CN116732243A - 一种用于检测hbv前s/s区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种用于检测hbv前s/s区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒。引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示，使用引物组配制PCR扩增体系和测序体系，经过PCR扩增反应和测序PCR反应，再进行测序，获得HBV前S/S区基因突变信息。本发明的优点有：采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，扩增产物能有效覆盖指南及文献报道的前S/S区热点突变位点，而且PCR扩增反应的灵敏度可以达到1000copies/μl。

Description

一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其 试剂盒
技术领域
本发明涉及检测HBV基因技术领域，尤其涉及检测HBV前S/S区基因突变技术。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B)属嗜肝DNA病毒科，缩写为HBV。HBV基因的前S/S区负责编码乙肝病毒包膜蛋白。HBV基因的前S/S区包括前S1区、前S2区、S区。前S/S区编码的产物除了参与乙肝病毒装配，还具有免疫原性、反式激活剂的功能。HBV复制时存在逆转录行为，容易发生突变，持续感染HBV导致基因组突变累积，难免出现免疫逃避以及加重肝细胞损伤现象。
HBV前S/S区缺失突变可能与肝癌发生有关；HBV前S/S区的s118、s120、s126、s127、s129、s131、s133、s143、s144、s145位点突变与免疫逃避有关，可导致乙肝慢性化及肝病进展。HBV前S/S区突变检测对评估乙肝患者预后有一定价值，可用于联合评估肝病进展风险，拟定治疗方案及严格的随访策略，对防止或早期发现肝癌有一定临床价值。然而现有突变检测技术不能准确获悉上述突变相关信息，这对肝病预防、治疗等都造成了制约。因此研发一项HBV前S/S区突变检测技术，准确获悉HBV前S/S区突变信息是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒，以解决现有技术中不能准确提供HBV前S/S区基因突变信息的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步地，还包括测序引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示。
本发明还提供一种所述的引物组在制备用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种包含所述的引物组的用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂盒，包含：
PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
PCR反应液，其包括含Mg2+的PCRbuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物组；
Bigdye；
Bigdye buffer；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示的测序引物。
本发明还提供一种应用所述的引物组检测HBV前S/S区基因突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3～6所示的引物作为测序引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
本发明还提供一种包含所述的引物组的扩增体系，包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQID NO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL。
本发明还提供一种应用所述的扩增体系的扩增方法，扩增程序为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温。
本发明还提供一种包含所述的引物组的扩增测序体系，PCR扩增体系包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQID NO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL；
测序PCR体系包括：
PCR产物Xμl，X的取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值1-2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值4-5；
Bigdye 2μl；
Bigdye buffer 3μl；
测序引物1μl；
无菌水14-Xμl；
测序引物如SEQ ID NO.3～6所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，配制4个测序PCR体系。
本发明还提供一种应用所述的扩增测序体系检测HBV前S/S区基因突变的方法，过程如下：
(1)提取HBV核酸作为模板；
(2)配制PCR扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温；
(3)配制测序PCR体系，按如下程序进行测序PCR反应：96℃预变性1min；96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；4℃保温；
(4)测序PCR产物纯化及Sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。
本发明的优点包括：针对HBV前S/S区基因，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前S区和S区基因突变，扩增总长度约为1400bp，包含前S1区108个氨基酸、前S2区55个氨基酸及S区226个氨基酸，能有效覆盖指南及文献报道的前S/S区热点突变位点，而且灵敏度可以达到1000copies/μl。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1-4是某阳性样本的4个测序峰图的开头片段；
图5是实施例二的胶图；
图6是实施例三的胶图；
图7是实施例四的胶图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
1.实验材料
试剂：
核酸提取试剂(磁珠法，达安DA0623)；
DNA Polymerase(Mg2+plus)(P401-MD1，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；
BigDyeTMTerminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(4337456，赛默飞世尔科技公司)；
HiDi Formamide(4404307，赛默飞世尔科技公司)；
NaAc(3M，PH 5.2，R00738，Leagene)；
EDTA(AM9260G，Invitrogen)；
无水乙醇(AR(分析纯)，广东光华化学厂有限公司)；
测序引物SEQ ID NO.1～6；
本发明针对HBV前S/S区基因，设计特异性PCR扩增引物和测序引物，见表1，PCR扩增引物如SEQ ID NO.1～2所示，测序引物如SEQ ID NO.3～6所示。
表1引物信息
设备及耗材：
PCR仪(veriti，ABI)、高速冷冻离心机(75007201，赛默飞世尔科技公司)、振荡器(Lab daucer)、移液器(17014422，瑞宁)、测序仪(3500xl Dx，ABI)、-20℃/-80℃冰箱(Haier)、通风柜(广州汇绿实验设备有限公司)、生物安全柜(BioBase)、移液吸头(Axygen)、50ml离心管(BIOFIL)、1.5ml离心管(AXYGEY)。
2.实验步骤
1)HBV样本核酸提取：病毒载量浓度高于1×104copies/ml的样本，请采用全自动磁珠法提取，按照试剂盒说明书进行操作；而病毒载量浓度低于1×104copies/ml的样本，请采用柱法提取，将提取的样本量加大到500μl并用30μl洗脱液收集核酸，其他操作按照试剂盒说明书即可；
2)体系配制及PCR扩增：按照表2配制PCR扩增体系，然后在PCR扩增体系加入20μL提取好的HBV样本核酸，按照表3的程序进行PCR扩增。
表2 PCR扩增体系
所述PCR反应液包括10×PCRbuffer(含Mg2+)5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；PCR酶系包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐。
表3 PCR扩增程序
3)PCR扩增产物分析与纯化，PCR扩增结束后，取5μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若有约1400bp目的条带，则用商品化的PCR产物纯化试剂盒继续进行PCR产物纯化；
4)测序PCR：测序引物如SEQ ID NO.3～6所示，共4条测序引物，每条测序引物按照表4单独配制一个测序PCR体系，同一HBV核酸样本需做4个测序PCR反应，测序PCR反应按照表5的程序进行；
表4测序PCR体系
表5测序PCR反应程序
5)测序PCR产物纯化及测序：使用酒精沉淀法对测序PCR产物进行纯化，然后上机ABI 3500xl Dx测序仪进行Sanger测序，如图1-4所示，选择某阳性样本的4个测序峰图的开头片段，图1-4的出峰整齐没有杂乱，可以判断试验过程顺利；
6)结果分析，将测序所得的4条序列使用具有拼接功能的软件进行序列拼接，得到完整fasta格式序列，再与参考序列(AB033554)进行碱基序列比对，得到相关的位点突变信息。
实施例二
选取5个HBV阳性样本做待测组，上述HBV阳性样本的实验组编号依次为1、2、3、4、5；无HBV的胎牛血清做阴性对照NC；参照实施例一的方法进行PCR扩增，结果如图5所示，阴性对照NC没有出现条带。编号为1、2、3、4、5的实验组均出现了长度约1400bp的目的条带。说明本发明的PCR体系扩增具有较好的稳定性。
参照实施例一方法将经纯化后的PCR产物进行测序PCR反应，纯化测序PCR产物然后进行测序分析，结果如表6-10所示，表6-10中清晰显示：编号为2、3、4的HBV无插入突变，无位点突变；编号为1、5的HBV在143位点存在突变，突变为S143T；编号为5的HBV在118位点为无义突变。
表6
表7
表8
表9
表10
实施例三
选取5个不同病毒载量的HBV样本作实验组，5个HBV样本的病毒载量分别为1000copies/μl、2000copies/μl、3000copies/μl、4000copies/μl、5000copies/μl，实验组编号为1-5，无HBV病毒的胎牛血清做阴性对照组NC，参照实施例一的方法进行PCR扩增，结果如图6所示，阴性对照没有出现条带，编号为1-5实验组均出现了长度约1400bp的目的条带。说明本发明反应灵敏度可以达到1000copies/μl。
实施例四
选1个HBV样本血清，样本分4份，一份不加任何物质，一份加入甘油三酯至终浓度37mmol/L，一份加血红蛋白至终浓度2g/L，一份加胆红素至终浓度342μmol/L；选择HIV-1血清、HCV血浆，然后各取200μl提取核酸，
然后参考实施例一，将各核酸样品进行PCR实验，每个样本都做复孔，结果如图7所示，1-2：不加干扰物质的HBV核酸，3-4加甘油三脂的HBV核酸、5-6加血红蛋白的HBV核酸、7-8加胆红素的HBV核酸、9-10为HIV-1核酸，11-12为HCV核酸。1-8均出现长度约1400bp的明亮条带，9-12并没有出现条带。
将各PCR产物进行纯化，然后测序，从测序结果看，1-8均测序成功，经分析均为HBV的序列，且序列经比对完全一致，9-12均无测序信号，因此认为，本发明特异性好，且不受其他干扰物质影响。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，其特征在于：
包括PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测HBV前S/S区基因突变的引物组，其特征在于：
还包括测序引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示。
3.一种如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂或试剂盒中的应用。
4.一种包含如权利要求2所述的引物组的用于检测HBV前S/S区基因突变的试剂盒，其特征在于：
包含：
PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
PCR反应液，其包括含Mg2+的PCRbuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物组；
Bigdye；
Bigdye buffer；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示的测序引物。
5.一种应用如权利要求2所述的引物组检测HBV前S/S区基因突变的方法，其特征在于：
步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.3～6所示的引物作为测序引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
6.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：
包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCR buffer 5μL，10mM dNTPs1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL。
7.一种应用如权利要求6所述的扩增体系的扩增方法，其特征在于：
扩增程序为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温。
8.一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，其特征在于：
PCR扩增体系包括：
PCR酶系3μL，其包括热启动Taq酶2.5U，剩余用甘油和水补齐；
PCR反应液27μL，其包括含Mg2+的10×PCR buffer 5μL，10mM dNTPs1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL,10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
HBV样本核酸20μL；
测序PCR体系包括：
PCR产物Xμl，X的取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值1-2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值4-5；
Bigdye 2μl；
Bigdye buffer 3μl；
测序引物1μl；
无菌水14-Xμl；
测序引物如SEQ ID NO.3～6所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，配制4个测序PCR体系。
9.一种应用如权利要求8所述的扩增测序体系检测HBV前S/S区基因突变的方法，其特征在于：
过程如下：
(1)提取HBV核酸作为模板；
(2)配制PCR扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟30秒，40个循环；72℃延伸7分钟；4℃保温；
(3)配制测序PCR体系，按如下程序进行测序PCR反应：96℃预变性1min；96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；4℃保温；
(4)测序PCR产物纯化及Sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。
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