CN101235414A - 乙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测临床血液样品中乙肝病毒(HBV)不同基因亚型方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因亚型的方法及所使用的试剂盒。
Description
所属领域
本发明涉及检测乙型肝炎病毒基因型的方法，特别是涉及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中乙型肝炎病毒基因型的方法。本发明进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
发明背景
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要的肝脏疾病致病因子。世界上有20亿人感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人已近50万。估计全球每年有100-200万人直接死于HBV持续感染。
HBV是已知最小的DNA病毒，由正负两条链组成，HBV的四个开放读码框(Open Reading Frame，ORF)分别为P，X，C，S，它们编码至少8种不同功能的蛋白。HBV具有病毒复制产量高(1012-13病毒粒/天)和突变率高(1010-11个点突变/天)的特征，高突变是由于高复制，尤其是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。通过全基因组比较的新的遗传分类系统，各型之间全基因组核苷酸序列的差异超过8％时被定义为一个基因型。将HBV分为A-H八种不同的基因型。不同基因型HBV存在典型的地域分布差异目前我国HBV分布主要以B型和C型为主，兼有少量的A型和D型，在香港、广州等南部地区有少部分D型分布，另外，华北、新疆地区有A型存在。不同的基因型其临床感染特点和致病性也不完全相同；
目前对HBV基因分型方法主要有：限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型特异性探针核酸杂交分析，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，价格昂贵，灵敏度低，特异性不高等缺点，不适合广大基层医院开展。因此本发明人结合已知的PCR-斑点杂交和过滤杂交方法，建立了一种短时间内检测乙型肝炎基因型的方法。
发明内容
本发明提供了检测乙型肝炎病毒基因型的方法，特别是提供了一种利用DNA反向斑点杂交技术快速准确的区分临床血液样品中乙型肝炎病毒基因型的方法。本发明还进一步提供了用于临床乙型肝炎病毒基因分型检测的试剂盒。
为了克服现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一个适用于检测乙型肝炎病毒基因型的方法，该方法包括(1)提供待检血清或血浆标本并从中提取DNA；(2)根据乙型肝炎病毒基因组保守区设计分型引物和探针；(3)使用小分子标记寡核苷酸引物进行聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(4)使用被标记的靶DNA扩增产物与特异性寡核苷酸探针在基质上杂交；(5)检测杂交结合物并借以判断乙型肝炎病毒的不同基因型。本方法的特征在于：
I)反应试剂都是借助压力通过穿过杂交膜；
II)使用具有不同碱基序列的型特异探针。
根据本发明的一个实施优选方案，针对A型的探针与已知的乙肝病毒B、C、D、E、F、G、H型相应基因组序列差异不少于两个碱基。
根据本发明的一个实施优选方案，针对B型的探针与已知的乙肝病毒A、C、D、E、F、G、H型相应基因组序列差异不少于两个碱基。
根据本发明的一个实施优选方案，针对C型的探针与已发表的乙肝病毒A、B、D、E、F、G、H型相应基因组序列差异不少于两个碱基。
根据本发明的一个实施优选方案，针对D型的探针与已发表的乙肝病毒A、B、C、E、F、G、H型相应基因组序列差异不少于两个碱基。
根据本发明的一个实施优选方案，所设计的引物和探针是针对国际基因库Genebank中已经发表的HBV(A-H)，选取高度保守的Pre-S1区设计引物探针。
根据本发明的一个实施优选方案，其中用于扩增的引物是：
上游引物：5′-GAGTATGCCCTGAGCCTGAG-3′(SEQ ID NO：1)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGATCATCAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGACCACCAGTT-3′(SEQ ID NO：3)
2、根据本发明的一个实施优选方案，其中用于杂交的寡核苷酸探针为：
探针PC1：5′-ATCCAGATTGGGACTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)
探针PC2：5′-ATCCAGATTGGGACCTCA-3′(SEQ ID NO：5)
探针PC3：5′-CGCACGGAGGCCTTTT-3′(SEQ ID NO：6)
探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：7)
探针A1：5′-ACCACTGGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO：8)
探针A2：5′-ACCACTGGCCAGCAGC-3′(SEQ ID NO：9)
探针B：5′-CCTGCATTCAAAGCCAAC-3′(SEQ ID NO：10)
探针C1：5′-ATCACTGGCCAGAGGC-3′(SEQ ID NO：11)
探针C2：5′-ATCAATGGCCAGCGGC-3′(SEQ ID NO：12)
探针C3：5′-GGATCAATGGCCAGAGG-3′(SEQ ID NO：13)
探针C4：5′-GGACCCTTGGCCAGAG-3′(SEQ ID NO：14)
探针C5：5’-GGATCATTGGCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)
探针C6：5’-GATCATTGGCCAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：16)
探针C7：5’-TCACTGGCCAGAAGCAA-3’(SEQ ID NO：17)
探针D： 5′-CAGCCTTCAGAGCAAACA-3′(SEQ ID NO：18)
本发明的一个实施优选方案，其中所说的小分子为生物素、地高辛和染料分子。
本发明的一个实施优选方案，其中所说的探针，其特征在于通过紫外线交联或末端标记氨基的方法固定在基质上。
本发明的一个实施优选方案，其中所说的基质材料选自尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素等。
本发明的另一个目的，是提供用于检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括(1)聚合酶链反应试剂；(2)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂。本发明的一个实施优选方案，其中所说的聚合酶链反应试剂包括DNA提取液、DNA浓缩液、dNTP、耐热Taq酶、阳性标准品。
本发明的一个实施优选方案，其中所说的杂交膜及反向斑点杂交反应试剂包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV以及杂交膜。
3、本发明的再一个实施优选方案，本试剂盒所应用的引物探针分别为：
上游引物：5′-GAGTATGCCCTGAGCCTGAG-3′(SEQ ID NO：1)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGATCATCAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGACCACCAGTT-3′(SEQ ID NO：3)
探针PC 1：5′-ATCCAGATTGGGACTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)
探针PC2：5′-ATCCAGATTGGGACCTCA-3′(SEQ ID NO：5)
探针PC3：5′-CGCACGGAGGCCTTTT-3′(SEQ ID NO：6)
探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：7)
探针A1：5′-ACCACTGGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO：8)
探针A2：5′-ACCACTGGCCAGCAGC-3′(SEQ ID NO：9)
探针B：5′-CCTGCATTCAAAGCCAAC-3′(SEQ ID NO：10)
探针C1：5′-ATCACTGGCCAGAGGC-3′(SEQ ID NO：11)
探针C2：5′-ATCAATGGCCAGCGGC-3′(SEQ ID NO：12)
探针C3：5′-GGATCAATGGCCAGAGG-3′(SEQ ID NO：13)
探针C4：5′-GGACCCTTGGCCAGAG-3′(SEQ ID NO：14)
探针C5：5’-GGATCATTGGCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)
探针C6：5’-GATCATTGGCCAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：16)
探针C7：5’-TCACTGGCCAGAAGCAA-3’(SEQ ID NO：17)
探针D：5′-CAGCCTTCAGAGCAAACA-3′(SEQ ID NO：18)
传统的印迹杂交方法是将靶DNA固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与待检靶DNA相互接触并杂交，显影或显色后判定结果。用这种方法每次杂交反应只能检测一个待测DNA中是否含有某一种探针的互补序列，即一次只能判断一种基因型。如果某个基因座位有多种等位基因(如HLA-A，HLA-B，HLA-DR位点)或要检测多个靶序列(如地中海贫血突变基因，ABO血型等)，用这种点杂交方法一次性检测就很繁杂，甚至难以完成。而反向斑点杂交方法则是先设计针对各等位基因的特异性探针，并将探针点加到杂交基质上，然后再将待测DNA样品(一般是使用5′-端标记有生物素或地高辛等分子的引物PCR扩增靶DNA片段后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有互补序列的探针结合，洗涤除去未结合的DNA后，即可检测到特异性结合的靶序列。因此，使用该方法可一次同时检测某一位点的正常及其相关的多种突变形式，或不同位点的正常或突变。
传统的印迹杂交法杂交使用的液体，包括PCR产物、预杂交液、杂交液、预显色液、显色液都是与基质表面接触，孵育一段时间后从基质表面吸走液体。这种表面接触的方式，分子间运动需要一定时间才能达到杂交反应的要求，因此传统的印迹杂交法需要足够长的孵育时间。本发明杂交时使用了导流装置，杂交使用的液体包括PCR产物、预杂交液、杂交液、预显色液、显色液，这些液体试剂都是借助压力作用下穿过基质，从而大大提高了核酸分子的扩散率以及局部反应的浓度和杂交效率，从而大大缩短了孵育时间，使实验操作方便快捷。
为了完成本发明的方法，首先常规制备待检者血液中的乙型肝炎病毒DNA。经DNA提取液处理后离心收集上清液，并将该上清液用于PCR扩增反应。以如上得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA为模板，并用合成的正向和反向寡核苷酸引物进行PCR扩增。变性处理所得到的DNA扩增产物后，使之分别与足以揭示不同的乙型肝炎病毒(HBV)基因型的寡核苷酸探针杂交。最后，根据杂交产物染色后的颜色变化判断乙型肝炎病毒(HBV)不同的基因型。现针对本发明方法的几个主要步骤，分别详细描述如下。
1、引物探针的设计
相关文献证实，HBV基因组中S区基因序列进行分型可体现HBV全基因组分型状况，本研究根据已知乙型肝炎病毒的序列，比对后选取高度保守的PreS1区(nt2921-nt3102)作为目标区域，设计出3条通用探针，2条A型探针，1条B型探针，7条C型探针，1条D型探针；通过通用探针可以检出是否有HBV感染，其它11条探针则可检测出具体型别感染；合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化。
所有设计的型特异探针，都比其他型的乙肝病毒基因组全序列至少有两个碱基以上的差异。这一设计，使得其他型乙肝病毒的杂交更为困难，从而最大程度的避免了非特异的产生。
2、杂交载体的制备
用作杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料制成的。新合成的探针以适当方式固定在膜条的适当位置。其中三条通用探针稀释成一管，每条探针终浓度均为10pm/μl，将合成一管后液体点至一个位置，形成通用探针点(PC点)，将稀释好探针点样后用NaOH溶液处理膜条并用蒸馏水充分洗涤，然后保存于-20℃备用。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的适当方式，包括将探针通过紫外线交联，以及用氨基标记的探针交联EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigma公司)处理过的硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料。
3、核酸的提取
采用常规DNA提取液提取人个体血液样品中的乙型肝炎病毒DNA。例如，用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60分钟或离心后析出血清。吸取上层血清100μl，转移至1.5ml灭菌离心管，并加入等量的浓缩液(3％～10％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠)充分混匀，12000rpm离心10分钟后，去上清收集管底沉淀。向沉淀中加入20μl的DNA提取液，充分混匀，沸水浴10分钟并以12000rpm离心10分钟，取2μl上清液作为PCR反应模板。
4、核酸扩增体系的优化
在PCR扩增中，首先利用降落PCR摸索退火温度，以及摸索反应条件借以提高核酸扩增的特异性和高效性。特别是，我们对PCR扩增中使用的引物和其浓度、以及Mg2+、模板等其他反应物的浓度均作了适当的调整和最佳化。
5、反向斑点杂交体系的优化
反向斑点杂交结合PCR-斑点印迹杂交技术和过滤杂交，其操作过程包括：例如，首先将如前制备的HBV基因分型膜条固定在杂交仪上，杂交时，先95℃变性PCR扩增产物5分钟，然后置冰中冷却2分钟以上，再在约45℃预热的杂交液I的存在下，于带有多孔滤板和负压抽吸泵的核酸分子快速杂交仪的杂交槽内，使PCR扩增产物与5′端氨基标记的探针杂交约8分钟。杂交反应完成后，经洗膜和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所显色的探针类型来判断各个体的基因型。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交仪为配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置。
由图3所示的检测实例可以看出，如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO：7)、探针2(SEQ ID NO：4-6)显色、探针3(SEQ ID NO：8)和探针4(SEQ ID NO：9)其中一个点显色或者同时显色，可判定HBV基因型为A型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO：7)、探针2(SEQ ID NO：4-6)和探针5(SEQ ID NO：10)显色，可判定HBV基因型为B型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO：7)、探针2(SEQ ID NO：4-6)显色、探针6(SEQ ID NO：11)、探针7(SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14)、探针8(SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：17)和探针9(SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)其中一个点显色或者同时显色，可判定HBV基因型为C型；如果显色反应控制探针1(SEQ ID NO：7)、探针2(SEQ ID NO：4-6)和探针10(SEQID NO：18)显色，可判定HBV基因型为D型；如果有显色反应控制探针1(SEQID NO：7)和探针2(SEQ ID NO：4-6)显色，说明检测的病原体为HBV；如果只有显色反应控制探针1(SEQ ID NO：7)显色，其它探针不显色则说明HBV为阴性或PCR扩增失败；如果有各型别探针：A型(3和4)、B型(5)、C型(6、7、8、9)、D型(10)中的型别点一种或几种型别点同时显色，则判断为混合感染。(参见图3)。在显色反应中，使用显色系统进行显色，例如，使标记物生物素与链霉素抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(POD)特异性结合，使底物四甲基链苯胺(TMB)生成蓝色的沉淀。然后，借助计算机图像分析或肉眼判读结果。在杂交显色过程中，若使用链酶亲和素偶联碱性磷酸酶同样可以和生物素结合，并使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐(BCIP)生成深蓝色沉淀而完成本发明中的显色过程。
另外，本发明通过反复摸索不同的杂交温度和探针浓度(例如，将杂交温度设定在45℃，探针浓度定为10pmol/L)，可使检测的结果更为准确可靠，并具有更好的检测稳定性(可重复性)。
本发明中，由于发明人对靶DNA片段的扩增体系和杂交体系进行了优化，设计并合成了特异性强的探针和引物，同时检测中使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，从而保证了方法的快捷和检测结果的可靠性。
如前所述，由于反向斑点杂交方法能够同时检测目的基因内多个碱基的突变或多态性，所以在病原体及复杂遗传性疾病的检测中有着更为简便的优越性。在乙肝的诊疗中，乙型肝炎病毒基因型与重症肝病(肝硬化、肝癌等)的发生和发展密切相关，且不同基因型对治疗药物(拉米夫定、干扰素)也有一定的关系，因此HBV基因型检测成为临床医务工作者研究的热点。本发明的HBV基因型检测方法显然可以为乙型肝炎的诊断提供一种快速、简便、特异性和准确性均较高的实验室检验手段。
本发明的另一个目的是提供用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂；和(3)杂交反应试剂，特征在于所说的聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5′-GAGTATGCCCTGAGCCTGAG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTTTTTTCCCATCATCAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)和5′-TTTTTTTCCCGACCACCAGTT-3′(SEQ ID NO：3)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
探针1：生物素-5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′-NH2(SEQ ID NO：7)
探针2：5′-NH2-ATCCAGATTGGGACTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)
5′-NH2-ATCCAGATTGGGACCTCA-3′(SEQ ID NO：5)
5′-NH2-CGCACGGAGGCCTTTT-3′(SEQ ID NO：6)
探针3：5′-NH2-ACCACTGGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO：8)
探针4：5′-NH2-ACCACTGGCCAGCAGC-3′(SEQ ID NO：9)
探针5：5′-NH2-CCTGCATTCAAAGCCAAC-3′(SEQ ID NO：10)
探针6：5′-NH2-ATCACTGGCCAGAGGC-3′(SEQ ID NO：11)
探针7：5′-NH2-ATCAATGGCCAGCGGC-3′(SEQ ID NO：12)
5′-NH2-GGACCCTTGGCCAGAG-3′(SEQ ID NO：14)
探针8：5′-NH2-GGATCAATGGCCAGAGG-3′(SEQ ID NO：13)
5’-NH2-TCACTGGCCAGAAGCAA-3’(SEQ ID NO：17)
探针9：5’-NH2-GGATCATTGGCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)
5’-NH2-GATCATTGGCCAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：16)
探针10：5′-CAGCCTTCAGAGCAAACA-3′(SEQ ID NO：18)
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由3％～10％聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂是由dNTPs、耐热Taq酶等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV(3％的过氧化氢溶液)、杂交用膜条以及标准对照品。
如前所说，为简单快速地检测个体血液样品中乙型肝炎病毒(HBV)具体基因型，本发明提供了相应的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型反向斑点杂交检测试剂盒。具体地说，本发明的试剂盒提供：(1)包括由聚乙二醇和氯化钠组成的浓缩液(2ml/管)和DNA提取液(500μl/管)的血液样品HBV DNA抽提试剂；(2)包括PCR反应混合液(共10管，每管含PCR反应缓冲液、Mgcl2(1.6mmol/L)、dNTPs(0.2mmol/L)、正反向引物(0.1umol/L)，以及Taq酶(3u/μl，1管)的聚合酶链反应试剂；(3)由常规的20×SSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉素抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(POD)组成的杂交检测试剂，另外还包括用作杂交反应载体的膜条10张。
本发明的试剂盒除提供了各位点所对应的特异性探针外，还配有显色反应控制探针和标准对照品。
本发明的方法中，由于使用了针对各种类型HBV核酸序列所设计的引物扩增靶核酸序列，并设计了显色对照探针及检测HBV基因型寡核苷酸探针进行核酸杂交分析，所以该方法能够准确而有效地鉴别和区分HBV基因型。而且，本发明的方法不仅能用于检测单一HBV感染，而且能够定性和定量地检测HBV的混合感染，从而为乙型肝炎的临床个体化治疗提供分子病毒学证据，为临床用药提供有意义的参考。另一方面，由于本发明结合使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，其导流杂交的特性大大提高了核酸分子的扩散率、局部反应的浓度和核酸杂交效率。一般说来，使用本发明的方法和试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需要约4-5小时的时间，与传统的杂交方法相比，本方法的发明显然还具有操作简单、快速方便的优点。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
表1HBV基因分型型别判定表
| 样品号 | 探针显色情况 | 基因型 |
| 1 | ①、②号探针显色 | HBV感染 |
| 2 | ①、②号显色、③号或④号探针显色 | A型感染 |
| 3 | ①、②号显色、⑤号探针显色 | B型感染 |
| 4 | ①、②号显色、⑥号、⑦号、⑧号、⑨号其中之一或者同时探针显色 | C型感染 |
| 5 | ①、②号显色、⑩号探针显色 | D型感染 |
附图说明
图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。1号探针具有SEQ ID NO：7所示的序列，2号阳性控制探针具有SEQ ID NO：4-6所示的序列，3号探针有SEQ ID NO：8所示的序列，4号探针具有SEQ ID NO：9所示的序列，5号探针具有SEQ ID NO：10所示的序列，6号探针具有SEQ ID NO：11所示的序列，7号探针具有SEQ ID NO：12以及SEQ ID NO：14所示的序列，8号探针具有SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：17所示的序列，9号控制探针具有SEQ ID NO：15以及SEQ ID NO：16，10号控制探针具有SEQ ID NO：18所示的序列。
图2显示靶DNA扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳图，其中第1-6泳道为特异性靶DNA片段(180bp)，M泳道为标准分子量标志。
图3显示五种不同基因型样品的反向斑点杂交检测结果。其中①号探针为显色探针，用于控制显色反应的整个过程；②号探针为阳性对照探针，如果显色，则代表所检测的生物样本为HBV；③号和④探针为A型特异探针，单一或同时显色判定为A型。⑤号探针为B型特异探针，显色判定为B型。⑥号、⑦号、⑧号、⑨号为C型特异探针，单一或者同时显示均判定为C型。⑩号为D型特异型探针，显色判定为D型。(参见表1和图3)。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：样品靶核酸的制备
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22～25℃)放置30～60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟；吸取上层100μl血清，转移至1.5ml灭菌离心管。然后向离心管内加入等体积的DNA浓缩液并混匀，12000rpm离心10分钟后，收集管底沉淀。向沉淀中加入常规的DNA提取液20μl，充分混匀，沸水浴10分钟并以12000rpm离心10分钟。取2μl上清液作为PCR反应模板。在浓缩液的配方中，我们采用了不同浓度聚乙二醇(3％～10％)和氯化钠组合，3％～10％的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠均能有效的对血清中HBV的浓缩。
实施例2：靶核酸的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液若干管，直接加入2μl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀，瞬时(3秒)离心后，将各反应管放入PCR仪。按下列条件扩增：93℃预变性6分钟，然后按93℃ 30秒，58℃ 40秒，72℃ 45秒扩增10个循环，93℃ 30秒，56℃ 40秒，72℃ 45秒扩增10个循环，93℃ 30秒，55℃40秒，72℃ 45秒扩增15个循环，共35个循环；最后72℃保温7分钟。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)。
实施例3：四种已知基因型的样品反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)与杂交液II混合并预热至45℃备用。根据待检样品的数目取相应个数的1.5ml离心管，各管分别加入0.65ml杂交液I并预加热至42℃。将PCR扩增产物98℃变性处理8分钟后，置于冰水混合物中放置8-10分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000∶2)混合溶液作为结合液4℃保存备用，并取溶液II∶溶液III∶溶液IV(1900∶200∶1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作为显色液避光备用。
杂交前用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板，打开水泵以排出多孔板上的水份。设定杂交仪温度为45℃，首先将塑料垫片置于金属多孔板上并将乙型肝炎病毒(HBV)基因分型膜条置于塑料垫片上，盖好硅胶分隔室和压扣盖。每个分隔室加入杂交液I(1ml)预杂交，再将变性后的PCR扩增产物加入到盛有45℃保温的0.65ml杂交液I的EP管中，混匀后加入杂交槽中温育10分钟，并开泵进行杂交导流。加入预热的杂交液II清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。在设定的杂交仪温度(25℃或室温)下加入结合液(每孔1ml)。静置2分钟后泵出结合液，再加入室温杂交液I清洗膜条(每孔1ml，各重复洗3次)。随后加入溶液II静置2分钟后泵干，最后加入新鲜配制的显色液(每孔1ml)，显色大约7分钟后开泵抽干显色液观察结果(参见附图3)。
由图3所示的结果可以看出，发生特异性杂交的各探针的显色情况均清晰可见。可根据附图一所示的排列格式判读出单一和混合感染。
实施例4：不同的恒温装置进行反向斑点杂交检测。
采用恒温水浴锅和空气浴杂交炉对上述五种不同基因型的样本进行了检测，检测结果同导流杂交仪的检测结果一致，说明恒温水浴和空气浴装置同样可以用来对样品进行检测。
实施例5：不同基因型样品的反向斑点杂交基因分型检测结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对400份采自慢性乙型肝炎患者的DNA样品进行HBV基因分型位点检测，其中380例样本得以正确的分型。为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有上述400例样本进行了序列测定。结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序结果基本吻合，特异性达95.3％，同时将标本进行定量拷贝数分析，其中有45例为103copies/ml，8例为102copies/ml，均能准确分型，将高拷贝血清进行梯度稀释后，检测B型可以达到102copies/ml，其余型别均可以达到103拷贝/ml。
序列表
<110>中山大学安达基因股份有限公司
<120>乙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒
<140>
<141>
<160>18
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
GAGTATGCCC TGAGCCTGAG
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
TTTTTTTCCC GATCATCAGTTG
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>3
TTTTTTTCCC GACCACCAGT T
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>4
ATCCAGATTG GGACTTCAA
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>5
ATCCAGATTG GGACCTCA
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>6
CGCACGGAGG CCTTTT
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>7
GCCGTAACCGTCACAATCCG T
<210>8
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>8
ACCACTGGCC ACAAGC
<210>9
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>9
ACCACTGGCC AGCAGC
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>10
CCTGCATTCA AAGCCAAC
<210>11
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>11
ATCACTGGCC AGAGGC
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>12
ATCAATGGCC AGCGGC
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>13
GGATCAATGG CCAGAGG
<210>14
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>14
GGACCCTTGG CCAGAG
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>15
GGATCATTGG CCAGAGG
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>16
GATCATTGGC CAGAAGCA
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>17
TCACTGGCCA GAAGCAA
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>18
CAGCCTTCAG AGCAAACA
Claims (5)
1. 鉴定和区分临床血液样品中乙型肝炎病毒不同基因型的方法，该方法包括以下步骤：(1)提供待检血清或血浆标本并从中提取DNA；(2)根据乙型肝炎病毒基因组保守区设计分型引物和探针；(3)使用小分子标记寡核苷酸引物进行聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(4)使用被标记的靶DNA扩增产物与特异性寡核苷酸探针杂交；(5)检测杂交结合物并借以判断乙型肝炎病毒的不同基因型。特征在于：I)反应试剂都是借助压力通过穿过杂交膜；II)使用具有不同碱基序列的型特异探针。
2. 根据权利要求1的方法，特征在于其中所使用的引物是：
上游引物：5′-GAGTATGCCCTGAGCCTGAG-3′(SEQ ID NO：1)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGATCATCAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGACCACCAGTT-3′(SEQ ID NO：3)。
3. 根据权利要求1的方法，其特征在于本方法使用的寡核苷酸探针为：
探针PC1：5′-ATCCAGATTGGGACTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)
探针PC2：5′-ATCCAGATTGGGACCTCA-3′(SEQ ID NO：5)
探针PC3：5′-CGCACGGAGGCCTTTT-3′(SEQ ID NO：6)
探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：7)
探针A1：5′-ACCACTGGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO：8)
探针A2：5′-ACCACTGGCCAGCAGC-3′(SEQ ID NO：9)
探针B：5′-CCTGCATTCAAAGCCAAC-3′(SEQ ID NO：10)
探针C1：5′-ATCACTGGCCAGAGGC-3′(SEQ ID NO：11)
探针C2：5′-ATCAATGGCCAGCGGC-3′(SEQ IDNO：12)
探针C3：5′-GGATCAATGGCCAGAGG-3′(SEQ ID NO：13)
探针C4：5′-GGACCCTTGGCCAGAG-3′(SEQ ID NO：14)
探针C5：5’-GGATCATTGGCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)
探针C6：5’-GATCATTGGCCAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：16)
探针C7：5’-TCACTGGCCAGAAGCAA-3’(SEQ ID NO：17)
探针D：5′-CAGCCTTCAGAGCAAACA-3′(SEQ ID NO：18)。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所说的小分子选自于生物素、地高辛和染料分子。
5. 用于检测乙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括(1)杂交膜、(2)由杂交液I和II、溶液I、II、III和IV组成的反向斑点杂交反应试剂，和(3)由DNA提取液、DNA浓缩液、dNTP、耐热Taq酶、阳性标准品组成的聚合酶链反应试剂，特征在于其中所应用的引物和探针分别为：
上游引物：5′-GAGTATGCCCTGAGCCTGAG-3′(SEQ ID NO：1)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGATCATCAGTTG-3′(SEQ ID NO：2)
下游引物：5′-TTTTTTTCCCGACCACCAGTT-3′(SEQ ID NO：3)
探针PC1：5′-ATCCAGATTGGGACTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)
探针PC2：5′-ATCCAGATTGGGACCTCA-3′(SEQ ID NO：5)
探针PC3：5′-CGCACGGAGGCCTTTT-3′(SEQ ID NO：6)
探针IC：5′-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3′(SEQ ID NO：7)
探针A1：5′-ACCACTGGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO：8)
探针A2：5′-ACCACTGGCCAGCAGC-3′(SEQ ID NO：9)
探针B：5′-CCTGCATTCAAAGCCAAC-3′(SEQ ID NO：10)
探针C1：5′-ATCACTGGCCAGAGGC-3′(SEQ ID NO：11)
探针C2：5′-ATCAATGGCCAGCGGC-3′(SEQ ID NO：12)
探针C3：5′-GGATCAATGGCCAGAGG-3′(SEQ ID NO：13)
探针C4：5′-GGACCCTTGGCCAGAG-3′(SEQ ID NO：14)
探针C5：5’-GGATCATTGGCCAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)
探针C6：5’-GATCATTGGCCAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：16)
探针C7：5’-TCACTGGCCAGAAGCAA-3’(SEQ ID NO：17)
探针D：5′-CAGCCTTCAGAGCAAACA-3′(SEQ ID NO：18)。
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