确定最低检出限。结果如表5所示，显示3IU/ml样本的检出率可达到95.65％(22/23)，说明本发明试剂盒的最低检出限为3IU/ml。
表5
具体实施例3
本发明试剂盒的定量限(LOQ)
使用实施例1中的WHO定量标准品，用阴性血浆稀释到5、10、20、30IU/ml。通过实施例1中所述的方法制备标准品DNA。使用本发明试剂盒对每个浓度的样本重复检测10次。依照以下标准确定本发明试剂盒的定量限(LOQ)：计算定量结果的对数值及对数值的变异系数CV，并与理论值的对数值相比，计算两者的差值△Log，将△Log小于0.5视为定量准确。要求定量限浓度的样本全部检出、定量准确且CV小于10％。实验结果如表6所示，当样本浓度为10IU/ml时，本发明试剂盒的定量准确率为100％且CV值小于10％。因此，本发明试剂盒的定量限为10IU/ml。
表6
样本 检测次数 检出次数 准确检出次数 准确检出率(％) CV(％)
5IU/ml 10 10 9 90 15.23
10IU/ml 10 10 10 100 8.61
20IU/ml 10 10 10 100 7.11
30IU/ml 10 10 10 100 6.79
具体实施例4
本发明试剂盒的线性范围
取高浓度的临床样本(由罗氏公司的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest，version2.0试剂盒进行定量)，用阴性血浆进行梯度稀释(从4×108IU/ml至5IU/ml)。通过实施例1中所述的方法制备各浓度样本的DNA，每个浓度作3个重复，并用本发明试剂盒对所述DNA样本进行荧光定量PCR检测。通过以下标准判定线性范围：首先判断检测结果的准确度，计算每一样本浓度的对数值的绝对偏差(△Log)：△Log＝TLog-MLog(TLog为测试结果对数值，MLog为标示浓度对数值)，若该样本浓度的绝对偏差△Log不高于±0.5log值，且三个重复样本间的对数值的CV不高于10％，则此浓度样本的准确度符合要求，可用于线性范围分析。然后以符合要求的样本浓度标示值的对数值和Ct值，以浓度对数值为Yi，Ct值为Xi，进行线性拟合，计算其线性相关系数r，若|r|≥0.980，则该系列浓度处于本试剂盒的线性范围之内。检测结果如表7所示。
表7
从结果中可知，当样本浓度为5IU/ml时，其检测结果不符合准确度要求，故其不纳入线性范围之内。将10IU/ml～4×108IU/ml各浓度的数据进行拟合，得到本试剂盒的线性范围，结果如图1所示。
具体实施例5
本发明试剂盒对各种HBV基因型的检测结果
使用如实施例1中所述的来自HBV基因分型盘[1stWHOInternationalReferencePanelforHepatitisBVirusGenotypesforNucleicAcidAmplificationTechniques-BasedAssays(PEIcode:5086/08)]中的A-G基因型样本(不含H基因型)，用阴性血浆将各样本稀释至3IU/ml(原浓度参考分型盘说明书中的浓度)，按照实施例1中所述的方法制备DNA样本并使用本发明试剂盒进行荧光PCR定量检测，每个样本重复检测25次，计算每种基因型的检出率。结果如表8所示。从结果中可以看出，本发明试剂盒对A-G基因型样本的检出率均在95％以上，说明本发明试剂盒对A-G基因型均能检出，且检测限均为3IU/ml。
表8
具体实施例6
本发明试剂盒的精密度
将WHO定量标准品用阴性血浆稀释至2个不同的浓度：100IU/ml和5000IU/ml。通过实施例1中所述的方法制备各浓度样本的DNA，使用本发明试剂盒对各样本DNA进行荧光定量PCR检测。每个浓度的样本分别重复检测20次，计算每个浓度样本的定量检测结果对数值的平均值，并计算每个浓度样本的精密度：计算同一浓度样本检测结果对数值的变异系数(CV，％)(CV＝STD/平均值×100％，即分别计算检测结果对数值的标准偏差和平均值，然后用标准偏差除以平均值得到变异系数)。要求CV不高于5％。结果如表9所示。使用本发明试剂盒检测两个浓度的样本的变异系数(CV，％)均小于5％，说明本发明试剂盒具有较好的检测精密度。
表9
具体实施例7
本发明三组引物探针合并后检测效果的考察
将高浓度临床样本(由罗氏公司的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest，version2.0试剂盒进行定量)进行系列梯度稀释，得到100000、10000、1000、100IU/ml浓度的样本，按照实施例1中所述的方法对其进行DNA样本的制备。分别用表10中的检测组合1-4对各浓度样本进行检测。
表10
组别 检测引物 检测探针
检测组合1 引物组合1与引物组合2 探针1与探针2
检测组合2 引物组合1与引物组合3 探针1与探针3
检测组合3 引物组合2与引物组合3 探针2与探针3
检测组合4 引物组合1、引物组合2与引物组合3 探针1、探针2与探针3
检测组合1的结果如图2所示，检测组合2的结果如图3所示，检测组合3的结果如图4所示，检测组合4的结果如图5所示，各组的Ct值如表11所示。图6为四个检测组合结果的合并图。
表11
样本 检测组合1 检测组合2 检测组合3 检测组合4
100IU/ml 34.95 34.93 35.13 34.13
1000IU/ml 31.78 31.84 31.53 30.67
10000IU/ml 28.28 28.63 28.72 27.37
100000IU/ml 24.49 24.99 24.72 23.84
从所述结果可以看出，与同时检测两个基因区段的检测组合1、检测组合2和检测组合3相比，同时检测3个基因区段的检测组合4具有更高的荧光信号，相同样本浓度下具有更小的Ct值。Ct值为每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值(即图中黑色横线)时所经过的循环数。因此，检测组合4更有利于低浓度样本的检出，更有利于提高检测试剂的灵敏度。
使用实施例1中所述的WHO定量标准品，用阴性血浆稀释到5、3、2IU/ml。通过实施例1中所述的方法制备标准品DNA。分别用检测组合1、检测组合2、检测组合3和组合4对各样本进行检测，每组每个浓度重复检测20次。计算各浓度的检出率，结果如表12所示。由结果可知，与双基因的检测方法(检测组合1、检测组合2和检测组合3)相比，三基因的检测方法(检测组合4)对低浓度样本的检出率更高，其检测灵敏度更高。
表12
本领域的技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容许变化和修改，特别是等同的变化和修改。应该理解，所有这样的变化和修改均落入本发明，特别是权利要求中所限定的保护范围。

Claims (22)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物组，其特征在于：所述引物组包括至少一种选自以下所述的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物。
2.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的探针，其特征在于：所述探针包括至少一种选自以下的探针，或者包括至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上所述探针通过标记物来标记。
3.根据权利要求2所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的探针，其特征在于：用于检测HBV核酸的探针的一个末端标记荧光基团，且用于检测HBV核酸的探针的另一个末端标记淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的探针，其特征在于：所述用于检测HBV核酸的探针的一个末端标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种；所述用于检测HBV核酸的探针另一个末端标记的淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种。
5.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针，或者其反向互补序列。
6.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.7的探针。
7.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.8的探针。
8.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.9的探针。
9.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.8的探针。
10.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.7和SEQIDNO.9的探针。
11.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物对以及具有碱基序列SEQIDNO.8和SEQIDNO.9的探针。
12.根据权利要求5-11中任一权利要求所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述组合物还包含对HBV的检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO.10的内标探针，或者其反向互补序列。
13.根据权利要求12所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述内标探针的一个末端标记荧光基团，且该内标探针的另一个末端标记淬灭基团。
14.根据权利要求13所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物，其特征在于：所述内标探针的一个末端所标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种；且该内标探针一个末端所标记的上述荧光基团不同于用于检测HBV核酸的探针末端所标记的荧光基团。
15.一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含至少一种选自以下所述的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物。
16.根据权利要求15所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含至少一种选自以下的探针，或者包含至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上所述探针的一个末端标记荧光基团，且另一个末端标记淬灭基团，其中荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种；淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种。
17.根据权利要求15所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含有一条对HBV的检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO.10的内标探针，或者其反向互补序列，该内标探针的一个末端标记荧光基团，且该内标探针的另一个末端标记淬灭基团，其中所述内标探针的上述一个末端标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，且该内标探针所标记的荧光基团不同于用于检测HBV核酸的探针末端所标记的荧光基团。
18.根据权利要求15所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含有内标；PCR反应预混液；强阳性质控品、临界阳性质控品及阴性质控品；和阳性定量参考品。
19.根据权利要求18所述的用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应预混液含有PCR缓冲液、DNA聚合酶、UNG酶、dNTP和dUTP。
20.一种检测样本中乙型肝炎病毒核酸的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：
(1)提取和纯化样本中的核酸：
(2)使用下述任一引物组进行特异性扩增和/或使用下述任一探针进行特异性检测；
其中引物组为包括至少一种选自以下所述的引物组：
(1)引物组1，其包含具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物；和
(2)引物组2，其包含具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物；和
(3)引物组3，其包含具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物；
其中所述探针为包含至少一种选自以下的探针，或者包含至少一种以下序列的反向互补序列：
(1)探针1，其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；和
(2)探针2，其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；和
(3)探针3，其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；
以上所述探针的一个末端标记荧光基团，且另一个末端标记淬灭基团，其中荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种；淬灭基团为BHQ、TAMRA、MGB和DABCYL中的任一种。
21.根据权利要求20所述的检测样本中乙型肝炎病毒核酸的方法，其特征在于：所述特异性检测为PCR检测。
22.根据权利要求21所述的检测样本中乙型肝炎病毒核酸的方法，其特征在于：所述特异性检测为荧光定量PCR检测。
CN201510903524.6A 2015-12-08 2015-12-08 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法 Active CN105420410B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510903524.6A CN105420410B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510903524.6A CN105420410B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105420410A true CN105420410A (zh) 2016-03-23
CN105420410B CN105420410B (zh) 2018-09-21

Family

ID=55498945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510903524.6A Active CN105420410B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105420410B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593886A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN109777893A (zh) * 2019-04-02 2019-05-21 重庆医科大学附属儿童医院 微滴式数字pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒
CN109852731A (zh) * 2019-04-02 2019-06-07 重庆医科大学附属儿童医院 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用
CN109852732A (zh) * 2019-04-02 2019-06-07 重庆医科大学附属儿童医院 荧光定量pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒
CN111647689A (zh) * 2020-06-19 2020-09-11 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种乙型肝炎病毒检测的超敏定量试剂盒及检测方法
CN112725538A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944673A (zh) * 2006-06-12 2007-04-11 山东省医药生物技术研究中心 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法及专用试剂盒
CN102174660A (zh) * 2011-02-25 2011-09-07 湖南圣湘生物科技有限公司 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒
WO2013162109A1 (ko) * 2012-04-27 2013-10-31 (주)바이오니아 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944673A (zh) * 2006-06-12 2007-04-11 山东省医药生物技术研究中心 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测方法及专用试剂盒
CN102174660A (zh) * 2011-02-25 2011-09-07 湖南圣湘生物科技有限公司 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒
WO2013162109A1 (ko) * 2012-04-27 2013-10-31 (주)바이오니아 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593886A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒
CN109777893A (zh) * 2019-04-02 2019-05-21 重庆医科大学附属儿童医院 微滴式数字pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒
CN109852731A (zh) * 2019-04-02 2019-06-07 重庆医科大学附属儿童医院 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用
CN109852732A (zh) * 2019-04-02 2019-06-07 重庆医科大学附属儿童医院 荧光定量pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒
WO2020199441A1 (zh) * 2019-04-02 2020-10-08 重庆医科大学附属儿童医院 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用
CN111647689A (zh) * 2020-06-19 2020-09-11 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种乙型肝炎病毒检测的超敏定量试剂盒及检测方法
CN112725538A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN112725538B (zh) * 2021-02-22 2021-12-14 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105420410B (zh) 2018-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105400903A (zh) 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法
CN105420410A (zh) 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法
CN103642945B (zh) 一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN102230013B (zh) 检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒
CN105861743B (zh) 一种含内标的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和检测方法
CN104004856B (zh) 检测乙型肝炎病毒的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
CN101812537B (zh) 同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法及其试剂盒
CN110387439B (zh) 用于腺病毒检测与分型的引物和探针、试剂盒及方法
CN103710465A (zh) 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒
CN103255232A (zh) 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN104745689A (zh) 一种用于检测百日咳杆菌的引物、探针和试剂盒
CN103088151B (zh) 用于乙型肝炎病毒四色荧光定量pcr检测的试剂盒及应用
CN110241256A (zh) 一种多重定量检测eb病毒和巨细胞病毒的试剂盒
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN105039599A (zh) 分型定性检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN108531647A (zh) 一种寨卡病毒一步法荧光rt-PCR检测方法及试剂盒
CN103225000B (zh) 禽流感h7n9病毒检测试剂及检测试剂盒
CN104946769A (zh) 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒
CN111154920A (zh) 一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒及其专用引物探针组
CN110241264A (zh) 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒
CN105316349A (zh) 结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途
CN102086476A (zh) 多重荧光定量rt-pcr同时检测新甲型h1n1及人季节性h1n1和h3n2流感病毒
CN104745722A (zh) 一种用于检测水痘带状疱疹病毒的引物、探针和试剂盒
CN110184350B (zh) 用于预测乙肝患者肝癌易感性的引物、探针及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20160323

Assignee: Zhuhai Qiao Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: ZHUHAI LIVZON DIAGNOSTICS Inc.

Contract record no.: X2020990000124

Denomination of invention: Primer set, probe, reagent kit and detection method for detecting hepatitis B virus nucleic acid

Granted publication date: 20180921

License type: Common License

Record date: 20200323

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EC01 Cancellation of recordation of patent licensing contract

Assignee: Zhuhai Qiao Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: ZHUHAI LIVZON DIAGNOSTICS Inc.

Contract record no.: X2020990000124

Date of cancellation: 20240104

EC01 Cancellation of recordation of patent licensing contract