CN107475461A - 一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。本发明的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物是针对HBV YMDD突变位点，在保守区域设计而得的，特异性强，灵敏度高；本发明的检测方法是基于Sanger测序技术进行的，可以检测六种药物的主要的耐药突变位点，并且可以检测到143到180位点区间内的所有突变，检测结果更加准确，也可以发现该区间内的新突变位点，有助于进一步指导药物的使用。

Description

一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于Sanger测序技术检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，是导致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。基因组长3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV的抵抗力较强。乙型肝炎病毒感染已成为全球严重的公共卫生问题，严重危害着人类的健康。全球约有20亿HBV感染者，其中约有4亿将发展为乙肝，全球每年约有60万人死于与HBV感染相关的疾病。乙肝患者在治疗过程中，曾经采用了大量的药物进行抗病毒治疗，而且，在机体进行药物的治疗的过程中，乙肝病毒基因也在发生着快速的变异，乙肝患者用药很可能会导致乙肝病毒的定向变异，从而产生乙肝病毒的耐药性。

目前最主要的药物是干扰素和核苷类药物。主要核苷类药物有：拉米夫定(通过干扰病毒的复制结合位点(乙肝病毒进行逆转录的活性部位YMDD)204位点，如果长期服用该药物会出现耐药性，变异多发生于酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)位点，YMDD变异是204位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或者异亮氨酸(I)所取代，改变了HBVDNA聚合酶的亚结构，产生了耐药使得血清中已经阴转的乙肝病毒DNA重新出现，肝功能异常甚至伴有病情的突发)、阿德福韦酯(相关的耐药突变多为多点突变，主要耐药位点为rt181、rt236)、恩替卡韦(耐药突变主要发生在169、180、184、202、204、250位点)、替比夫定(耐药突变主要发生在204位点)、恩曲他滨(耐药突变主要发生在173、180、204位点)和替诺福韦(耐药突变主要发生在194位点)等。

对乙肝患者进行乙肝病毒变异检测，可以更加准确的了解乙肝患者的病情，对症下药，避免盲目用药现象出现，同时还能够以检查结果为依据，判断治疗效果，根据患者的具体病情对患者制定最佳的治疗方案，有利于患者病情早日康复。目前市场主要的检测耐药基因的技术有：

1.PCR-限制性酶切片段多态性片段分析(PCR-RFLP)：PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。DNA限制性内切酶具有识别特定的DNA序列并在特定的部位切断DNA双链的活性功能，DNA分子由于突变(核苷酸的置换、插入或缺失)改变(或形成)了限制性内切酶识别序列，使DNA限制性内切酶不能(或可以)将靶DNA片段切断，电泳检测时，存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段变成短片段；不存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段长度将不发生变化。该方法实验简单，快速，无需特殊仪器。不足之处在于对酶切的条件要求较高，假阴性率高。多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量。只能分析已知序列特异位点的基因突变，且有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶，检测的耐药位点有限。

2.实时荧光PCR法：该方法利用PCR反应中引物在3’末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在荧光定量PCR引物的3’末端，采用合适的引物浓度，Touch-downPCR反应程序，同时结合嵌合有SyBrGreen I染料的PCR产物的熔点曲线。根据荧光定量PCR信号和熔点曲线，即可判断是否发生耐药突变。该方法只能检测已知位点的突变，且随着位点的增加，成本工作量都会增加。

3.基因芯片法：该方法是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列在固定于玻璃或者膜等载体上，然后与待测有标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，最后通过检测得出结果。该方法也只能检测已知位点的突变，样本的制备和标记较为繁琐，仪器昂贵，检测成本高。

4.焦磷酸测序法：该方法在每一轮测序反应中，只加入一种三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团，该基团最终转化为可见光信号，并转化为一个峰值。该方法只能对已知序列的DNA片段序列进行验证，不能分析未知DNA序列。

目前所有的乙肝病毒耐药位点的检测技术都是针对已知序列或者特异的几个位点进行检测，不能检测未知的DNA片段序列。随着抗乙肝病毒药物的增加，乙肝病毒耐药的位点更加的多样性，因此，势必对乙肝病毒耐药位点的检测技术提成了新的更高的要求。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

本发明还提供了一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述扩增引物和测序引物。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系，UNG(UDG)/dUTP体系是一种防污染体系，能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括热启动Taq酶，热启动Taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，Taq酶才能发挥作用，热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性。

本发明还提供了检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，使用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；

(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；

(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，再对测序PCR反应产物进行Sanger测序，确定耐药性基因位点。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：HBV PCR反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述HBV PCR反应液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂0.5ul、25mM dNTPs(含U)1ul、H₂O 30.5ul；所述酶反应液包括UNG酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s—55℃30s—72℃45s，40个循环；72℃7min。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物10-50ng、BigDye 2ul、BigDye Buffer 3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。

双脱氧终止法是上个世纪70年代由弗雷德·桑格尔发明的，他因此于1980年再度获得了诺贝尔奖。2001年，Allan Maxam和Walter Gibert发明了Sanger测序法。Sanger测序利用双脱氧终止法，即在Sanger测序反应中，利用碱基互补的原则合成新的DNA链，然而在测序引物延伸的过程中，如果遇到带有荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)时，DNA的合成就会终止，产生长短不一，带有荧光标记的DNA片段。复制的DNA片段带有负电荷，在毛细管电泳中会朝正极移动。不同长度的片段移动速度不同，因此到达检测窗口的时间也不同。当DNA片段通过检测窗口时，被标记的ddNTP的荧光被激活产生不同颜色的信号，从而读取原始DNA序列上每个位置的碱基序列。sanger测序是目前使用最普遍的DNA序列分析技术，可分析未知DNA序列，且单向反应的读序能力较长，是行业内金标准，准确度高。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物是针对HBV YMDD突变位点，在保守区域设计而得的，特异性强，灵敏度高；

2、本发明的基于Sanger测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药性基因检测方法采用独创的引物进行扩增测序，可以检测六种药物的主要的耐药突变位点，并且可以检测到143到180位点区间内的所有突变，检测结果更加准确，也可以发现该区间内的新突变位点，有助于进一步指导药物的使用。

附图说明

图1是本发明的检测乙型肝炎病毒耐药性基因方法的流程图；

图2是试验例1中使用本发明的方法对野生型质控品的204位点处的基因检测结果图；

图3是试验例2中使用本发明的方法对YIDD质控品的204位点处的基因检测结果图；

图4是试验例3中使用本发明的方法对YVDD质控品的204位点处的基因检测结果图；

图5是试验例4中使用本发明的方法对未知样品的基因检测结果图；

图6～图12是试验例5中本发明的试剂盒灵敏度的试验结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

本发明中所涉及的专业术语解释如下：

ddNTP：双脱氧核苷酸

HBV：乙型肝炎病毒

Sanger测序：双脱氧末端终止法测序

实施例1检测乙型肝炎病毒耐药性基因引物

针对HBV YMDD突变位点，在保守区域设计引物，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

扩增引物：

F:CTGCTCAAGGAACCTCTATGT(SEQ ID No:1)

R:GACACACTTTCCAATCAATAGG(SEQ ID No:2)

测序引物：AGGACGGCGTGAACTATGC(SEQ ID No:3)

实施例2检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒

本实施例的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒包括：`

1、扩增引物，具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列

2、测序引物，具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列

3、UNG(UDG)/dUTP体系，UNG(UDG)/dUTP(PROMEGA)体系是一种防污染体系，能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果；

4、热启动Taq酶(PROMEGA)，热启动Taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，Taq酶才能发挥作用，热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性。

实施例3检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法

请参阅图1，为本发明检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法的操作流程图；本实施例的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法包括以下步骤：

(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；

(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物，配制成合适的浓度；

所述PCR扩增的反应体系为：HBV PCR反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul，其中HBV PCR反应液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂ 0.5ul、25mM dNTPs(含U)1ul、H₂O30.5ul；酶反应液包括UNG酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油；

所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s—55℃30s—72℃45s，40个循环；72℃7min；

(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，再对测序PCR反应产物进行Sanger测序，确定耐药性基因位点。

所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物10-50ng(根据配制的浓度计算所需的体积)、BigDye 2ul、BigDye Buffer(ABI)3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。

所述测序PCR反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。

试验例1使用本发明的方法对野生型质控品的基因进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对野生型质控品(质粒合成，自制)进行检测。

运行SeqScanner程序，导入测序结果。按Find快捷键，找到序列“TGGCTTTCAG”从找到的序列往后的第5-7个碱基为204位点，ATG为野生型YMDD，测序结果为野生型，HBV基因测序结果截图如图2所示。

试验例2使用本发明的方法对YIDD质控品的基因进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对对YIDD质控品(质粒合成，自制)进行检测。

运行SeqScanner程序，导入测序结果。按Find快捷键，找到序列“TGGCTTTCAG”从找到的序列往后的第5-7个碱基为204位点，ATT为rtM204I(YIDD)，测序结果为YIDD突变，HBV基因测序结果截图如图3所示。试验例3使用本发明的方法对YVDD质控品的基因进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对YVDD质控品(质粒合成，自制)进行检测。

运行SeqScanner程序，导入测序结果。按Find快捷键，找到序列“TGGCTTTCAG”从找到的序列往后的第5-7个碱基为204位点，GTG为rtM204V(YVDD)，测序结果为YVDD突变，HBV基因测序结果截图如图4所示。

试验例4使用本发明的方法对未知样品进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对未知样本(血清)进行检测。

运行SeqScanner程序，导入测序结果。按Find快捷键，找到序列“TGGCTTTCAG”从找到的序列往后的第5-7个碱基为204位点，ATG为野生型YMDD，测序结果为野生型，HBV基因测序结果截图如图5所示。

试验例5本发明的方法的灵敏性试验

使用本发明实施例3的检测方法，对定量为5×10⁸IU/ml，1×10⁷IU/ml，1×10⁶IU/ml，1×10⁵IU/ml，1×10⁴IU/ml，1×10³IU/ml阳性HBV样品(血清临床样本)进行检测。检测结果如图6～12所示，结果显示，该发明方法灵敏度最高可达1×10³IU/ml。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州立菲达安诊断产品技术有限公司

<120> 一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ctgctcaagg aacctctatg t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gacacacttt ccaatcaata gg 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

aggacggcgt gaactatgc 19

Claims (9)

1.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物，其特征在于，所述引物包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

2.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物。

3.根据权利要求2所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系。

4.根据权利要求3所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热启动Taq酶。

5.一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，使用权利要求2～4任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；

(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；

(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，再对测序PCR反应产物进行Sanger测序，确定耐药性基因位点。

6.根据权利要求5所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：HBV PCR反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述HBV PCR反应液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂ 0.5ul、25mM dNTPs 1ul、H₂O 30.5ul；所述酶反应液包括UNG酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。

7.根据权利要求5所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s—55℃30s—72℃45s，40个循环；72℃7min。

8.根据权利要求5所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物10-50ng、BigDye 2ul、BigDye Buffer3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。

9.根据权利要求5所述的检测乙型肝炎病毒耐药性基因的方法，其特征在于，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。