CN116479182B - 一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒。引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，使用引物组配制PCR扩增体系和测序体系，经过PCR扩增反应和测序反应，再进行测序，获得HBV前C区及核心启动子区突变信息。本发明优点包括：针对HBV前C区及核心启动子区，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前C区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前C区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/mL。

Description

一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测 方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及检测HBV基因技术领域，尤其涉及检测HBV前C区基因突变技术。
背景技术
乙型肝炎病毒英文简称HBV，有文献报道其与肝细胞肝癌、肝硬化有显著相关。HBV基因组复制时会先转录为RNA中间体，而聚合酶不能校正，导致了高突变。高变异率对HBV有效治疗来说是个不小的挑战，基因组多态性会影响乙肝诊断、治疗、预后。HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异，可导致HBeAg阴性而病毒持续复制，仅凭血清HBeAg水平并不能判断病毒复制情况，因此容易错过早期干预治疗的时机；变异也会使HBV发生耐药，是影响药物持续疗效的一个重要因素。一些临床上使用的抗HBV药物在患者身上经过一段用药时间后会出现用药无效的情况，因而症状发生恶化；也加大慢性肝炎、肝硬化、癌变倾向的概率。
因此，检测HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异对评估乙肝患者预后有一定价值，可用于联合评估肝病进展风险，拟定治疗方案及严格的随访策略，对防止或早期发现肝癌有一定临床价值，但是准确检测HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异还是存在困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒，以解决现有技术中不能完整、灵敏准确检测出HBV前C区(precore，PC)及核心启动子(CP)区的常见变异的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组，包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
更优地，还包括测序PCR引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种所述的引物组在制备用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种包含所述引物组的用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂盒，包含：
PCR反应液，其包括含Mg2+的10×PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
Bigdye；
Bigdye buffer；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种应用所述的引物组检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
一种包含所述的引物组的扩增体系，包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL。
一种应用所述的扩增体系的扩增方法，扩增程序为：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。
一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，
PCR扩增体系包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL；
测序PCR体系包括：
PCR产物XμL，X取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值1-2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值4-5；
Bigdye 2μL；
Bigdye buffer 3μL；
测序引物1μL；
无菌水14-XμL；
测序引物如SEQ ID NO.3所示。
一种应用所述的扩增测序体系检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，过程如下：
(1)提取HBV核酸作为模板；
(2)配制PCR扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温；
(3)配制测序PCR体系，按如下程序进行测序PCR反应：96℃预变性1min；96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；4℃保温；
测序PCR产物纯化及Sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。
本发明的优点包括：针对HBV前C区及核心启动子区，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前C区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前C区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/mL。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是某阳性样本的部分测序峰图；
图2是实施例二的胶图；
图3是实施例三的胶图；
图4是实施例四的胶图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
1.实验材料
试剂：
核酸提取试剂(磁珠法，达安DA623)
DNAPolymerase(Mg2+plus)(P401-MD1，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)
BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(4337456，赛默飞世尔科技公司)
HiDi Formamide(4404307，赛默飞世尔科技公司)
NaAc(3M，PH 5.2，R00738，Leagene)
EDTA(AM9260G，Invitrogen)
无水乙醇(AR(分析纯)，广东光华化学厂有限公司)
扩增引物如SEQ ID NO.1～2所示
测序引物SEQ ID NO.3所示
设备及耗材：
PCR仪(veriti，ABI)、高速冷冻离心机(75007201，赛默飞世尔科技公司)、振荡器(Lab daucer)、移液器(17014422，瑞宁)、测序仪(3500xl Dx，ABI)、-20℃/-80℃冰箱(Haier)、通风柜(广州汇绿实验设备有限公司)、生物安全柜(BioBase)、移液吸头(Axygen)、50mL离心管(BIOFIL)、1.5mL离心管(Axygen)
2.实验步骤
1)HBV样本核酸提取：病毒载量浓度高于1×104copies/mL的样本，请采用全自动磁珠提取，按照试剂盒说明书进行操作；而病毒载量浓度低于1×104copies/mL的样本，请采用柱法提取，将提取的样本量加大到500μL并用30μL洗脱液收集核酸，其他操作按照试剂盒说明书即可；
2)体系配制及PCR扩增：按照表1配制PCR扩增体系，体系配制完成后在PCR扩增体系加入20μL提取好的HBV样本核酸，按照表2的程序进行PCR扩增。
表1PCR扩增体系
所述PCR反应液包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；所述PCR酶系包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐。
表2PCR扩增程序
3)PCR扩增产物分析与纯化，PCR扩增结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，若有约344bp目的条带，则用商品化的PCR产物纯化试剂盒继续进行PCR产物纯化；
4)测序PCR：测序引物如SEQ ID NO.3所示，按照表3配制一个测序PCR体系，按照表4的程序进行测序PCR反应：
表3测序PCR体系
表4测序PCR反应程序
5)测序PCR产物纯化及测序：使用酒精沉淀法对测序PCR产物进行纯化，然后上机ABI 3500xl Dx测序仪进行测序，如图1所示的出峰整齐没有杂乱，可以判断实验过程顺利；
6)结果分析，将测序所得的碱基序列进行突变位点查找，得到相关的突变类型信息。结果如表5所示。
位点：目标碱基位点；
碱基变化：目标碱基位点野生型碱基及主要突变碱基型；
查找序列：目标碱基位点前/后高度保守序列，方便定位查找目标碱基位点；如果不能找到此序列，可能样本序列个别碱基发生突变情况，可根据该序列所在位置人工搜查后校正序列；
目标碱基：依据查找序列定位的目标碱基具体位置；
测序情况：该位点的碱基信息。
表5
位点 碱基变化 查找序列 目标碱基 测序情况
1753 1753T＞A GGGGGGAGG 后第4个碱基 T
1762 1762A＞T GGGGGGAGG 后第13个碱基 A
1764 1764G＞A GGGGGGAGG 后第15个碱基 G
1766 1766C＞T GGGGGGAGG 后第17个碱基 C
1768 1768T＞A GGGGGGAGG 后第19个碱基 缺失
1846 1846A＞T CATGTCC 前第5个碱基 A
1858 1858C＞T CATGTCC 后第1个碱基 T
1896 1896G＞A TGGCTTT 后第1个碱基 G
实施例二
选取5个HBV阳性样本做待测组，上述HBV阳性样本的实验组编号依次为1、2、3、4、5；500copies/mL，B型的HBV样本为阳性对照PC，无HBV病毒的胎牛血清做阴性对照NC。参照实施例一进行PCR扩增、测序PCR及结果分析，结果如图2所示，阴性对照NC没有出现条带，编号为1-5的实验组及阳性对照组均出现了长度约344bp的目的条带。此外，测序结果显示扩增片段均为HBV前C区区域。说明本发明的PCR体系扩增具有较好的稳定性。
实施例三
选取5个不同病毒载量的HBV样本作实验组，5个HBV样本的病毒载量分别为10000copies/mL、5000copies/mL、1800copies/mL、600copies/mL、200copies/mL，实验组编号为1-5，500copies/mL，B型的HBV样本为阳性对照PC，无HBV病毒的胎牛血清做阴性对照组NC，参照实施例一的方法进行PCR扩增、测序PCR及结果分析，结果如图3所示，阴性对照没有出现条带，编号为1-5实验组均出现了长度约344bp的目的条带。此外，测序结果显示扩增片段均为HBV前C区区域。说明本发明反应灵敏度可以达到200copies/mL。
实施例四
选1个HBV样本血浆，样本分4份，一份不加任何物质，一份加入甘油三酯至终浓度37mmol/L，一份加血红蛋白至终浓度2g/L，一份加胆红素至终浓度342μmol/L；选择HIV-1血浆、HCV血浆，然后各取200μL提取核酸。
然后参考实施例一，将各核酸样品进行PCR实验，每个样本都做复孔，结果如图4所示，1-2：不加干扰物质的HBV核酸，3-4加甘油三脂的HBV核酸、5-6加血红蛋白的HBV核酸、7-8加胆红素的HBV核酸、9-10为HIV-1核酸，11-12为HCV核酸。1-8均出现长度约344bp的明亮条带，9-12并没有出现条带。
将各PCR产物进行纯化，然后测序，从测序结果看，1-8均测序成功，经分析均为HBV的序列，且序列经比对完全一致，9-12均无测序信号，本发明特异性好，且不受其他干扰物质影响。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组，其特征在于：
包括PCR扩增引物和测序PCR引物，所述PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示；所述测序PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种如权利要求1所述的引物组在制备基于Sanger测序法的用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种非诊断和治疗目的的使用如权利要求1所述的引物组检测HBV前C区及核心启动子区突变的方法，其特征在于：
步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述扩增反应的扩增程序为：95℃ 5分钟预变性；然后按“94℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。
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