CN109852731A

CN109852731A - 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用

Info

Publication number: CN109852731A
Application number: CN201910259257.1A
Authority: CN
Inventors: 赵耀; 杨宇婷
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-06-07
Also published as: WO2020199441A1; US20220195542A1

Abstract

本发明提供一种引物探针组合及其试剂盒在HBV检测中的应用，其引物、探针组合选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合、X基因区引物探针组合中的至少一种。本发明通过在乙肝病毒S、C、X基因组保守序列分别设计引物探针，运用荧光定量PCR技术对HBV DNA进行同管同时检测，操作简便，快速，提高乙肝病毒检测方法的灵敏度、特异性，尽可能的降低因突变导致假阴性结果发生的几率，并且能进一步提高检测效率。

Description

引物探针组合及其试剂盒在HBV检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种引物探针组合及其试剂盒在HBV检测中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范围内具有严重危害的公共卫生问题之一，全球感染HBV的总人数曾高达20亿。乙肝病毒感染自被发现以来，一直受到较大关注，尤其是近些年来，慢性乙肝病毒感染，以及低病毒载量的隐匿性乙肝病毒感染(Occult HBV infection,OBI)潜在的临床危害越来越受到重视，大大增加了肝硬化、原发性肝癌、肝衰竭，HBV传播的风险，每年约有100万人死于与HBV感染相关的疾病。虽然自1982年有高效的乙肝疫苗问世，但仍有超过4.0亿慢性携带者，且75％的携带者居住在亚洲太平洋地区。中国的慢性乙肝病毒感染很严重，HBV携带者和HBsAg阳性患者占到了世界的1/3。

诊断乙肝病毒感染的金标准是对HBV DNA进行检测，并且HBV DNA定量检测对于乙肝病毒感染者的治疗非常重要。目前，大部分的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒主要采用一对引物和一条探针对HBV基因组中某段相对保守基因片段进行扩增检测，但是乙肝病毒的复制是以3.5kb大小的前基因组RNA为模板，由DNA聚合酶逆转录生成子代病毒负链DNA。由于RNA逆转录酶缺乏自动校正功能，乙肝病毒复制具有高突变率的特点，并且HBV患者长期的抗病毒药物治疗(如拉米夫定、阿德福韦)，体内的乙肝病毒可能发生耐药突变，如果相关碱基突变发生在目的片段，可能会导致相应片段无法正常扩增，从而造成对HBV DNA定量不准确，甚至出现假阴性的结果。

一般临床上通过检测血液中的病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)来判断是否存在HBV感染，然而，随着分子检测技术的发展，上世纪80年代首次发现HBsAg阴性个体中也可能存在(Hepatitis B Virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA)，这种特殊形式的慢性乙肝病毒感染被称为隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occut HBV infection，OBI)。

近年来随着研究的深入，OBI的临床危害越来越突出。有不少研究发现，隐匿性乙肝病毒感染与慢性肝脏疾病，肝硬化，肝细胞癌(HCC)等密切相关；隐匿性乙肝病毒可以通过输血，器官移植等方式传播；并且OBI患者如果接受免疫抑制治疗，发生乙肝病毒再激活的风险也会随之增大，所以对OBI患者进行及时准确的检测特别重要。

迄今为止，HBV DNA检测有很大进展，但是OBI检测尚无标准、有效、统一的方法。欧洲肝脏研究协会(European Association for the Study of the Liver，EASL)在2007年将巢式PCR(nested PCR)技术作为OBI诊断标准：从患者肝组织或血清/血浆样本中提取核酸，使用多组特异性引物对HBV不同基因序列进行扩增检测，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳观察，当结果至少出现两个不同基因片段扩增阳性(≥2)，提示可能存在OBI。然而，巢式PCR技术存在如下缺点：①操作繁琐，复杂，费时费力；②需要多对引物进行多次PCR扩增反应，增加污染的机会，并且需要的较大样本量；③扩增结果只能通过琼脂糖凝胶电泳进行定性分析。因此，巢式PCR技术并不适合OBI流行病学调查和临床的大规模推广使用。

现有HBV检测方法存在的如下问题：1)HBV的耐药突变造成检测结果不准确；2)HBV检测灵敏度低；3)无法满足OBI的检测需要的至少两个片段阳性的原则。

发明内容

本发明的目的在于提供一种引物探针组合及其试剂盒在HBV检测中的应用，用于解决现有技术中因体内乙肝病毒含量低，易发生碱基突变，造成HBV感染漏检，假阴性的发生，耐药突变，隐匿性HBV感染等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种引物探针组合，选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合、X基因区引物探针组合中的至少一种，所述S基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合S1：

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC(SEQ IDNO.1)；

含有如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：CATCCATAGGTTTTGTACAGCAAC(SEQ IDNO.2)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：AGGATCATCAACCACCAGCACGGG(SEQ IDNO.3)；

组合S2：

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：GTGTCTGCGGCGTTTATCA(SEQ ID NO.4)；

含有如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：CCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG(SEQ IDNO.5)；

含有如SEQ ID NO.6所示序列的探针：TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCC(SEQ IDNO.6)；

组合S3：

含有如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物：TGCCCGTTTGTCCTCTAATTCC(SEQ IDNO.7)；

含有如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：AGGTGCAGTTTCCATCCATAGG(SEQ IDNO.8)；

含有如SEQ ID NO.9所示序列的探针：TCATCAACCACCAGCACGGGACCA(SEQ IDNO.9)；

所述C基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合C1：

含有如SEQ ID NO.10所示序列的上游引物：AGCCTTAAAATCTCCTGAGCATTG(SEQ IDNO.10)；

含有如SEQ ID NO.11所示序列的下游引物：CAAATTATTACCCACCCAGGTAGC(SEQ IDNO.11)；

含有如SEQ ID NO.12所示序列的探针：TCACCACACAGCACTCAGGCAAGC(SEQ IDNO.12)；

组合C2：

含有如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物：AGGCAGGTCCCCTAGAAGAAG(SEQ IDNO.13)；

含有如SEQ ID NO.14所示序列的下游引物：ACATTGGGATTCCCGAGATTGAG(SEQ IDNO.14)；

含有如SEQ ID NO.15所示序列的探针：ACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGG(SEQ IDNO.15)；

组合C3：

含有如SEQ ID NO.16所示序列的上游引物：ATCAACACTTCCGGAAACTACTG(SEQ IDNO.16)；

含有如SEQ ID NO.17所示序列的下游引物：TTCCCGAGATTGAGATCTTCTGC(SEQ IDNO.17)；

含有如SEQ ID NO.18所示序列的探针：GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT(SEQ IDNO.18)；

所述X基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合X1：

含有如SEQ ID NO.19所示序列的上游引物：TGCACTTCGCTTCACCTCTG(SEQ IDNO.19)；

含有如SEQ ID NO.20所示序列的下游引物：TTGCTGAAAGTCCAAGAGTCCTC(SEQ IDNO.20)；

含有如SEQ ID NO.21所示序列的探针：CGCATGGAGACCACCGTGAACGCC(SEQ IDNO.21)；

组合X2：

含有如SEQ ID NO.22所示序列的上游引物：ACTTCGCTTCACCTCTGCAC(SEQ IDNO.22)；

含有如SEQ ID NO.23所示序列的下游引物：AGGTCGGTCGTTGACATTGC(SEQ IDNO.23)；

含有如SEQ ID NO.24所示序列的探针：AGACCACCGTGAACGCCCACCG(SEQ IDNO.24)；

组合X3：

含有如SEQ ID NO.25所示序列的上游引物：CACCTCTCTTTACGCGGACTC(SEQ IDNO.25)；

含有如SEQ ID NO.26所示序列的下游引物：AGTCCTCTTATGCAAGACCTTGG(SEQ IDNO.26)；

含有如SEQ ID NO.27所示序列的探针：TGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTG(SEQ IDNO.27)；

上述各探针还包括荧光染料和荧光淬灭剂。

可选地，所述S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合、X基因区引物探针组合是根据GenBank中登录的乙肝病毒标准株(accession number:X02763，D00329，X04615，X65259，X75657，X69798，AF160501，AY090454)的高度保守基因序列设计得来。

通过研究，本发明提供的引物组的特异性强、灵敏度好、检测效率高，可用于HBV的有效扩增，从而实现HBV的高效检测和准确定量。

可选地，所述荧光染料选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox、TET中的至少一种。

可选地，所述荧光淬灭剂选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ、TAMRA中的至少一种。

上述荧光染料和荧光淬灭剂的详细说明如下：

荧光染料：

VIC[VIC：绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白)]，所以VIC缩写可能是来源于Victoria；

FAM：6-Carboxy-fluorescein(6-羧基-荧光素)；

HEX：5-Hexachloro-flurescein(5-六氯-荧光素)；

Cy5：Indodicarbocyanine；

Rox：Carboxy-x-rhodamine(羧基-X-罗丹明)；

TET：5-Tetrachloro-fluorescein(5-四氯-荧光素)；

荧光淬灭剂：

BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3：Black Hole Quencher-1，Black Hole Quencher-2，BlackHole Quencher-3，即黑洞淬灭剂-1、黑洞淬灭剂-2、黑洞淬灭剂-3；

BBQ：Black Berry Quencher(黑莓猝灭剂)；

TAMRA：Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(四甲基-6-羧基罗丹明)。

上述荧光染料、荧光淬灭剂仅仅是部分列举，也可采用其他具有类似功能的试剂。

上述引物探针组合可以通过组合搭配，可用于单重单基因、双重双基因、三重三基因乙肝病毒检测。

本发明第二方面提供上述引物探针组合在制备乙肝病毒检测试剂中的应用。

可选地，所述乙肝病毒检测试剂包括单重单基因、双重双基因、三重三基因同管定量和/或定性检测试剂，三重三基因同管定量检测试剂灵敏度最高、特异性最好。

本发明第三方面提供含有上述引物探针组合的试剂盒。

可选地，所述试剂盒还包括荧光定量反应液。

可选地，所述荧光定量反应液包括缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶，该荧光定量反应液可以从市场上购买得到，具体可以是购自瑞士罗氏公司的2×PCR Probes Master荧光定量反应液等，当然，不限于上述公司，也可以购自美国ABI、BIO-RAD等公司。

可选地，荧光定量反应液的体积为5μL-10μL。

可选地，乙肝病毒S基因区681个核苷酸序列如(SEQ ID NO.28)所示。

可选地，乙肝病毒C基因区552个核苷酸序列如(SEQ ID NO.29)所示。

可选地，乙肝病毒X基因区465个核苷酸序列如(SEQ ID NO.30)所示。

根据研究目的的不同，选取的保守区位置不太相同，上述三个序列是我们通过比对、筛选得到的可以作为我们引物和探针序列设计的保守区序列。

可选地，所述试剂盒还包括模板、阳性参控品、阴性参控品中的至少一种。

可选地，所述模板选自标准阳性模板、人基因组DNA提取液中的任一种。

可选地，所述标准阳性模板为重组质粒。

可选地，所述标准阳性模板为：插入乙肝病毒全基因组3215个核苷酸特异序列的pLB-T载体质粒。

可选地，所述标准阳性模板的浓度为5×100～5×10⁵拷贝/μL，体积为3.5μL。

根据研究目的的不同，选取的保守区位置不太相同，上述两个序列是我们通过比对、筛选得到的可以作为我们引物和探针序列设计的保守区序列。

可选地，所述阳性参控品为乙肝病毒。

可选地，所述阳性参控品为从感染患者体内分离得到的乙肝病毒，具体地，进行克隆测序，运用NCBI比对工具进行比对，得到的阳性参控品为乙肝病毒核酸。

可选地，所述阴性参控品为水。

可选地，上游引物、下游引物的浓度均为0.5μM，体积为0.125-0.35μL。

可选地，荧光探针的浓度为0.2-0.5μM，体积为0.25-0.75μL。

本发明第四方面提供一种HBV荧光定量PCR检测的方法，包括如下步骤：

取荧光定量反应液、标准阳性模板稀释液和上述引物探针组合进行荧光定量PCR，绘制标准曲线；

取荧光定量反应液、待测样品DNA和引物探针组合进行荧光定量PCR，根据标准曲线，获得待测样品的HBV定量检测结果。

可选地，所述荧光定量PCR的反应程序包括：

1)预变性：95℃，时间为10min；

2)扩增：95℃，时间是10s；退火温度为62℃，时间30s；经过45个变性退火循环。

上述步骤由瑞士ROCHE公司的Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出。

本发明具有如下有益效果中的至少一种：

1、通过研究证明，本发明提供的引物组的特异性强、灵敏度高，可实现HBV的高效、灵敏、准确的定量。

2、S基因区、C基因区和X基因区的引物探针的荧光标记不同，可在同一试管中同时进行检测，方便迅速，高效，降低了试剂和人力成本。

3、同时对HBV三个基因区保守序列进行扩增，大大降低了假阴性结果的发生，提高检测的灵敏度，并适用于低载量的隐匿性乙肝病毒感染检测。

4、本发明提供的HBV DNA定量检测试剂盒定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性好，效率高；检测速度快，仅需一个小时，加上核酸的提取，共仅需2～3小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。

5、本发明可以对HBV DNA定量检测，不仅可以分别进行单管不同基因的检测，还可以多基因同时同管完成定量检测。

6、本发明适用于乙肝病毒感染的临床或实验室定量及定性检测，乙肝病毒感染的早期诊断，监视和预测乙肝病毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图2显示为本发明实施例2中检测HBV C基因区的扩增曲线示意图。

图3显示为本发明实施例3中检测HBV X基因区的扩增曲线示意图。

图4显示为本发明实施例4中双重双基因同管荧光定量PCR检测的程序设置图。

图5显示为本发明实施例4中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图6显示为本发明实施例4中检测HBV C基因区的扩增曲线示意图。

图7显示为本发明实施例5中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图8显示为本发明实施例5中检测HBV X基因区的扩增曲线示意图。

图9显示为本发明实施例6中三通道荧光同时检测的程序设置图。

图10显示为本发明实施例6中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图11显示为本发明实施例6中检测HBV C基因区的扩增曲线示意图。

图12显示为本发明实施例6中检测HBV X基因区的扩增曲线示意图。

图13a显示为本发明实施例8中S基因区扩增结果图。

图13b显示为本发明实施例8中C基因区扩增结果图。

图13c显示为本发明实施例8中X基因区扩增结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

乙肝病毒感染已被证实与肝硬化、原发性肝癌等疾病的发生发展密切相关，还可能增加相关临床危害，如通过输血、器官移植等传播HBV。

目前检测HBV DNA是诊断乙肝病毒感染的金标准，主要是针对HBV基因保守区域的特异性引物进行实时荧光定量PCR检测，而现有检测试剂盒一般只扩增一个基因区片段，如果目的扩增片段发生突变，则可能导致假阴性的发生。

为避免假阴性结果的出现，需要建立一种同时对HBV不同基因进行检测的方法，使其不会因为某一目标的检测片段突变后，出现不能检测的假阴性结果而影响对HBV感染的检测及判断。

因此，如果需要建立一种高灵敏度的HBV检测方法，必须解决这个问题，并且能够同时设置多个目的基因进行检测，这样既可以避免基因突变和检测逃逸，又能够高灵敏度地检测HBV感染的存在。

而荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，目前已广泛用于分子生物学和医学等研究领域。而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在科学研究和临床诊断中广泛使用。

本发明利用了荧光定量PCR的优点，设计了多重多基因(三重三基因)同管荧光定量PCR的检测方法，可以解决现有HBV检测方法存在的如下问题：

1、避免HBV的耐药突变造成结果不准确：如果HBV一个基因发生了耐药突变，还有两个基因和区段可以检测；

2、克服现有HBV检测灵敏度低的问题：如果HBV感染后病毒拷贝数不高，并且基因之间的拷贝数有差异，多重检测相当于是多保险；

3、克服无法满足隐匿性HBV感染(OBI)对阳性片段要求的问题：对于OBI的检测需要的至少两个片段阳性的原则，多重多基因的检测，完全可以达到。

基于这样的假设，我们建立了一种三重三基因的HBV DNA检测方法。

同时还考虑了以下一些因素：

1、检测的经济性，不增加太多的检测成本(同管检测多基因)。

2、检测的方便性，不增加太多的检测步骤(同管检测多基因)。

3、检测的准确性，不降低检测的准确性(荧光定量PCR方法)。

4、检测的时效性，不增加检测的耗时(同管检测多基因)。

5、检测的样本量，不增加检测需要的血清量(同管检测多基因)。

6、检测的复杂性，不需要检测操作人员另外培训(同样的荧光定量PCR方法)。

7、检测的灵敏度，并且具有更高的检测灵敏度(多基因的同时检测)。

本发明采用多对引物和探针组，不仅可以单管进行不同基因的检测，还可以同时同管对HBV不同基因保守序列，应用荧光定量PCR方法进行检测。本发明能够进一步提高HBVDNA检测方法的灵敏度，获得更为准确、有效的定量结果，为临床预防治疗方案的制定提供更有力的依据。

主要实验材料：

DNA提取试剂盒(QIAamp Viral DNA Mini Kit)，购自Qiagen公司；2×PCR ProbesMaster(荧光定量反应液，规格5ml)，购自罗氏公司，货号04707494001；大肠杆菌DH5α、质粒提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。

引物、探针根据GenBank中的乙肝病毒标准序列(accession number:X02763，D00329，X04615，X65259，X75657，X69798，AF160501，AY090454)，采用基于Smith Waterman算法的CLUSTAL X多序列比对软件进行比对分析，MEGA5.0软件，Oligo6.71软件进行分析，找出一些可以设计引物和探针的保守特异区域。在HBV DNA的S基因区、C基因区、X基因区的保守序列分别设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan探针，建立了一种快速、准确检测HBV DNA载量的高灵敏、特异性的多重多基因同管荧光定量PCR乙肝病毒检测方法。由上海英骏生物技术有限公司合成。

标准阳性模板为：插入乙肝病毒全基因组核苷酸特异序列的pLB载体质粒(采用的质粒提取试剂盒为pLB零背景快速克隆试剂盒，购自天根生化科技有限公司，具体是将乙肝病毒全基因组序列克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA)，然后，用分光光度计A₂₆₀定量并稀释至1×10⁸拷贝/μL。

阴性参控品为水。

阳性参控品是从患者体内分离得到的HBV，进行克隆测序，利用NCBI基因工具进行比对，得到阳性参控品乙肝病毒核酸。

以下实施例采用的序列如下：

实施例1

单重S基因区荧光定量PCR HBV定量检测

1.用蒸馏水溶解标准阳性模板，并将其倍比稀释为5×10⁵拷贝/μL、5×10⁴拷贝/μL、5×10³拷贝/μL、5×10²拷贝/μL、5×10¹拷贝/μL、5×10⁰拷贝/μL。

2.荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.35μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.35μL(0.5μM)，荧光探针0.75μL(0.2μM)，引物探针组选自组合S1，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如下：预变性：温度为95℃，时间是10min；变性：温度为95℃，时间是10s，退火：温度为62℃，时间是30s，45个变性退火循环，该步骤由瑞士ROCHE公司的Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出，结果见附图1。

实施例2

单重C基因区荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，C基因区引物组正向引物0.35μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.35μL(0.5μM)，荧光探针0.75μL(0.2μM)，引物探针组选自组合C1，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，结果见附图2。

实施例3

单重X基因区荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，X基因区引物组正向引物0.35μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.35μL(0.5μM)，荧光探针0.75μL(0.2μM)，引物探针组选自组合X1，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，结果见附图3。

实施例4

双重双基因同管荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.175μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.175μL(0.5μM)，荧光探针0.375μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.175μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.175μL(0.5μM)，荧光探针0.375μL(0.2μM)，引物探针组分别选自组合S1、C1，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，双通道荧光同时检测，设置如附图4。

S基因区扩增结果见附图5，C基因区扩增结果见附图6。

实验发现，双重双基因同管PCR检测方法的扩增效率与单重单基因荧光定量PCR，各基因区段目的片段扩增都能较好扩增，互不干扰。

实施例5

双重双基因同管荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.175μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.175μL(0.5μM)，荧光探针0.375μL(0.2μM)，X基因区引物组正向引物0.175μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.175μL(0.5μM)，荧光探针0.375μL(0.2μM)，引物探针组分别选自组合S1、X1，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，双通道荧光同时检测。

S基因区扩增结果见附图7，X基因区扩增结果见附图8。

实验发现，双重双基因同管PCR检测方法的扩增效率与单重单基因荧光定量PCR，三重三基因同管荧光定量PCR基本一致，各基因区段目的片段扩增都能较好扩增，互不干扰。

实施例6

多重多基因同管荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，X基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，S、C、X基因区引物探针组分别选自S1、C1、X1组合，标准阳性模板3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，三通道荧光同时检测，设置如附图9。

S基因区扩增结果见附图10，C基因区扩增结果见附图11，X基因区扩增结果见附图12。

实验发现，多重多基因同管荧光定量PCR隐匿性乙肝病毒检测方法的扩增效率与单重单基因荧光定量PCR基本一致，各基因区段目的片段扩增都能较好扩增，互不干扰。

实施例7

多重多基因同管荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，S基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，X基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，S、C、X基因区引物探针组分别选自S1、C1、X1组合，标准阳性模板7.0μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，三通道荧光同时检测。

实施例8

多重多基因同管荧光定量PCR检测HBV DNA特异性分析

本实施例探讨S、C、X基因区引物和探针组的特异性，利用建立的多重荧光定量PCR方法对人基因组DNA进行检测验证该方法的特异性。

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，X基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，S、C、X基因区引物探针组各自选自S1、C1、X1组合，人基因组DNA提取液作为模板，3.5μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，三通道荧光同时检测，扩增结果见附图13a、图13b、图13c，图13a显示为S基因区扩增结果图，图13b显示为C基因区扩增结果图，图13c显示为X基因区扩增结果图。

实施例9

多重多基因同管荧光定量PCR临床样本检测

使用DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取待测样本(血清/血浆标本取自感染科患者临床样本)的DNA，保存于4℃备用。

荧光定量PCR实验(10μL扩增反应体系)：荧光定量反应液5.0μL，S基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，X基因区引物组正向引物0.125μL(0.5μM)，X基因区引物组反向引物0.125μL(0.5μM)，荧光探针0.25μL(0.2μM)，S、C、X基因区引物探针各自选自S1、C1、X1组合，模板3.5μL；标准阳性模板系列稀释品用于制作标准曲线，阴性参控品水作为PCR反应的阴性对照，阳性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；待测样本设置3个重复，以保证实验的精确性和稳定性；荧光定量PCR反应参数如实施例1，三通道荧光同时检测。

通过比较待测样本和系列稀释标准阳性模板的标准曲线，对待测样本的起始拷贝数进行定量，样本1-23的检测结果见表1。

表1待测样本的定量检测结果

由表1的试验结果可知，PCR反应结束后荧光定量检测仪在阴性参控品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到控制范围内拷贝数的乙肝病毒，表明PCR反应系统正常。

通过对照标准曲线获得待测样本的乙肝病毒拷贝数，判定为乙肝病毒阳性，具体的数值(如7.97×10⁴)表示感染乙肝病毒的具体拷贝数。

对比例1

乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(购自上海复星长征医学科学有限公司，以下简称上海复星)检测实例

采用复星乙肝病毒定量检测试剂盒，产品名称：乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，医疗器械注册证编号：国械注准20173401101，对实施例6的23个样本进行检测，具体步骤按照试剂盒操作说明书进行，样品1-23的检测结果见表2。

表2待测样本的定量结果

样本	检测浓度(拷贝数/mL)
		待测样本1	2.95×10<sup>3</sup>
待测样本2	2.21×10<sup>3</sup>
		待测样本3	1.54×10<sup>3</sup>
待测样本4	3.60×10<sup>3</sup>
		待测样本5	2.23×10<sup>3</sup>
待测样本6	3.95×10<sup>3</sup>
		待测样本7	9.87×10<sup>3</sup>
待测样本8	3.52×10<sup>3</sup>
		待测样本9	6.30×10<sup>4</sup>
待测样本10	3.97×10<sup>4</sup>
		待测样本11	1.13×10<sup>4</sup>
待测样本12	7.70×10<sup>4</sup>
		待测样本13	1.25×10<sup>4</sup>
待测样本14	1.47×10<sup>4</sup>
		待测样本15	2.19×10<sup>5</sup>
待测样本16	1.21×10<sup>5</sup>
		待测样本17	1.27×10<sup>5</sup>
待测样本18	5.85×10<sup>6</sup>
		待测样本19	3.55×10<sup>6</sup>
待测样本20	2.49×10<sup>6</sup>
		待测样本21	5.69×10<sup>7</sup>
待测样本22	1.80×10<sup>7</sup>
		待测样本23	2.64×10<sup>7</sup>

对独立的HBV DNA阳性样本用乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(上海复星)进行分析，所有的检测样本均为HBV DNA阳性，但大部分待测样本不同基因区段定量检测浓度结果高于复星试剂盒，本发明的方法及试剂盒检测灵敏度更高。通过对同一样本的不同基因区段同时进行扩增，能进一步减少假阴性结果的发生。

综上所述，本发明通过在乙肝病毒S、C、X基因组保守序列分别设计引物探针，可以运用三重三基因荧光定量PCR技术对HBV DNA进行同管同时检测，操作简便，快速，提高乙肝病毒检测方法的灵敏度、特异性，尽可能的降低因突变导致假阴性结果发生的机率，能进一步提高检测效率，并且适用于低病毒载量的隐匿性乙肝病毒感染检测。

本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，可用于HBV DNA的有效扩增，从而可实现HBV感染的准确定量检测；本发明通过对HBV 3个不同基因组的高度保守片段同时进行扩增检测，有效减少假阴性等问题的发生，提高乙肝病毒检测的特异性；检测速度快，仅一个小时，加上核酸提取，共仅需2～3小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。本发明适用于HBV感染的临床或实验室定量检测，监视和预测HBV流行情况，以及对疗效进行及时检测和评估。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学附属儿童医院

<120> 引物探针组合及其试剂盒在HBV检测中的应用

<130> PCQYK193382

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1上游引物

<400> 1

ttgcccgttt gtcctctaat tc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1下游引物

<400> 2

catccatagg ttttgtacag caac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1探针

<400> 3

aggatcatca accaccagca cggg 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2上游引物

<400> 4

gtgtctgcgg cgtttatca 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2下游引物

<400> 5

cccgtttgtc ctctaattcc ag 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2探针

<400> 6

ttcctctgca tcctgctgct atgcc 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3上游引物

<400> 7

tgcccgtttg tcctctaatt cc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3下游引物

<400> 8

aggtgcagtt tccatccata gg 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3探针

<400> 9

tcatcaacca ccagcacggg acca 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1上游引物

<400> 10

agccttaaaa tctcctgagc attg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1下游引物

<400> 11

caaattatta cccacccagg tagc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1探针

<400> 12

tcaccacaca gcactcaggc aagc 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2上游引物

<400> 13

aggcaggtcc cctagaagaa g 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2下游引物

<400> 14

acattgggat tcccgagatt gag 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2探针

<400> 15

actccctcgc ctcgcagacg aagg 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3上游引物

<400> 16

atcaacactt ccggaaacta ctg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3下游引物

<400> 17

ttcccgagat tgagatcttc tgc 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3探针

<400> 18

ggcaggtccc ctagaagaag aact 24

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X1上游引物

<400> 19

tgcacttcgc ttcacctctg 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X1下游引物

<400> 20

ttgctgaaag tccaagagtc ctc 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X1探针

<400> 21

cgcatggaga ccaccgtgaa cgcc 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X2上游引物

<400> 22

acttcgcttc acctctgcac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X2下游引物

<400> 23

aggtcggtcg ttgacattgc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X2探针

<400> 24

agaccaccgt gaacgcccac cg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X3上游引物

<400> 25

cacctctctt tacgcggact c 21

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X3下游引物

<400> 26

agtcctctta tgcaagacct tgg 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X3探针

<400> 27

tgccttctca tctgccggac cgtg 24

<210> 28

<211> 681

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S基因区

<400> 28

atggagaaca tcacatcagg attcctagga ccccttctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120

tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180

tcaccaacct cttgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcct caacaaccag cacgggacca 360

tgccggacct gcatgactac tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc 420

aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa 480

ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacattta a 681

<210> 29

<211> 552

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C基因区

<400> 29

atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60

tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120

gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180

tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240

tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300

ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360

tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420

tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480

ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540

tctcaatgtt ag 552

<210> 30

<211> 465

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> X基因区

<400> 30

atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc 60

gtcggcgctg aatcctgcgg acgacccttc tcggggtcgc ttgggactct ctcgtcccct 120

tctccgtctg ccgttccgac cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc 180

tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag 240

accaccgtga acgcccacca aatattgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc 300

tcagcaatgt caacgaccga ccttgaggca tacttcaaag actgtttgtt taaagactgg 360

gaggagttgg gggaggagat taggttaaag gtctttgtac taggaggctg taggcataaa 420

ttggtctgcg caccagcacc atgcaacttt ttcacctctg cctaa 465

Claims

1.一种引物探针组合，其特征在于，选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合、X基因区引物探针组合中的至少一种，所述S基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合S1：

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC(SEQ ID NO.1)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：AGGATCATCAACCACCAGCACGGG(SEQ ID NO.3)；

组合S2：

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：GTGTCTGCGGCGTTTATCA(SEQ ID NO.4)；含有如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：CCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG(SEQ ID NO.5)；

含有如SEQ ID NO.6所示序列的探针：TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCC(SEQ ID NO.6)；

组合S3：

含有如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物：TGCCCGTTTGTCCTCTAATTCC(SEQ ID NO.7)；

含有如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：AGGTGCAGTTTCCATCCATAGG(SEQ ID NO.8)；

含有如SEQ ID NO.9所示序列的探针：TCATCAACCACCAGCACGGGACCA(SEQ ID NO.9)；

所述C基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合C1：

含有如SEQ ID NO.12所示序列的探针：TCACCACACAGCACTCAGGCAAGC(SEQ ID NO.12)；

组合C2：

含有如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物：AGGCAGGTCCCCTAGAAGAAG(SEQ ID NO.13)；

含有如SEQ ID NO.15所示序列的探针：ACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGG(SEQ ID NO.15)；

组合C3：

含有如SEQ ID NO.18所示序列的探针：GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT(SEQ ID NO.18)；

所述X基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合X1：

含有如SEQ ID NO.19所示序列的上游引物：TGCACTTCGCTTCACCTCTG(SEQ ID NO.19)；

含有如SEQ ID NO.21所示序列的探针：CGCATGGAGACCACCGTGAACGCC(SEQ ID NO.21)；

组合X2：

含有如SEQ ID NO.22所示序列的上游引物：ACTTCGCTTCACCTCTGCAC(SEQ ID NO.22)；

含有如SEQ ID NO.23所示序列的下游引物：AGGTCGGTCGTTGACATTGC(SEQ ID NO.23)；

含有如SEQ ID NO.24所示序列的探针：AGACCACCGTGAACGCCCACCG(SEQ ID NO.24)；

组合X3：

含有如SEQ ID NO.25所示序列的上游引物：CACCTCTCTTTACGCGGACTC(SEQ ID NO.25)；

含有如SEQ ID NO.27所示序列的探针：TGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTG(SEQ ID NO.27)；

上述各探针还包括荧光染料和荧光淬灭剂。

2.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于：所述荧光染料选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox、TET中的至少一种。

3.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于：所述荧光淬灭剂选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ、TAMRA中的至少一种。

4.根据权利要求1-3任意一项所述引物探针组合在制备乙肝病毒检测试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述乙肝病毒检测试剂包括单重单基因、双重双基因、三重三基因同管定量和/或定性检测试剂。

6.含有权利要求1-3任意一项所述引物探针组合的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包括荧光定量反应液。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包括模板、阳性参控品、阴性参控品中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述模板选自标准阳性模板、人基因组DNA提取液中的任一种。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性参控品为乙肝病毒，所述阴性参控品为水。