CN107619867A - 用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合和探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合和探针。本发明提供了高灵敏度、高特异性的序列组合、探针、基因芯片和试剂盒，可以同时检测62个相关的热点突变基因的点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因等突变类型。本发明所提供的方法具有全面、快速、高通量、性价比高、灵敏性高和特异性强等特点，大大提高检测效率。

Description

用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合和探针

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合和探针。

背景技术

原发性肺癌(简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织(WHO)癌症Globocan数据库，2012年我国新发肺癌患者达65.28万，居所有恶性肿瘤之首，约占全球1/3，其中80％以上的患者为非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer)。近十多年来，随着分子医学的进展和靶向药物的不断涌现，非小细胞肺癌的治疗已由化疗为主进入到个体化分子靶向“精准”治疗的时代。目前临床应用的个体化分子靶向治疗主要针对表皮生长因子(EGFR)突变型和间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因型肺癌，这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。其他基因变异型肺癌的靶向药物和伴随分子诊断(companion diagnostics)技术正在不断研发中。临床进行靶向治疗前需要对患者进行基因检测，筛选有效患者，其检测流程：患者首先进行EGFR基因检测，若EGFR基因发生突变，则使用EGFR抑制剂，若EGFR基因未发生突变，则进一步检测ALK基因融合变异，若ALK基因发生融合变异，则使用ALK抑制剂，若ALK基因未发生融合变异，则需要进行化疗方案。

EGFR基因突变目前主要应用QPCR方法进行检测，ALK基因变异主要应用FISH、ISH方法进行检测，对患者完成这两个基因所有的突变位点检测在临床操作面临着一定的难度。根据《中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识(2016版)》中的报道：EGFR基因的检测有敏感突变和耐药突变两种，其中敏感突变包括：外显子19缺失突变(19del)、21外显子点突变(L858R)、G719X、L861Q和S768I；耐药突变包括：外显子20插入突变(20ins)和外显子20点突变(T790M)，一共约31种突变类型，需要进行多次的检测，这就需要大量DNA样本，而某些肺癌病人的活检取样量无法满足检测需求。患者经过多次EGFR基因检测阴性后，才能再次进行ALK融合基因检测，这样势必会延长检测周期，延误病情，耽误患者治疗。

因此，急需一种新的检测方法，能够全面、灵敏、特异和稳定的对肺癌进行分子分型诊断，使患者得到及时、有针对性的治疗，降低医疗成本，节约社会资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合、探针、基因芯片和试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种同时检测肺癌多种基因突变类型测序文库的构建和检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合，所述序列组合包括下表的基因序列。

上述序列组合包含全部肺癌相关热点变异基因的高突变区域，根据NCCN指南、专家共识、相关文献报道及ClinVar、Cosmic等医学网站的资料筛选而得到，包括与肺癌分期、治疗、预后判断及耐药相关的驱动基因、靶向基因、以及信号通路基因EGFR、ALK等62个基因，可以实现同时检测62种基因包括点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和基因融合等多种突变类型。

本发明还提供一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的探针，所述探针包括针对上述序列组合的探针。

上述探针针对肺癌相关的62个热点突变基因234个高突变区域，能够一次性完成62个基因的234个热点区域的检测，可以实现同时检测包括点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和基因融合等多种突变类型，大大缩短检测进程，提高检测的灵敏度和准确率。

作为本发明所述用于同时检测肺癌多种基因突变类型的探针的优选实施方式，所述探针长度为22.5kb。

具有上述长度的探针，既可以尽可能多地检测所需类型的突变，又能进一步提高检测效率。

本发明还提供一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的基因芯片，所述基因芯片包括上述任一项所述的探针。

本发明还提供一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的探针或上述的基因芯片。

作为本发明所述的用于同时检测肺癌多种基因突变类型的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括文库构建试剂、探针杂交洗脱试剂、引物、接头和核酸纯化试剂。

本发明还提供一种同时检测肺癌多种基因突变类型测序文库的构建方法，包括以下步骤：

S1：设计并合成上述任一项所述的探针；

S2：提取待检测样本中的gDNA和ctDNA；

S3：利用提取的DNA构建样本文库；

S4：将S3构建的样本文库与S1合成的探针进行杂交捕获；

S5：去除未结合序列，将捕获序列洗脱下来，并进行扩增和纯化，得到目的文库。

上述技术方案非常适合应用于选择性的捕获特异性的目标基因，在这样的应用中，通常会针对疾病相关的十几个甚至数百个特定的基因进行同时检测，应用设计好的探针，和待测样本所构建的文库进行杂交，捕获目标区域DNA片段，通过测序完成对疾病相关热点突变基因、热点区域的检测，这种方法不仅具有高通量、高性价比的优势，而且检测结果具有较高的准确性和灵敏性。

本发明还提供一种同时检测肺癌多种基因突变类型的方法，根据上述方法构建同时检测肺癌多种基因突变类型测序文库，上机测序，获得测序数据，对测序数据进行变异分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)通量高：通过靶向捕获方法和高通量测序结合，一次性检测完成62个基因的234个热点区域的检测；

2)灵敏度高：本发明可以从肺癌的患者血浆样本中所提取的低至1ng的DNA中检测到突变，而且本发明应用高通量测序，单个样本的测深度可以达到10000×，可以检测到低至0.1％的突变；

3)特异性高：用本发明的探针和捕获测序平台检测肺癌患者血液样本和健康人血液样本，只有肺癌患者ctDNA测序分析后为恶性突变，显示结果为阳性，而健康人ctDNA的测序分析结果显示为阴性，说明本发明有很好的特异性；

4)性价比高：一次检测可以完成234个热点变异区域的检测，平均到每个变异区域，和现有检测单个突变位点的QPCR技术相比，则大大降低了检测费用。

附图说明

图1为文库YF001的2100检测图；

图2为文库YF002的2100检测图；

图3为文库YF003的2100检测图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明根据已获得的肺癌相关的62个热点突变基因信息为基础，构建了针对肺癌相关62个热点突变基因234个高突变区域的探针和检测试剂盒。

探针的设计根据NCCN指南、专家共识、相关文献报道及ClinVar、Cosmic等医学网站的资料筛选基因、突变位点或相关区域，确定探针的目标区域，设计合成探针，用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合如表1所示。

表1

探针长度优选为22.5kb，具有此长度的探针，既可以尽可能多地检测所需类型的突变，又能进一步提高检测效率。

首先将提取到的样本DNA打断成200～250bp的DNA片段(ctDNA不需要打断)，经过末端修复、加“A”及连接过程将DNA片段连上index接头，经PCR扩增后获得捕获前文库，随后将该文库与含有待捕获的靶标基因区域DNA片段杂交，捕获肺癌相关热点突变基因的DNA片段，对这些DNA片段进行测序，经过生物信息学分析后获得样本检测结果。该实例包括从样品基因组DNA到测序结果输出的全部实验流程，主要包括样本采集、捕获前文库构建、杂交捕获、测序及数据分析四方面内容。

一、样本采集、运输及保存制备

本发明样本采集使用无菌操作收集肺癌患者血液样本、活检穿刺样本和手术组织样本。其中血液样本利用Streck Cell-Free DNA BCT采血管收集，常温运送达实验室。活检穿刺样本和手术组织样本，在低温环境中运输且需要在24小时内送达实验室。采集的样本在2～8℃条件下保存不超过72小时；-20℃条件下保存不超过1个月；需长期保存的样本需放于-80℃条件下保存。

二、样本基因组DNA提取

样本基因组DNA的提取方法参照Qiagen公司的QIAamp Circulating NucleicAcid Kit试剂盒，分别提取了编号为YF001、YF002、YF003三个肺癌患者的血浆样本。

三、捕获前文库构建

(1)末端修复及加A

①在PCR管里按如表2所示体系配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

表2

试剂	体积(μL)
		End-Repair&A-Tailing Buffer	6
End-Repair&A-Tailing Enzyme Mix	1
		Sample	20ng
Low EDTA TE	Y
		Total	60

②放入PCR仪，按如表3所示的反应条件设置程序进行反应。

表3

步骤	温度	时间	热盖
				1	20℃	30min	85℃
2	65℃	30min	85℃
				3	4℃	Hold	85℃

(2)末端修复II

①在上步PCR管里按如表4所示体系配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

表4

试剂	体积(μL)
		上步产物	60
PCR-grade water	8.75
		Ligation Buffer	30
DNA Ligase Enzyme	10
		Adapter	1.25
Total	110

②放入PCR仪，20℃，15min。请勿加热PCR仪盖子或将PCR仪的盖子打开。

③纯化

将Ampure XP磁珠溶液从4℃冰箱取出，室温孵育30分钟，充分混匀。在文库管中加入88μL(0.8x体积)混匀的Ampure XP，Votex混匀5s，室温放置5min。短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min至溶液澄清，吸除乙醇，重复洗涤一次。

室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降)。然后，加入20μL Low EDTA TE，室温孵育5min，短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清，吸出上清液至标记好的新PCR管中。

(3)扩增连接上了adaptor的文库

①在PCR管里按表5所示反应体系配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

表5

②放入PCR仪，按如表6所示的反应条件设置程序进行反应。

表6

3)纯化

充分混匀Ampure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。在文库管中加入50μL(1x体积)混匀的XP beads，Votex混匀5s，室温放置5min。短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇，重复一次。

室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降)。然后加入20μL Low EDTATE，室温孵育5min，短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清，吸出上清液至标记好的新PCR管中。

四、捕获文库构建

(1)文库定量混合

取1μL文库进行Qubit 3.0定量，获得文库浓度。取1μL进行2100检测片段大小，结果如图1所示，其中，图1为文库YF001的2100检测图；图2为文库YF002的2100检测图；图3为文库YF003的2100检测图。

将所构建的3个文库，混合在一起，每个文库混合167ng，计算得到各文库所用体积，如表7所示：

表7

文库标号	文库浓度(ng/μL)	文库所用体积(μL)
			YF001	32.6	5.12
YF002	48.8	3.42
			YF003	31.5	5.3

(2)杂交

在PCR管里如表8所示的反应体系配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

表8

用真空抽干机进行浓缩，温度≤70℃，直至文库浓缩完全。对于每一个浓缩后的DNA文库，分别加入13μL的Hybridization Mix(杂交捕获混合物)，Hybridization Mix具体配比信息如表9所示：

表9

试剂	体积
		2×Hybridization Buffer	8.5μL
Hybridization Buffer Enhancer	2.7μL
		Nuclease-Free Water	1.8μL
总体积	13μL

用枪上下吹吸8-10次，然后盖紧管盖，高速涡旋振荡5s，短暂离心将管壁液体收集到管底，室温孵育10min。放入PCR仪，95℃加热10min。

用另一台PCR仪设置杂交程序，具体程序反应条件如表10所示(热盖温度设置为75℃)：

表10

步骤	循环数	温度	时间
				1	1	65℃	>4h

取下样本，迅速将4μL的探针加入到文库混合液中，用枪上下吹吸混匀8-10次。再次确认所有的管盖已经盖紧，高速涡旋振荡5s，短暂离心，然后放回到已设置好杂交程序的PCR仪中进行过夜杂交。

重要：务必保证管盖盖紧，最小化减少杂交混合液体积的蒸发，否则将会影响杂交效果。

(3)捕获和洗脱

Dynabeads M-270Streptavidin beads，提前30min拿出涡旋混匀置于室温平衡。金属浴预热至65℃。

a)配置洗脱工作液：

b)按表11配置1×工作液

表11

试剂	原液体积(μL)	H2O体积(μL)	总体积(μL)
				2×Bead Wash Buffer	250	250	500
10×Wash Buffer I	30	270	300
				2×Wash Buffer II	20	180	200
2×Wash Buffer III	20	180	200
				10×Stringent Wash Buffer	40	360	400

按表12进行温育工作液。

表12

试剂	体积(μL)	温度	时间
				1×Wash Buffer I	100	65℃	>2h
1×Stringent Wash Buffer	400	65℃	>2h

其余工作液置于室温。

c)冲洗Dynabeads M-270Streptavidin beads：

每个文库取100μL涡旋混匀的Dynabeads M-270Streptavidin beads于0.2ml低吸附离心管中，将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清液。加入200μL 1×Bead WashBuffer，吹吸8-10次混匀。将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清液，重复一次。加入100μL 1×Bead Wash Buffer，吹吸8-10次重悬磁珠。将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清液。注意：此步骤结束后立马进入下一步骤。

d)捕获：

将杂交后的文库转入Beads管中，吹吸8～10次混匀。放入PCR上，65℃孵育45min，热盖温度设为75℃。每隔12min将文库取出涡旋3s，保证磁珠悬浮。

e)洗脱：

加入100μL经过65℃预热的1×Wash Buffer I，轻柔涡旋，瞬离。把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。加入200μL经过65℃预热的1×Stringent WashBuffer I，用枪上下吹吸至少10次让bead重新悬浮，避免产生气泡。在金属浴上65℃孵育5min。把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液，重复一次。

加入200μL室温放置的1×Wash Buffer I，涡旋2min，瞬离。把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

加入200μL室温放置的1×Wash Buffer II，涡旋1min，瞬离。把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

加入200μL室温放置的1×Wash Buffer III，涡旋30sec，瞬离。把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

最后一遍冲洗完成后，短暂离心，再次置于磁力架上，确保所有的Wash Buffer被吸除。

加入20μL nuclease-free water，用枪上下吹吸至少10次让bead重新悬浮。

(4)杂交捕获后的PCR扩增

AMPure XP bead提前30min拿出涡旋混匀置于室温平衡。

在冰上按照下表13体系配制PCR反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

表13

试剂	体积(μL)
		Captured on-bead DNA	20
2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix	25
		Reagent R1	5
总体积	50

确认将含有磁珠的反应液混匀后，将管子放入PCR仪中进行扩增，注意更换管盖，PCR仪参数设置如下表14：

表14

(5)纯化

充分混匀AMPure XP bead悬浮液，直至悬浮液颜色均一。向PCR管中加入75μl(1.5X体积)混匀的AMPure XP bead悬浮液和PCR扩增后的DNA文库，Votex混匀，室温放置5min。短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约3min至溶液变澄清。在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min至溶液澄清，吸除乙醇，重复一次。

室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降)。加入20μL nuclease-free water，在votex上混匀，室温放置5min。短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。吸取大约20μL上清液到一个新的标记好的1.5mL管中。取1μL样品进行Qubit 3.0定量。取2μL样品进行qPCR定量。

五、库检上机

文库库检合格后上机，上机平台选择Illumina平台的Nextseq 500测序仪，测序策略为PE150，双端index测序，每个文库的数据量为2G。

六、数据分析

针对测序仪下机数据，结合样本信息表，采用Illumina bcl2fastq(v2.17)转换软件，将Base calling文件转换成FASTQ格式文件。在总的FASTQ文件中进行样本标签识别并拆分样本。对得到的序列进行质控过滤后，采用BWA工具比对参考基因组。比对结果结合分子标签序列做进一步的去除冗余分析。各个样本的质控数据分析结果见下表15：

表15

表13结果表明，所有的样本均取得了良好的测序捕获效果，评价测序深度都在10000×以上，且各位点均一性较好，捕获效率都在85％以上，且同时检出了基因点突变、碱基插入、碱基缺失，下面列出了三个样本的检测结果。针对样本YF001的检测结果如下表16：

表16

针对样本YF002的检测结果如下表17：

表17

针对样本YF003的检测结果如下表18：

表18

实施例2

本实例采用Horizon Discovery公司的商业化标准品Multiplex I cfDNAReference Standard Set作为待检样本。Catalogue#：HD778为1％突变频率的ctDNA标准品，Catalogue#：HD779为0.1％突变频率的ctDNA标准品，通过该发明的试剂盒对标准品DNA进行捕获建库，经过生物信息学数据分析后获得标准品DNA的检测结果，并和已知的位点频率相比较，验证本发明的试剂盒检测的检测灵敏性和特异性。本实例方案包括从杂交前文库构建、杂交捕获、测序及数据分析三方面内容。

(一)、杂交前文库构建，实验操作步骤见实例1。

(二)、杂交捕获，实验操作步骤见实例1。

(三)、数据分析

分析流程见实例1，质控数据汇总结果见表19

表19

上述结果表明，所有的样本均取得了良好的测序捕获效果，评价测序深度都在10000×以上，且各位点均一性较好，捕获效率都在85％以上，并和预估值进行比对，结果见表20：

从表20中可以看出，利用本发明的检测试剂盒，可以将频率为1％和0.1％的标准品的突变频率完全检出，且与期望值具有很好的一致性，检出的灵敏性和特异性为100％。

表20

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括下表的基因序列。

2.一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的探针，所述探针包括针对权利要求1的序列组合的探针。

3.根据权利要求2所述用于同时检测肺癌多种基因突变类型的探针，所述探针长度为22.5kb。

4.一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的基因芯片，所述基因芯片包括权利要求2～3任一项所述的探针。

5.一种用于同时检测肺癌多种基因突变类型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2～3任一项所述的探针或权利要求4所述的基因芯片。

6.根据权利要求5所述的用于同时检测肺癌多种基因突变类型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括文库构建试剂、探针杂交洗脱试剂、引物、接头和核酸纯化试剂。

7.一种同时检测肺癌多种基因突变类型测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：设计并合成权利要求2～3任一项所述的探针；

S2：提取待检测样本中的gDNA和ctDNA；

S3：利用提取的DNA构建样本文库；

S4：将S3构建的样本文库与S1合成的探针进行杂交捕获；

S5：去除未结合序列，将捕获序列洗脱下来，并进行扩增和纯化，得到目的文库。

8.一种同时检测肺癌多种基因突变类型的方法，其特征在于，根据权利要求7所述方法构建同时检测肺癌多种基因突变类型测序文库，上机测序，获得测序数据，对测序数据进行变异分析。