CN110184389B - crRNA靶向的PCR-CRISPR系统在检测HBV DNA中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCR结合CRISPR检测HBV DNA的方法，所述方法包括：(1)以一对上下游特异性引物扩增待测样本的核酸，所述下游引物的5’端设置有能被T7RNA聚合酶识别并转录的序列；(2)在包括有识别HBV DNA靶序列的crRNA、T7RNA聚合酶、Cas13a蛋白和报告RNA的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有靶序列进行检测，所述HBV DNA靶序列的区间为第803‑829nt。本发明还公开了能够靶向HBV DNA特异位点的crRNA以及含有该crRNA的试剂盒。本发明提供的方法在检测HBV DNA含量中简便、快速，具有极高的灵敏度和特异性，在PCR扩增后的15分钟内分辨出单拷贝的HBV DNA，对于低病毒载量的血清样本，显示出更高的阳性检出率。

Description

crRNA靶向的PCR-CRISPR系统在检测HBV DNA中的应用

技术领域

本发明涉及一种crRNA序列及通过CRISPR-Cas13a系统对乙肝病毒基因进行检测的技术，属于分子生物学技术领域。

背景技术

乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的严重传染性疾病。全球约有2.4亿人为乙肝病毒表面抗原携带者，每年约有一百万人死于HBV引起的肝脏相关疾病。我国是乙肝大国，现有HBV感染者约9000万人，其中慢性乙型肝炎患者约2800万例，表明乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的重大问题。由此可见，乙肝病毒的早发现、早治疗，对于乙肝患者至关重要。

HBV DNA是乙肝病毒的核心物质和病毒复制的基础。在病毒DNA携带的遗传基因作用下，HBV DNA分别复制出新的病毒外壳和DNA核心，随后重新组装，形成大量的新病毒，释放出来继续感染其他肝细胞。

乙肝病毒DNA是HBV感染最直接的指标，可用于检测人体内存在乙肝病毒的多少和传染程度，同时也是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。HBV DNA含量越高表示病毒复制程度越高，传染性越强。乙肝病毒DNA含量的检测对于乙肝治疗过程中的监测，治疗效果的判断，治疗方案的制定都有着重要的意义。

现有针对乙肝病毒DNA含量的检测方法主要为实时荧光定量PCR法和酶联免疫吸附法(ELISA)。酶联免疫吸附法检测的灵敏度较低，时间较长；PCR的方法虽然精确度高，但是误差相对较大，而且假阳性率也比较高，乙肝病毒感染的早期患者由于血清中病毒载量较低，qPCR法无法检测，漏检问题也时常发生。最新的国际研究资料表明:和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBV DNA水平持续低于20000U/ml，乙肝病毒也可能仍在进一步发展。因此，针对HBV DNA的检测限度应该越低越好，国际建议的HBV DNA检测正常值应该是:<50U/ml(250copies/ml)。

Cas13a(之前被称作C2c2)是一个RNA引导的CRISPR效应蛋白，在识别特定RNA序列后可激活其RNA酶活性。不同于靶向DNA的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1)，Cas13a具有两种不同的RNA切割活性，在切割它的靶RNA之后仍然保持活性，表现出不加区别的切割活性，继续切割其他的非靶RNA，这一切割效应也被称作“附带切割(collateral cleavage)”。研究人员利用Cas13a的这种附带切割活性，将其作为一种自动的放大检测器用于分子检测中。

2017年出现的基于CRISPR/Cas13a的检测平台SHERLOCK利用Cas13a的非特异的剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification,RPA)，实现了快速、廉价、高度灵敏的检测，可将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检测到的水平(J.S.Gootenberg,O.et al.Science 356,438-442(2017))。研究表明，Cas13a可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的鉴定，并进一步区分非洲毒株和美洲毒株的基因序列，还可用于鉴定细菌的特定类型。而其在鉴定病毒或细菌核酸之后，通过设计特异的crRNA可以直接用于病原体的分型，其超高的灵敏度避免了大量复杂的上游实验工作，即可直接扩增生物样本进行检测，缩短了样品的前处理过程。以上均表明该技术在基础研究、检测和治疗领域的巨大应用前景。

此前文献中建立的SHERLOCK核酸检测技术，是将LwCas13a蛋白与重组聚合酶等温扩增技术RPA相结合，实现了对目的核酸的高灵敏、高特异性检测。然而，考虑到RPA等温扩增技术成本较高，且扩增过程容易发生污染，目前尚不适用于常规的临床检测。

发明内容

为解决上述技术问题，基于PCR的检测技术具有成熟度高，系统稳定且已广泛应用于临床分子检测领域的技术优势，本发明的目的在于将PCR技术与基于Cas13a蛋白的CRISPR结合，通过设计、构建、筛选，最终提供一段能靶向HBV DNA保守区位点，并激活CRISPR-Cas13a系统的crRNA，利用该靶点构建的CRISPR-Cas13a系统能够特异性地检测HBVDNA。

为实现上述目的，本发明以CRISPR-Cas13a系统的原理及靶序列的选择原则为基础，通过比对根据保守区设计的3条crRNA，优选出对CRISPR-Cas13a系统激活效果最好的crRNA进行乙肝病毒DNA的检测。

基于上述研究，本发明首先提供了一种基于非诊断目的的PCR结合CRISPR检测HBVDNA的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以一对上下游特异性引物PCR扩增待测样本的核酸，所述下游引物的5’端设置有能被T7RNA聚合酶识别并转录的序列；

(2)在包括有识别HBV DNA靶序列的crRNA、T7RNA聚合酶、Cas13a蛋白和报告RNA的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有靶序列进行检测，所述HBV DNA靶序列的区间为第803-829nt。

在一个优选的实施方案中，所述上游引物的序列由SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列由SEQ ID NO.2所示。

在一个更为优选的实施方案中，所述crRNA的序列为SEQ ID NO.3。

更为优选地，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

尤为优选地，在所述的检测体系中，还含有RNA酶抑制剂。所述RNA酶抑制剂作用是抑制其他可能的RNA酶。

又为优选地，在所述的检测体系中，还含有RNA酶活性报告分子。

在一个更为优选的实施方案中，所述RNA酶活性报告分子为一端标记有淬灭基团，一端标记有荧光基团的RNA分子，所述分子被激活RNA酶活性的Cas13a剪切，并释放荧光。

其次，本发明还提供了一种能够靶向HBV DNA特异位点的crRNA，所述crRNA的序列由SEQ ID NO.3所示。

最后，本发明提供了含有上述crRNA用于检测待测样本中HBV DNA的试剂盒，所述试剂盒还含有序列由SEQ ID NO.1所示的PCR扩增上游引物和序列由SEQ ID NO.2所示的PCR扩增下游引物和LwCas13a蛋白。

在一个更为优选的实施方案中，所述试剂盒还含有RNA酶抑制剂和RNA酶活性报告分子。

本发明首次将PCR技术与LwCas13a蛋白结合，针对HBV DNA的检测，建立了基于这两种技术的高灵敏核酸检测新方法(PCR-CRISPR)。本发明提供的方法简便、快速、具有极高的灵敏度和特异性。本方法可以在PCR扩增后的15分钟内分辨出单拷贝的HBV DNA。在对32份临床信息已知的血清样本的检测中，PCR-CRISPR检测结果与qPCR完全一致。在对280份临床信息未知的患者血清样本的检测中，90份样本qPCR和PCR-CRISPR均检测为HBV DNA阳性，180份样本两种方法均检测为阳性，另外有10份样本qPCR检测为HBV DNA阴性而PCR-CRISPR检测为阳性，即有96.4％(270/280)的样本，检测结果与qPCR一致，对于qPCR检测HBV DNA阳性的样本无漏检情况。以qPCR检测结果作为标准，得到本研究建立的方法对于血清样本检测的灵敏度为1(90/90，95％CI：94.90％-100％)，特异度为94.74％(180/190，95％CI：90.26％-97.30％)。在对qPCR检测为HBV DNA阴性而PCR-CRISPR检测为阳性的10份样本的检测中，使用PCR-CRISPR检测HBV DNA时，10个样本的阳性检出率平均约为7.1/10；而使用ddPCR时，样本的阳性检出率平均约为3/10。PCR-CRISPR检测HBV DNA的阳性检出率约为ddPCR的两倍。对于低病毒载量的血清样本，PCR-CRISPR方法检测HBV DNA时显示出更高的阳性检出率。

附图说明

图1.PCR-CRISPR检测方法示意图；

图2.HBV DNA检测候选crRNA荧光信号对照图；

图3.PCR扩增HBV DNA的琼脂糖凝胶电泳灵敏度评价图谱；

图4.PCR-CRISPR与qPCR检测质粒标准品的灵敏度评价；

图5.临床信息已知的血清样本PCR-CRISPR与qPCR检测HBV DNA结果比较图；

图6.临床信息未知的血清样本PCR-CRISPR与qPCR检测HBV DNA结果比较图；

图7.血清样本ddPCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

本发明实施例涉及的实验材料

1.试剂：蛋白酶抑制剂、2×Pfu taq Mix(CW0717M)，TRIzon总RNA提取试剂盒(CW0580S)、anti-his-HRP抗体、广谱彩虹预染蛋白Marker(江苏康为世纪生物科技有限公司)，SOC液体培养基、IPTG(全氏金生物，GF101-01)，溶菌酶、全能核酸酶、SUMO蛋白酶、NTPmix(Solarbio)，EDTA、1M Tris pH 8.0，Bradford蛋白浓度测定试剂盒，SDS-Page相关缓冲液、考马斯亮蓝染色套装(碧云天)，报告RNA试剂盒(RNAse Alert v2,4479769)、ECL显色液(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate，34096)、透析袋Slide-A-Lyzer G2Dialysis Cassettes，20K(Thermo)，琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化)，黑色96孔培养板(Costar，3916)，RNA合成试剂盒(T7Quick High Yield RNASynthesis kit)，RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor)，T7RNA聚合酶(NEB)，RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP，Beckman Coulter，A63987)、ExTaqTM Version 2.0(TaKaRa,RR003A)，二硫苏糖醇(DTT，北京欣经科生物技术有限公司)，氨苄西林钠(华北制药股份有限公司)，NP-40(FLUKA,74385)、咪唑等化学试剂(国药集团化学试剂有限公司)，酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID)，Tris平衡酚(灏样生物，TBD0001HY)。蛋白纯化柱：HisTrap HPcolumn(GE Healthcare Life Science)，UniGel-50SP(Nano-Micro Tech)。

2.LwCas13a蛋白

(1)LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及鉴定：

质粒Addgene-PC013,Twinstrep-SUMO-huLwCas13a(购于Addgene公司)，将质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，TB液体培养基37℃,200rpm培养14h以上，1:100接入新的Amp⁺抗性TB培养基中,37℃,300rpm培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG使终浓度为500uM,18℃,200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后的收集蛋白上清，并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱(HisTrap HP column，GE Healthcare Life Science)进行初步纯化，利用SUMO将所带标签部分进行酶切，再利用LwCas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱(UniGel-50SP，Nano-Micro Tech)进行第二次纯化，实验过程中利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，同时利用His标签抗体进行蛋白的初步鉴定，以确定诱导的蛋白为目的蛋白。

(2)LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定：

使用蛋白活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测LwCas13a蛋白浓度，利用报告RNA试剂盒(Invitrgen)检测490nm激发、520nm波长下的发射光的荧光值，判断体系中的Cas13a蛋白是否被激活。即在靶点RNA、与靶点对应的crRNA的存在下，Cas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告RNA，使其发出荧光，同时设置非特异性靶点进行特异性检测，以及人细胞总RNA作为背景RNA，检测体系是否会受到背景RNA的干扰。检测结果发现，本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白，并且无RNase的污染，该蛋白与crRNA结合形成的复合体，可被特异的靶序列激活，并剪切体系中的报告RNA，从而发出荧光信号，该蛋白可用于后续的检测实验。同时，在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化。

LwCas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定的详细技术内容参见CN108715849A，本发明引用该专利作为说明书的一部分。

实施例1：用于本发明的crRNA和PCR引物的设计和制备

(1)crRNA的设计和制备

在乙肝病毒的P区附近选择HBV DNA的检测靶点。首先对这部分序列进行保守性分析，乙型肝炎病毒数据库(https://hbvdb.ibcp.fr)下载7720株乙肝病毒P区序列信息，应用clustal X软件对序列进行生物信息学分析，使用Perl脚本分析各位点的碱基比例，各位点碱基出现的概率见附表一。随后根据分析结果选择设计相应的PCR扩增引物和crRNA。

本发明选择逆转录酶区(RT区)的保守序列设计crRNA。crRNA的5’端带有39nt的重复序列，该段序列可与LwCas13a蛋白结合，5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，设计作为模板的单链DNA序列为重复序列+靶序列,T7序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)+部分重复序列(5’-GATTTAGACTACCCCAA-3’)为上游引物，取靶序列下游20bp左右的反向互补序列作为下游引物(表1)。

表1.用于制备HBV-crRNA的模板序列及PCR扩增引物序列

DNA序列由北京天一辉远公司合成。根据文献中的研究方法，经DNA的合成、退火、转录、纯化步骤，合成相应的crRNA(J.T.Huang,et al.Clinical chemistry 61,290-296(2015))。(RNA相关操作避免RNase的污染)。

将上述序列用ddH₂O稀释成10μM。配制PCR反应体系如下：上游引物为T7-crRNA-F，模板分别为HBV-1，2，3-crDNA，对应下游引物分别为HBV-1，2，3R。

表2.用于制备HBV-crRNA的模板序列的PCR扩增体系

XX-crDNA分别代表模板HBV-1-crDNA、HBV-3-crDNA、HBV-3-crDNA。

PCR反应条件：95℃5min热变性；95℃30s，60℃30s，72℃15s共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。

PCR产物使用Tris平衡酚进行产物的纯化：

Tris平衡酚(灏样生物)取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入50μL无RNA酶的水，Nanodrop检测浓度，-20℃保存。

取1μg纯化的PCR产物使用T7转录试剂盒(NEB公司)转录crRNA，体系如下表3：

表3.crRNA转录体系

注：*X为DNA模板体积。

上述体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育15min。

按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter公司)纯化转录的RNA：

磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。

共制备出3种crRNA：HBV-crRNA1、HBV-crRNA2、HBV-crRNA3，用于CRISPR-Cas13a检测HBV DNA方法的建立(见表4)。

(2)PCR扩增引物的设计

设计PCR扩增HBV DNA检测靶点序列的引物，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7RNA聚合酶识别并且进行转录(见表4)。DNA序列由北京天一辉远公司合成。

表4.用于检测HBV DNA的PCR扩增引物和crDNA序列

表中位点的计数参考基因组位点信息Genebank ID：D00329。

实施例2.CRISPR-Cas13a检测HBV DNA方法的建立

本研究利用PCR对目标核酸进行扩增，将HBV DNA检测的靶点序列转录得到相应的ssRNA，用上文的的crRNA：HBV-crRNA1、HBV-crRNA2、HBV-crRNA3进行检测，比较不同crRNA的信号强弱，选择荧光信号最强的crRNA作为后续的检测crRNA。具体步骤和原理如图1所示：第一步利用特异性的引物扩增靶点序列(经变性、退火、延伸过程)，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7RNA聚合酶识别并且进行转录。第二步，取出部分扩增产物加入T7RNA聚合酶、LwCas13a蛋白、可以识别靶序列的crRNA和报告RNA进行靶序列的检测(37℃进行)。荧光定量PCR仪，FAM通道检测：37℃15s，37℃，1min45s(收集荧光)，共30个循环。具体步骤如下：

(1)HBV DNA的PCR扩增：

以pHBV1.2作为标准品，梯度稀释后，每个模板取1μL进行PCR扩增，PCR扩增体系参照表2，扩增条件95℃5min热变性；95℃30s，60℃30s，72℃15s共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。配置1.5％琼脂糖凝胶，电压U＝160V，电流I＝160mA，时间T＝30min，电泳检测，观察电泳条带。

(2)LwCas13a检测HBV DNA的PCR扩增产物：

为了准确控制反应温度，防止酶标版由于密封性导致的污染，使用荧光定量PCR仪进行后续检测，并将检测体系缩小为原体系的1/2。将上一步扩增得到的PCR产物取5μL进行检测，体系如下表5。体系放入荧光定量PCR仪，FAM通道检测荧光信号变化。设置37℃反应15s，37℃反应1min 45s(收集荧光)，共30个循环。

表5.PCR-CRISPR检测体系

本体系中的所述RNA酶抑制剂作用是抑制其他可能的RNA酶(J.S.Gootenberg,O.et al.Science 356,438-442(2017))。

结果如图2所示，由于阴性对照组中未加crRNA，体系中的荧光信号保持在163±30.06范围内基本不变。crRNA-HBV-1的荧光信号从151a.u.上升至3781a.u.，约为阴性对照荧光信号的23倍(荧光信号来自检测体系中报告RNA标记(RNAse Alert v2,4479769)的，所述报告RNA一端带有淬灭基团，一端带有荧光基团，Cas13a的RNA酶活性被激活，可以剪切体系中的报告RNA,释放荧光，用荧光定量PCR仪FAM通道检测荧光；crRNA-HBV-2的荧光信号从140a.u.上升至974a.u.，荧光信号约为阴性对照的6倍；crRNA-HBV-3的荧光信号从114a.u.上升至319a.u.，荧光信号约为阴性对照的2倍。结果表明，含有HBV-1、2两个crRNA的检测组在识别目标核酸后均显示出较强的荧光信号。其中，从反应开始后，HBV-1crRNA的荧光信号始终最强，因此，我们选择HBV-1作为后续HBV DNA检测的crRNA。

实施例3.CRISPR-Cas13a检测HBV DNA的灵敏度

灵敏度实验主要检测本方法所能检测到的乙肝病毒的最低拷贝数，并与现有的荧光定量PCR检测方法进行比对。将质粒pHBV1.2分别梯度稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/ul，经PCR扩增后取5ul扩增产物加入LwCas13a检测体系中，同时设置水为模板的PCR产物作为阴性对照。并且取2ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时利用乙肝病毒DNA检测试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)检测不同浓度的质粒模板，对比两种检测方法的灵敏度。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶结果见图3，图3中阴性对照(NC)无条带，说明扩增过程中无污染；10⁴-10⁶拷贝的HBV DNA模板，可观察到清晰的电泳条带；模板为10³拷贝时仅能观察到模糊的条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度大约能达到10³拷贝左右。

随后，我们利用梯度稀释的HBV DNA质粒标准品分别检测了PCR-CRISPR和qPCR两种方法的灵敏度，检测结果见图4。图4A中，10⁰-10⁶copies/μL的质粒扩增产物的荧光信号显著高于阴性对照，其中，不同浓度模板对应15min时荧光信号分别为1317±153.66a.u.、1508±180.85a.u.、1861±189.81a.u.、1931±423.15a.u.、1973±694.81a.u.、1999±96.59a.u.、2328±332.38a.u.，阴性对照荧光信号为529±6.90a.u.。与阴性对照相比，荧光强度均具有统计学差异(t检验，P<0.001)，说明体系中检测到了HBV DNA。观察不同浓度质粒模板的荧光强度发现，模板浓度为10⁰-10³copies/μL时，随着模板浓度的升高，荧光信号增强；但是当模板浓度为10⁴-10⁶copies/μL时，随着模板浓度的升高，荧光信号变化没有明显的对应关系。推测可能由于模板浓度为10³copies/μL时，体系的LwCas13a剪切功能基本达到最高，导致高于该浓度的模板之间检测信号无明显差异。由此可知，利用PCR-CRISPR检测方法，可以在PCR扩增后的15min内分辨出单拷贝的HBV DNA。

qPCR检测结果如图4B所示，在质粒模板浓度为10-10⁶copies/μL时，可以观察到明显的扩增曲线，并且Ct<38；而模板为1copy/μL时，无明显扩增曲线，并且无法检测显示相应的Ct值。上述结果提示，与qPCR相比，PCR-CRISPR具有更高的检测灵敏度。

实施例4.临床样本检测

利用HBV DNA载量已知的高浓度血清样本及健康血清样本对本方法进行验证，同时收集门诊血清样本共280份，用本发明建立的实验方法检测临床样本中的HBV DNA，同时利用湖南圣湘乙肝病毒DNA定量检测试剂盒检测，比对两种方法结果的一致性。并且对于检测结果不一致的样本，利用文献报道的数字PCR检测方法对HBV DNA进一步检测，以评估本方法的检测效果。

(1)待检测样本的核酸提取

32份临床信息已知血清样本(16份HBV阳性，乙肝病毒滴度已知；16份为健康人血清)，和280份未知血清样本按照上海之江生物科技股份有限公司核酸提取试剂盒说明书操作，提取的核酸，将其转移至无DNA/RNA酶的EP管中，直接用于检测或于-80℃保存备用。

(2)我们首先利用32个临床信息已知的血清样本对本研究建立的HBV DNA的检测方法进行了初步的评价。32份血清样本中，16份为HBV DNA阳性的样本，并且HBV DNA载量较高(>1×10⁵IU/mL)，另外16份为HBV DNA阴性的样本，利用PCR-CRISPR检测结果如下表6：

表6.血清样本相关临床信息及qPCR、PCR-CRISPR检测HBV DNA的结果

注：¹HBV DNA载量由圣湘生物乙肝病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光探针法)检测；

^2,3HbsAg和HBeAg由DiaSorin试剂盒检测，方括号内显示该指标的正常范围。

由上表可知，对于16份HBV DNA阳性的样本，PCR-CRISPR的方法检测均为阳性；而16份qPCR判定HBV DNA阴性样本，PCR-CRISPR方法检测也为阴性。说明本研究建立的方法，可以准确检出血清样本中的阳性HBV DNA将两种方法的检测结果绘制成维恩图，如图5所示，对于这32份血清样本的检测，PCR-CRISPR检测结果与qPCR完全一致。然而由于本次实验中所用的HBV DNA阳性样本的病毒载量较高，为了充分验证本方法在血清样本中的应用，需对不同病毒载量的血清样本进行检测。

(3)为了进一步评价PCR-CRISPR方法检测血清样本HBV DNA的效果，我们收集了280份临床信息未知的患者血清样本，利用PCR-CRISPR和qPCR两种方法对其进行检测，检测结果如图6所示。280份血清样本中，90份样本qPCR和PCR-CRISPR均检测为HBV DNA阳性，180份样本两种方法均检测为阳性，另外有10份样本qPCR检测为HBV DNA阴性而PCR-CRISPR检测为阳性，即有96.4％(270/280)的样本，检测结果与qPCR一致。以qPCR检测结果作为标准，得到本研究建立的方法对于血清样本检测的灵敏度为1(90/90，95％CI：94.90％-100％)，特异度为94.74％(180/190，95％CI：90.26％-97.30％)。根据qPCR定量检测的结果，我们进一步对PCR-CRISPR方法的检测结果进行了分析，结果如下表7：

表7. 280份血清样本(临床信息未知)中HBV DNA的qPCR、PCR-CRISPR检测结果

注：¹同表6；

²阳性定义为样品荧光信号与阴性对照具有显著性差异；

³阴性定义为样品荧光信号与阴性对照无统计学差异。

90份qPCR判定HBV DNA阳性样本，其乙肝病毒载量范围从100IU/mL到10⁸IU/mL以上，其中35份血清样本病毒载量低于10³IU/mL，而利用本研究建立的方法均可以检测出样本中的HBV DNA，说明本方法可以检测不同浓度范围的HBV DNA，并且对于qPCR检测HBV DNA阳性的样本无漏检情况。

值得注意的是，在qPCR检测为阴性的190份血清样本中，有10例样本PCR-CRISPR检测为阳性，而对于这10例检测结果与qPCR不一致的样本，我们利用灵敏度更高的ddPCR对其进行了进一步的检测验证。

(2)血清样本HBV DNA的PCR-CRISPR检测

取上一步提取的核酸3μL作为模板，HBV F、R引物进行PCR扩增，设置以ddH₂O为模板的PCR产物作为阴性对照(Neg)，以浓度为10⁶copies/μL的HBV DNA质粒为模板的PCR产物作为阳性对照(Pos)，对照设置3个复孔。扩增产物使用HBV-1crRNA结合LwCas13a蛋白进行检测。

对比实施例1：qPCR检测HBV DNA的灵敏度

质粒标准品梯度稀释后作为模板，按照乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒说明书检测：取出包装盒中的各组分，平衡至室温后混匀后备用。根据待测样本、阳性对照、阴性对照数量按比例配制PCR混合液：反应液38μL、酶混合液2μL、内标0.2μL，充分混匀后离心备用。取1.6μL梯度稀释的质粒模板加入40μL PCR混合液，盖上管盖，2000rpm离心30s。放入荧光定量PCR仪中，设置反应条件如下表8：

表8.qPCR检测HBV DNA反应条件

选择FAM通道作为检测通道，乙型肝炎病毒内标选择HEX通道检测。

质量控制：乙型肝炎病毒阴性对照无Ct值显示，但内标检测为阳性(Ct值≤40)，并且乙型肝炎病毒阳性对照检测为阳性(Ct值≤40)时，证明检测体系正常。

检测样品内标为阳性，进一步根据Ct值及扩增曲线判断检测结果。

对照实施例2：血清样本HBV DNA的ddPCR检测

为了确定检测结果，我们利用数字PCR(Droplet Digital，简写：ddPCR)对疑似样本进行检测HBV DNA的检测，引物和探针序列如下表9(J.T.Huang,et al.Clinicalchemistry 61,290-296(2015))：

表9.Droplet Digital PCR用引物及探针序列

按照下表10配制PCR反应液：

表10.Droplet Digital PCR反应体系

微滴制备：将配制好的20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴发生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200^TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。

PCR扩增：样品微滴分别转移至对应的反应孔中，采用铝膜热封(180℃，6sec)后，于普通PCR仪上进行扩增。程序如下：95℃10min热变性，之后94℃30s，57℃50s，98℃10min共36个循环，最后12℃保存。

检测和数据分析：将PCR扩增后的96孔板放入QX200^TM微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，并在软件QuantaSoft上设定检测模式为ABS(绝对定量)，检测FAM的荧光信号。仪器针对每个样品的每个微滴自动进行荧光信号的分析，数据由QuantaSoft的自动处理，最终获得各样品中HBV DNA的拷贝数浓度(单位：copies/μL)。

将280份血清样本中，PCR-CRISPR检测HBV DNA阳性而qPCR检测为阴性的样本用ddPCR进一步验证。考虑到样本中HBV DNA浓度低，因此我们对每个样本做了10次重复检测，每个反应取3μL模板进行检测。ddPCR检测结果如图7所示。在ddPCR检测的微滴结果中，信号值(纵坐标)较高的蓝色微滴代表发生了PCR扩增的阳性微滴，下方信号值低的灰色微滴代表未发生PCR反应的阴性微滴，黄色虚线分出的每个竖格代表一个反应孔。图7中显示了样本10例样本的10个重复的结果。如图7所示，阴性对照NC的微滴图无阳性信号点，证明无污染。上述血清样本的检测结果中均有蓝色的阳性微滴，但是数量极少，说明样品浓度极低。观察每一个反应孔发现，部分反应孔中没有阳性液滴的信号，说明该反应孔中可能并没有HBV DNA的模板。进一步利用软件分析样本对应的浓度，得到其HBV DNA含量如表11所示。

表11.ddPCR检测10例血清样本HBV DNA的结果

如表11所示，以上10个样本中均检测到了HBV DNA，但浓度极低(1.2-5.4copies/3μL)。在10次重复试验中，每个样本平均仅有3次可以检测到HBV DNA。为了进一步确定PCR-CRISPR对于低浓度HBV DNA血清样本的检测，我们利用PCR-CRISPR方法对上述10个样本分别进行了10次检测，随后，我们比较了用PCR-CRISPR和ddPCR分别进行10次重复检测后阳性率的结果(表12)。

为了进一步确定PCR-CRISPR对于低浓度HBV DNA血清样本的检测，我们用PCR-CRISPR方法对上述10个血清样本进行了10次重复检测，表12比较了用PCR-CRISPR和ddPCR分别进行10次重复检测后阳性率的结果。

表12.PCR-CRISPR与ddPCR检测HBV DNA结果比较

结果显示，PCR-CRISPR检测HBV DNA阳性比率均高于对应样本ddPCR的阳性检测比例。使用PCR-CRISPR检测HBV DNA时，10个样本的阳性检出率平均约为7.1/10；而使用ddPCR时，样本的阳性检出率平均约为3/10。PCR-CRISPR检测HBV DNA的阳性检出率约为ddPCR的两倍。对于低病毒载量的血清样本，PCR-CRISPR方法检测HBV DNA时显示出更高的阳性检出率。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> crRNA靶向的PCR-CRISPR系统在检测HBV DNA中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 1

cctwcggayg gaaaytgcac ctgtattccc 30

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggcccat gaarttaagg gagtagccc 49

<210> 3

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 3

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc caauuuucuu uugucuuugg 60

guauac 66

<210> 4

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 4

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ugcaccugua uucccauccc 60

aucauc 66

<210> 5

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 5

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cuguacaaca ucuugagucc 60

cuuu 64

Claims (8)

1.一种基于非诊断目的的PCR结合CRISPR检测HBV DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）以一对上下游特异性引物PCR扩增待测样本的核酸，所述下游引物的5’ 端设置有能被T7 RNA聚合酶识别并转录的序列，所述上游引物的序列由SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列由SEQ ID NO.2所示；

（2）在包括有识别HBV DNA靶序列的crRNA、T7 RNA聚合酶、Cas13a蛋白和报告RNA的检测体系中对待测样本核酸的扩增产物中是否存在有靶序列进行检测，所述HBV DNA靶序列的区间为第803-829 nt，所述crRNA的序列由SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述的检测体系中，还含有RNA酶抑制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述的检测体系中，还含有RNA酶活性报告分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RNA酶活报告分子为一端标记有淬灭基团，一端标记有荧光基团的RNA分子，所述分子被激活RNA酶活性的Cas13a剪切，并释放荧光。

6.一种能够靶向HBV DNA特异位点的crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列由SEQ IDNO.3所示。

7.一种含有权利要求6所述crRNA用于检测待测样本中HBV DNA的试剂盒，所述试剂盒还含有序列由SEQ ID NO.1所示的PCR扩增上游引物和序列由SEQ ID NO.2所示的PCR扩增下游引物和LwCas13a蛋白。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有RNA酶抑制剂和RNA酶活性报告分子。

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