CN110791500B - 一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒 - Google Patents

一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NGS方法检测肺癌基因突变的探针组合物及试剂盒。所述探针组合物选自核酸序列如SEQ ID NO 1～75所示的探针中的至少一种，其试剂盒适用于FFPE、组织及外周血ctDNA的基于NGS方法的肺癌基因突变检测，进而实现肺癌突变基因早筛和实时监测复发等目的。本发明独特设计的UMI双分子标签可以有效降低背景噪音，杜绝痕迹污染，去除假阳性，保证结果的准确性，使ctDNA检测中灵敏度达到0.1％。在组织检测中使用通用Short‑Y接头，其检测灵敏度可达到2％。给患者精准靶向治疗提供了更多的可能性。组织样本与血浆样本建库工作流程相似，保证流程的简便性，省时高效，易操作。

Description

一种基于NGS方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种肺癌突变基因检测组合物，尤其涉及一组探针组合物以及基于NGS方法检测肺癌基因的试剂盒。
背景技术
在临床肿瘤基因检测中NGS具有显著优势。二代测序可以同时检测到常见、罕见突变、基因融合、基因扩增等基因不同突变，指导靶向用药、揭示耐药机制。同时，基于NGS的液体活检技术可实现动态监测，更早提示肿瘤复发和转移。
血液中游离的DNA为cfDNA(Cell free DNA)，凋亡的细胞或已脱落的癌细胞体细胞DNA就被称作ctDNA。ctDNA具有与原发癌细胞DNA相同的基因突变或特点。这使ctDNA具有极高的特异性，可作为高灵敏的生物标记物。由于组织活检技术有许多限制因素。因此ctDNA在肿瘤领域中需求更加迫切，如辅助诊断、评估治疗疗效和揭示耐药机制到向肿瘤的复发监测及早筛。为肿瘤患者的诊断治疗起到了重要作用。
目前国内CFDA批准试剂盒全部为针对FFPE样本，用以检测组织中小Panle基因突变，而同时针对液态活检以及新鲜组合和FFPE组织的试剂盒，以及满足肺癌早筛要求的试剂盒目前市场中处于空缺状态。因此，如何能同时满足多类型样本的检测，即做到一盒多检，并且实现肺癌早期检测，是目前肺癌基因检测试剂盒所面临的挑战。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种探针组合物，用于肺癌病人精准治疗的分子诊断技术，支持组织检测和ctDNA液态活检，同时结合超高测序深度，可保证检测的灵敏度和结果准确性。本试剂盒中UMI双分子标签，能够有效去除背景噪音，杜绝痕量污染，使ctDNA检测中灵敏度达到0.1％，真正填补了国内市场中液态活检的空白。
本发明所述的探针组合物，是选自核酸序列如SEQ ID NO 1～75所示的探针中的至少一种，进一步优选为，选自核酸序列如SEQ ID NO 1～75所示的探针中的n种，其中n为2、3、4、5……～75的整数。本发明所述的探针组合物所针对的肺癌基因，覆盖多种可能的突变类型，包括点突变(SNPs)，插入和缺失(Indels)，基因扩增(CNV)，基因融合(Fusion)。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，包括上文所述的探针组合物。
优选地，上文所述的试剂盒，包括上述的探针序列为SEQ ID NO.1～NO 75所示的探针组合物，还包括接头；所述接头为具有UMI双分子标签接头或short-Y接头；其中，UMI双分子标签接头为基于Illumina通用接头的基础上添加6-8个碱基序列设计组成。碱基种类共计4^(6-8)个，所述具有UMI双分子标签接头用于血浆游离ctDNA的检测中接头连接步骤；所述UMI序列具有唯一性，每条DNA分子对应唯一的UMI标签，保证PCR扩增或者测序之后，生信分析人员可以追溯到DNA原始模板，从而降低背景噪音，排除假阳性突变的可能。所述short-Y接头为商品Cat：201664199，用于FFPE及组织样本检测的接头连接步骤。
本发明所述试剂盒可适用于FFPE、组织样本的分子检测以及血浆ctDNA样本的超低频分子检测，可用于肺癌基因检测。
利用上述试剂盒可用于基于NGS方法肺癌基因检测，其检测过程包括：样品采集，提取gDNA或ctDNA，UMI分子标签建库，Panel杂交，NGS测序，针对测序后的数据进行分析，判断样本的基因型。其中，Panel杂交步骤中包括上述的探针序列为SEQ ID NO.1～75所示的探针组合物以及接头。
本发明的有益效果：
1.本试剂盒针对肺癌患者的检测，同时满足FFPE组织、新鲜组织以及全血样本。
2.针对每个肺癌基因突变高度相关的区域设计探针，覆盖度高而均一，保证探针的高特异性。同时可一次性检测35个与肺癌突变基因，覆盖靶向用药基因，降低检测成本。
3.本发明采用UMI双分子标签使ctDNA检测中灵敏度达到0.1％，采用Short-Y接头使组织检测的灵敏度可达到2％。有效去除背景噪音杜绝痕量污染，结合超高深度测序，以保证结果准确性，实现肺癌突变基因的早筛以及实时监测预后复发问题。
4.本发明所述探针组合物的设计，是根据NCCN指南、FDA/CFDA指南，结合多个权威数据库，精选35个肺癌发生用药相关基因，包括肺癌获批靶向药物所有相关基因。探针捕获高度均一，同时检测全外显子和涉及基因融合的内含子区域，包括点突变(SNPs)，插入和缺失(Indels)，基因扩增(CNV)，基因融合(Fusion)和拷贝数变异。具有前瞻性，为将来产品升级做准备，又给现有患者精准靶向和科研提高了更多的可能性。
5.本发明SEQ ID NO 1～75所示的探针组合物，覆盖多种可能的突变类型，可以对样品同时进行已知或者未知的突变的检测。对于企业来讲，可用一个Panel解决不同患者所提供不同组织类型的问题，既节约成本又节约时间。
6.本发明所涉及方法简单，有助于实现产品从实验室向工业应用的转化，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本申请下述实施例中提取FFPE样本基因组gDNA使用Allprep DNA/RNA FFPE kit(Cat:80324)；提取血浆血液游离ctDNA使用Apostle MiniMaxTM敏迈高效游离DNA分离富集试剂盒(Cat：A17622)。
Qubit定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Cat：Q32854)。
本试剂盒名称为：NuoCancerTM Lung Cancer 35 Gene For Tissue/NuoCancerTMLung Cancer 35 Gene For cfDNA(肺癌35基因检测试剂盒，可以通过商业途径从基恩生物科技(大连)有限公司购买获得)，以下实验均按照该试剂盒说明书进行操作。
实施例1
本发明建库杂交捕获流程采用的验证方法如下：
一、提取基因组gDNA或血液游离ctDNA，所述基因组gDNA或血液游离ctDNA均来自医院临床样本，使用Qubit定量并质检
二、打断，末端修复，加A
【注意：针对组织gDNA样本执行a操作；针对液态活检ctDNA样本执行b操作】
1.在PCR仪上设置好以下程序：热盖温度设为70℃，反应液剂量设为50μL。
a:gDNA反应程序为：4℃下1min，32℃下12min，65℃下30min，4℃保持。
b:ctDNA反应程序为：4℃下1min，20℃下30min，65℃下30min，4℃保持。运行该程序，当PCR仪温度达到4℃时将程序暂停。
2.厚壁PCR管置于冰上，加入gDNA 200ng或ctDNA 25ng，加NFW(无核酸酶水)补至35μL。
3.加入打断末端修复Mix。
a:gDNA样本中加入5μL的FGB(DNA片段化末端修复加A缓冲液)和10μL的WFM(DNA片段化末端修复加A酶混合液)；
b:ctDNA样本中5μL的ERB(末端修复尾端加A缓冲液)和10μL的ERA(末端修复尾端加A酶混合液)。用枪温和地吹打混匀。
4.样本管简短离心，立即转移到PCR仪(已设好4℃)中，继续循环程序。
5.程序结束后，立即将样本管取出，放在冰上，立即进入接头连接步骤。
三、接头连接及纯化
1.在冰上PCR管中配Lligation Mix：LIB(DNA连接缓冲液)20μL，LIG(DNA连接酶)10μL，NFW(无核酸酶水)15μL，共计45μL。根据样本数进行配制，计入损耗。
2.样本管置于冰上加入5μL接头(当样本类型为组织时，加入从IDT购买的Cat：201664199的ShortY接头；当样本类型为血浆ctDNA时，加入本发明所述的具有UMI双分子标签的接头)和45μL的Ligation Mix枪上下混匀。
3.使用PCR仪温育连接反应液，20℃15min，取消热盖。
4.结束温育后立即使用80μL SPB(样本纯化磁珠)进行纯化，20μl EB回溶。
四、加标签，子文库扩增及纯化
1.准备扩增引物PCR反应混合物：HPM(增强型PCR混合液)25μL，UPM(唯一标签引物混合液)5μL，共计30μL。
2.将上步的30μL反应混合物加至20μL的连接后纯化产物中，操作保持在冰上。
3.如下表设置PCR仪程序，热盖温度105℃。进行扩增反应。
4.PCR循环结束后使用50μl SPB(样本纯化磁珠)进行纯化，27μl EB回溶。
五、子文库质控
用Qubit dsDNA BR Assay kit进行定量检测，用Agilent 2100生物分析仪或Agilent 4200 tapestation进行条带分析。文库浓度大于20ng/μL，主峰在150bp-500bp，则文库合格，可进行下一步杂交反应。
六、子文库样本pooling混合、浓缩和杂交
1.不同UPM的子文库(1-12个)，各取500ng，充分混匀。
2.样本浓缩杂交
(1)往不同UPM子文库混合液中加入7.5μL的HCD(人cot脱氧核糖核酸片段)。
(2)再加入2倍体积的SPB(样本纯化磁珠)，彻底混匀，室温静置10min。
(3)提前配制杂交反应Mix：HYB(杂交缓冲液)9.5μL，HYE(杂交增强缓冲液)3μL，HUB(杂交公用阻断剂)2μL，CPD-35(35基因肿瘤探针)探针4.5μL，共计19μL。
(4)将离心管置于磁力架上至少2min直至上清澄清。
(5)吸除上清，80％的乙醇清洗2遍。17μL杂交反应Mix回溶至PCR管。
(6)PCR仪热盖温度设为100℃，杂交程序为：95℃下30sec，65℃下16h，65℃保持。启动PCR程序杂交16-20h。
七、捕获洗脱
1.提前准备Buffer试剂
(1)将SMB(链霉亲和素磁珠)平衡至室温。10×清洗液室温放置至完全融化。
(2)清洗液稀释成1×工作液(单个杂交文库)，如下表格所示：
注意：如果10×WB1浑浊，可以在水浴锅中65℃温育溶解，溶液澄清后才可使用。1×工作液可以在室温(15–25℃)放置最多4周。
(3)在PCR管中配制Bead Resuspension Mix：HYB(杂交缓冲液)8.5μL，HYE(杂交增强缓冲液)2.7μL，NFW(无核酸酶水)5.8μL，共计17μL。
2.清洗链霉素磁珠
(1)漩涡15s使磁珠彻底混匀。
(2)按照一个反应50μL SMB(链霉亲和素磁珠)分装至1.7mL低吸附的离心管中。
(3)每个杂交用100μL 1×BWB(1×链霉亲和素磁珠清洗液)清洗磁珠，重复两次。
(4)用配好的17μL Bead Resuspension Mix重悬磁珠，彻底混匀。
3.磁珠捕获
(1)杂交16h后，取出样本。开启WASH程序：热盖70℃，程序65℃保持。
(2)将Bead Resuspension Mix重悬磁珠转移到样本杂交PCR管中吹打混匀。
(3)将PCR管置于PCR仪上，65℃温育45min。
(4)每10-12min在涡旋仪上进行混匀。
4.捕获后热清洗
【注意：此步要确保热清洗溶液温度为严格的65℃】
(1)孵育45min后，加入100μL 65℃预热的1×WB1(1×清洗液1)，枪混匀10次。
(2)将磁珠溶液管置于磁力架上，直至上清澄清，将液体完全去除干净。
(3)往样本管中加入150μL 65℃预热的1×SWB(1×增强型清洗液)。枪吹打混匀。在水浴中孵育65℃，5min。将离心管置于磁力架上放置1min，去上清。
(4)重复步骤七.4.(3)一次。
5.捕获后室温清洗
(1)往磁珠中加入150μL的1×WB1(1×清洗液1)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，充分混匀。
(2)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。
(3)往磁珠中加入150μL的1×WB2(1×清洗液2)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，确保充分混匀。
(4)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。
(5)往磁珠中加入150μL的1×WB3(1×清洗液3)。彻底混匀直至磁珠完全重悬。旋涡震荡混匀30s，暂停30s，再混匀30s，暂停30s，交替进行，共2min，充分混匀。
(6)磁力架上静置1min，待上清澄清时将上清去除。
(7)将离心管置于离心机上短暂离心，将残余的1×WB3(1×清洗液3)去除干净。
(8)加入20μL NFW(无核酸酶水)到磁珠中，吹打混匀使磁珠完全重悬。
八、富集文库扩增
1.按照下表设置PCR仪程序，热盖温度设置为105℃。
2.配制扩增反应Mix：HPM(增强型PCR混合液)25μL，LAP(文库扩增引物)1.25μL，ENH(扩增增强液)2μL，NFW(无核酸酶水)1.75μL，共计30μL(单个反应用量)。将上步重悬的链霉素磁珠转移至扩增反应Mix的PCR管中。
九、富集文库扩增后纯化
1.将SPB从4℃冰箱取出，平衡到室温。配制新鲜的80％乙醇。
2.将75μL SPB(样本纯化磁珠)加入到PCR产物中进行纯化，乙醇清洗两次。
3.21μL EB进行回溶。
十、杂交后混合文库质控
使用Qubit dsDNA HS Assay kit进行文库浓度检测，使用Agilent 2100Bioanalyzer或者Agilent 4200 Tapestation，浓度10ng/μL以下使用高敏试剂盒。根据主峰和浓度，换算摩尔浓度，要求摩尔浓度达到上机要求(如：2nM以上，浓度0.5ng/μL)。文库合格后可以上机测序。文库在-25℃至-15℃下最长可存放30天。
实施例2阳性标准品检测：
1.使用国际通用标准品：Horizon(HD827)公司以及Coriell Institute(NA12878human reference gDNA)进行检测。
2.Qubit定量，阴性标准品NA12878和阳性标准品HD827各200ng建库。
3.按照本发明实施例1所述方法进行建库，测序，本实施例2使用Illumina平台测序。
4.分析得到如下结果：
(1)组织版检测结果：
基因 突变类型 Ref Alt 突变频率
NRAS SNP G T 1.58％
DDR2 SNP C G 2.46％
ALK SNP A G 2.56％
PIK3CA SNP G A 3.01％
PIK3CA SNP G A 3.09％
PIK3CA SNP A G 1.64％
ROS1 SNP T C 4.17％
ROS1 SNP C T 2.45％
EGFR SNP T G 2.71％
MET SNP G A 2.55％
BRAF SNP A T 4.19％
FGFR1 SNP C A 3.36％
RET SNP C T 3.35％
KRAS SNP A G 2.73％
KRAS SNP C T 4.47％
KRAS SNP C T 2.00％
ERBB2 SNP A G 3.27％
测试总结：肺癌组织版检测产品结果显示，阳性标准品中涵盖肺癌panel中12个与肺癌高度相关基因。且均有检出，生物信息数据分析结果显示最低检测灵敏度达到1.58％。
(2)血浆ctDNA版检测结果：
基因 突变类型 Ref Alt 突变频率
NRAS SNP G T 0.17％
DDR2 SNP C G 0.36％
ALK SNP A G 0.32％
PIK3CA SNP G A 0.11％
PIK3CA SNP G A 0.30％
PIK3CA SNP A G 0.41％
ROS1 SNP T C 0.42％
ROS1 SNP C T 0.27％
EGFR SNP T G 0.11％
MET SNP G A 0.13％
BRAF SNP A T 0.23％
FGFR1 SNP C A 0.16％
RET SNP C T 0.19％
KRAS SNP A G 0.19％
KRAS SNP C T 0.16％
KRAS SNP C T 0.22％
ERBB2 SNP A G 0.67％
测试总结：肺癌血液版检测结果显示，阳性标准品中涵盖肺癌panel中12个与肺癌高度相关基因，且均有检出，生物信息数据分析结果显示最低检测灵敏度达到0.12％。
实施例3组织检测
临床样本——一例肺癌患者FFPE样本进行NGS建库；按照实施例1所述方法，采用本发明的SEQ ID NO 1～75条探针序列组成的Panel进行组织版检测：
1.提取FFPE组织基因组DNA，gDNA使用总量200ng。
2.对提取的gDNA进行文库构建，使用PE150 illumina测序平台进行测序。
3.分析得到如下结果：
该样本共检测出8个突变位点，其中EGFR p.E746_A750del突变为19号外显子缺失突变，突变频率为35.63％，结合该患者临床诊断为非小细胞性肺癌，腺癌可能性。因此给出可供参考的用药指导药物为：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达可替尼、奥希替尼单药治疗。(其中吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼被纳入《2017版国家医保目录》且适应症为本癌种)。
实施例4 ctDNA液态活检：
临床样本——一例原发性肺腺癌患者，于2018年初进行切除手术，使用液态活检进行预后评估，按照实施例1所述方法，采用本发明的SEQ ID NO 1～NO 75条探针序列组成的Panel进行ctDNA版检测：
1.采集10mL外周血，提取ctDNA进行液体活检，ctDNA使用总量30ng。
2.对提取的gDNA进行文库构建，使用PE150 illumina测序平台进行测序。
3.分析得到如下结果：
根据此样本的基因检测结果结合该患者目前临床诊断结果：右肺下叶腺癌，患者检测到EGFR 19号外显子缺失突变，但是频率较低(0.40％)，结合患者既往用药情况(曾检测到19号外显子变异，但是靶向治疗效果不佳)。该患者可考虑以下治疗方案进行治疗：
(1)纳武利尤单抗单药；(2)阿特珠单抗单药；(3)西妥昔单抗+阿法替尼联合用药；(4)阿帕替尼+吉非替尼联合用药。
综上，由该探针序列构成的肺癌检测试剂盒，可用于组织版及液态活检版检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 基恩生物科技（大连）有限公司
<120> 一种基于NGS方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
<130> 2019
<160> 75
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GATCAGCGAC ACGCCTCATT GGTCGAGTCG TTAATGTGCC ATCGAGATGA TTGGTCAGTA 60
CATCGTGCGG GAGTGCACCC GGGCACCCGG TATGGCTCAC TTG 103
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GCGAAAATGA GCCCGACTGT GTCAATGGTT CGGACGATAG ATAATAAAGG GCAGTCAAGT 60
TGGAGAAGAC AGAGGTGGCT AGAGAAATAA ACAGCACGCG CCA 103
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GCCCCTGCCG CCTCTGTAGG ACTCCGTGAT CACATTACCC TGGGACGCCA CTCCCGCCAT 60
GTGACCCCCT CAACGGTTGC CGCACTCCCG CCGGCGGTGA CCT 103
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GACAGAAACC ACATGACACC ATTACTCTGG AGGATTACTA TCTAAAAATA GATGTAATTG 60
TTTTGTCATT GAGCATTTGA ATTACTTACA ATAAGAACGA TTA 103
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TAAACATAAA CTACCCTAGC TAACTCACCT ACCCACTTCA GTTTCTTTAC TATGTGAATT 60
TTTTCATTTT ATTCATCTTT ATGGGTGATT TTATGATTCC GTG 103
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ACGTAAATTG ATCATTTCTC ATAAATGGGG TTTAAAAATT GATTATGATA GATTTCATGT 60
TTTTTTGACA TTCCCAACGT CCATTATAGT CAACAAGCCT TAG 103
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ATGAGATATA ATGGGGTGCG CTGTGAAGTG TCGGTTATTC GATTATAGCG AGTGAAGGAA 60
CACTCGGCGG AGATTGTCTG AATTGCAGAT ACCTGATCGA ATT 103
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
GTTATTAGGA AGAATCCGGG ATAATTGCAT TCAACGACCC AATTCAAATG AGTAATTTTC 60
CATAACAGAA CCATAATACT ACATGGCGTG TTCAACTCAG CAG 103
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
CAGCAGTGGT TCTATGTGCT TGGACAGGGT CGCATTCGGT CGGTCGCTGC CCGTCGCCCG 60
ACCCCCTGAC ACCGTGGCAG AGGCTCATCG AGCGGCCGCC TGA 103
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
CGTCGTCGGC AAGTCTCGTC TGGTAGGCGA TTAATGGGTT CGCCGCGGCC GTGGAAGGAT 60
ATGAGGCGTG TCAGTCAGCC GGGAGCGGGC CTGGATCGGG TAT 103
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
CTAGCGGCGA GGGCTGTCGG TTGTGGATAT GAACATACGG GGGAGTGGAC GTTCCCTGAT 60
ATAGACCAGG CCTCGGCTAA AGTCCGCCGT CCTTATCGGC TGG 103
<210> 12
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
AGTCCAGTAA CATATCAGAA AACTTTATGG TATAGGCGGA GCGATTTGGT AAAATCCAGG 60
CACGGAGTTC GTATATGACT ACTCTTTAGC AGCTTATGAA GTC 103
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
CATGGCTATC GATTTCTTGT TGCCTACGCT CGCATAAAGG CGCTACTTTT TTTAACCTTA 60
TGGCAAAACC CCTGGCCTGG ATATGGGCGG TGGTTCCTAT TTA 103
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
GAGTCGTTAT AGCTATTCCA CCGGTATTAT TAATACTTAT CAAAAATTAC CTAACTATTT 60
TCTGTGTAAC TATACATATG ATACGTAAGA TCCAATATTA GGC 103
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ATTCTTTTCT TGCCAATATA GCGATAAGGT GTAATAACCA TTCAATCCAA CAATCCAACT 60
TCCTCATCTC TTTATAGCGT GTTACACCAA CTGTACGTCT CAA 103
<210> 16
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ATAGTCAGGC ATCTAATTAT ATCACCTTGA ATGGGAATTG TAAGGACCCA GTTTCCGGTT 60
GATAGCCTAA CCACTTGACG GCTCTGATAA CCCTTCTCTC TTA 103
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
AATTAATACT AGTTGTAATC CCTTTCAAGT TGATACATCG GGGCGAGATT TATCGAATTG 60
GAGTTGTAAC CACAATCTTA TCCAACCATA ACCGAAAAGA TCA 103
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ATCTTTTCCT ATGGTTCACT GTGTACGCAT GAAGGGAAAT CGGATCCGAC TTTGTGTCAC 60
AAATACCGGC TAACAGACAC GACTTATTGC AAGGGCCCAT TTT 103
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
GCATGCGCGA AGTGCCTAGC TCGTTACATG TGCTACCTGA TCAGTGCCCA GATGTCAACG 60
TTGATACCTT AAATCTATGT TGTTAGACAA TAATTTCCGC GAA 103
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
CTAAGTAGAT TCGAGAAATC CTATTCAGCG CCGTTTGGTG GAGAAGATAG ATAATGAGTC 60
TATCTTAATA ACTATTAAGA TTTAAACAAG TAACAATTCA TGA 103
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
CTTAAGACTC GAGTCGAAGT AGATAAATGG TTTCTTAGAA TTCTTCATAT AATGCTAAGA 60
TCTAAACACA GGCAAATACT AATTATAAAT GTTACTCGTA TAT 103
<210> 22
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
AAGAAAAGCC TCGATGTCAG AGACGCCAGT AAGCTGCTCA TTTACAACTT AGCGACTCCC 60
CCGCAAGGTC ATGAAAACAA ATCTGACTGC ATATTAAAAG ACA 103
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
CTCAGACCTC TATACGTTCA TTTTCTGAAC CATTTCACCT TCCTATACGT CGTTGCCGTG 60
CACCCTTAAT TGCACTATTG GCTGTGCCTG TACAATCCTA GCG 103
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
TAATAAGAGA TCCAGTTTCT ATTTTCCAGT TAAGCTCGAA CCATACTTGT TCAAACATCG 60
TATAAAGCAT TGGACCATTT GTAAACTTAT ATATTTTATA CTT 103
<210> 25
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
AAAACAAATC TTAGATGCTG CTGATAGCAC TTATTTAGGC TTCATGATTC TGTGGACTGT 60
AGACGGCTTA CTTTAACAAT GATTAATCAT TATTATACTT TAG 103
<210> 26
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
AAATTTGCGC GGTCGGGACA CAATCGGTTA CCGGACCCCA GCCGCTTAGG CAGCCCGGGG 60
GGATCGTAAC TCGGGACGAT GGGGTGACGG GGGTCGGTGC ATT 103
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
TATTATATAA AAGCCGAAAC TTGGATCAAG TTTCTTCATT ATATCGGTAT AAACGAATAA 60
TAGTTGATGA TCAACGAATG GGTTCCAAAG TTGATGAGAT ACA 103
<210> 28
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
TAAAAGTGCA GAGACGGATA CTTCAATTGC GATACTATAT AAATCTTCTG TTCTAAGAAT 60
TATGTTCGTT TAATCATATT AAGAGCTTGA TTTACATTTA CAC 103
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
AGGCGATTAA TTTCTTTAGT AGAAATTGTT TTAGCTTACT ACATAAAACA TATGAAGTGT 60
ATTCTAAGTC GAGAGCTATG TAGAGTTGAC TGACTCTTGA TCT 103
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
AACATCGCGA TTCTTCAAGA ACAAAATTAT ATATGTATGA AGATGCTAGG TGTTTAGTTC 60
ATCAAAAAGT CACTTATAGG AAGATTATGG CTTAGATATT TAA 103
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ACTTGGTATG TTCACACATC TTATAAATAA GCTATAAACT GTCACATAAT TCTGAACTTA 60
ATTGCAAACA AAGAAGCGCT AAATTTTTTC CTTTATCATT ATT 103
<210> 32
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ACTAGCGTCT CATAGCACCT GAGGTAAAAG CGGCAGCGTC GGGAAGGCCA GCAACCCAAT 60
CTCTTGACAT TGCCCCAACT ATTTCACAGA CCGTTGATGT GAA 103
<210> 33
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
TATTTTACAC AAAAAGGATG CTCCACTGAG GAATTTAAGG AGTAATTTGT GAATAAGTTT 60
TAGCGTTGAT TGTTTAATCG AATCAATATT ATTTTCAATG GCT 103
<210> 34
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ACTTAGCTAA TCGTATGGGA GATTTGCAAT AGTCCGGAAA AAGTTCAACA TGTAGTCGGT 60
TTACTTATTT CAGATATAAA CTCAATGTAA CTGCCGCGTT AAA 103
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
GCGCACGAGC GTGATCGGCG GGCGGTTCCC GGCCGTGGGC GGGCAACGCG GCCGGATATC 60
CCGGGCCAGA AAGCCGGGGG GCCCGGTCGC CTCGGCCCCG GCC 103
<210> 36
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
TGGCAATATT CCTAAATATT AATACCGGCA CGTGTTTCAT ATCGATGGGC GGCTAGGGTT 60
AATACAGACA TTCTCGCGTA ACATTGTACT ATCAGGTAAA GTC 103
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
GGATGGGGAA GGTGGGGGTC CACGACGACG CCACGACATT CACGTAATTT GAGGGCGACC 60
GTGCCTCAAA CCGTGGTCCA CGGCGTCAGA GTGCACGCAG AAA 103
<210> 38
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
CCACTGAGAG ACCCCGATGA GTTACTACCC GGCAAATGCG GCTGTAGGCG ATCTATAGCT 60
GGCTTATGGT ACTGTTGTCG GTTAGGCATC CCTCGGGCAA AAC 103
<210> 39
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
GAAGGAAAGA GCGAAGACCA ACCCATAGGC CTAACATGCG TCAGGAGGGT GAGGGGCACT 60
GTGTCTTAGT GCCTACTTGT GGTGTCCATC TAAAGCACTA GCC 103
<210> 40
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
GGCTCGCGCA CGCCACCTTT TGGTAGACCG GGGGCTAGGA GGGACCATGC TTAGAGCTTT 60
ACCTCAATTC AATCGTGTTA GTGTGGTACC CTCGAAGGGC ACT 103
<210> 41
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ATCAAGTATA CACGCTTGAG TCATTGTCGC GTATCACCTG GGGGAAATGC GCCGTGCATT 60
ACCTCCTCCT CGTCTCTGGG CTCTCCTCGA TATGCAACCC CGA 103
<210> 42
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
CATCCCTGTA CACGACTATC CGGTCTTCCC ACTCACACTC GAGCATATCA CCAACTCGAT 60
AGACTTGACA TACCTTGCGT CGCCTCCCGC GACAACAGGC CGC 103
<210> 43
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
TTTGGGATAG AGGGAGGCGG AACCTGAGCC AGCGCAGTAT CCTCTCTTTG TCGCTACTAA 60
GCTGCACCAG GAAGAAATTC TTGTGGAGCA GTAATGGCAA CTG 103
<210> 44
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
TCTACATCAT GGCGATGGCC TTGAGAAGAA GTTTGGAGAC GGGACAGTGG GTAGGAGGGC 60
GCCGCCCTAG GAGTAGGAGT GACGGTGAAA ACGGATCTGG AGT 103
<210> 45
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
TACAGTGTCG TAAGCATAGG GTAAAACTTT ATAGACACTT GGGTTGCGCA ATAATTAATC 60
TTATGGCAGA ACACTAAGGG AATAAGGTTT AATAACGGAG TAG 103
<210> 46
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
TCCAGGCGTG ATAAAGTTAG GACGGTTGCG TTACCTCTCC CCGCGGCCCT ACTTACGCGG 60
CCGCCCCGCG AAACCCGGAC TCCAGCGTCC ATAGGCGACT ACA 103
<210> 47
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
TCGAAATGGT TCACAAATGC CAAAGGTGCC GGGCGAGCCA CACTAAAAAC GGAATATACC 60
ATGGTGCACC TATCTCACAA CCCACAGATC ACTAGATACT CCA 103
<210> 48
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
TCCATTTCAC TTGGGCAGTC CCACACATAA CTGCCCTGCC ATTGTAAGCA TAGCAGTTAC 60
GCCGCCGACC ATGTGATCGC TAGCCTGTGG TGTAGCCGCG CCA 103
<210> 49
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
TTGACGAGGC CCTCTCCAGA CGCCCGCCTT TGGTCTGAAT ACTTCGTCGC AAGCCCCCGG 60
TTTGTTTGGG TGGCGGTAGG CAGGTATCTC GCGTATCTCC TGT 103
<210> 50
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
GATGGTAGCG GGAAGCAAAT GGAACGGCGT GCATAGAACA GGGTAGTAAC GGGAGGACAT 60
AGAGACGGAG TAACAGGGGC TGGGGAGCGC GCAGGACGTC GTA 103
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
TAGCCTAGCT CCATTGTCAG ACACAGCTAT GTAGTTAATT ACGGTCCCGT TAAGTACGTG 60
TCCGAGTAGT GCGAGAACCA TGGGTAGCAA AGCAGTATCG AGC 103
<210> 52
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
TTATCCCAGG CCGCCCCTTT AAAGCTGTCC ACATATAGTA CTAACCTGCC CTTATTTTGA 60
TCGCCGGGGC TGACCCATGT GTCTGGCATA AGCCTACAAG GGC 103
<210> 53
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
CGTCGACCCC CGTAACGCTG CGGCACTAAC CTTTCCCCTG GTGCTGGCTT CGACGTATGT 60
GACTAGACTA CGCTGGGGAC CGTCGATGTG GGGCGTGTTT CCC 103
<210> 54
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
TTCGTAGCGT GTAAACCACT CCCGGCTTAC AGGGGTGAGT TGATTGTCTA GTCGCGTTTC 60
ACTGATATCG TCTGTCGAAA GTCGGTCCGA ATTTTATCTC AGC 103
<210> 55
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ATCACGAATC GTAGTGTCCC ACAGATGTCT GGGTTTCTTA CCATTTAAGG CTCTTGCCCT 60
TAGTCTCTGG ACAGGTAAAC CGTCTTCGAG ACTGTGAGGC CAC 103
<210> 56
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ACGATCCCAC AGTCGCCACC TGGCCCATGT GGACCCGGCT GGTAGACCAC TTCAGTGAAA 60
TCATGGCACA AGGCCTCCAT GTCATCCGTT ACCGGACTCC GGC 103
<210> 57
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
AAACATAAAG GTAGGATCGG TCATCTTGGA GCCTGGGAAC CGCGGGGAGG GCGATAGTAG 60
AAAGCTAGGT GTGCGCACTG GTCAGTACTC TCGGGGGCTC CAA 103
<210> 58
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
CACCGTCCTC TGCATCTCCC ACTTCCTCCT TTCGGGGGGA CGCAGCGGGC GGTTCCCTTA 60
TACCGGACCG AATGCAGCTT TTGCGCATAC GCCCAAGCAG TGT 103
<210> 59
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
GGGCTCGTCC GAGGCCAAGC CTCGAGATTG TATTCTTAGA CAAACGGAAG CCACACAGGG 60
CCTATCTTAT TAATGACATG GCGACCATCT CACAGGTTTC GGT 103
<210> 60
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
AGACCCTCAG CTAAAGCCAT TTCCCAGCAT CGCGTCAGCG TCGTTCCGGG GACCCGCGAA 60
CGAGTCTACG GTGACAAAAC TTGCTAGTTG ATTCAGCGAG CCA 103
<210> 61
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
CATCGGCGTA CAGTGTCTAA TAGCGTTGGC GAGCAGCCCA ATGGCAGTGG GTTTGTAGCC 60
CTCACAATCG GTCTGCTCGC ATCAATGAGA GAATATGTGA AGT 103
<210> 62
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
TACCTGCCGC CCGATCTTGC GGATTATGAC GGGTTCGCAC CCGCTTCAGC CTCCGTTCTG 60
TTCTCTGCGA ATCCTGGAGA GGTGGCAAGA CGGGGCGCTA AGG 103
<210> 63
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
CGTTAAGCCC ACGCTCCCTC TTGCGCCGAC GTGACTGGGT TGTTCTGCTC CCTTAGCCGG 60
GCCACCTGTG CAAGCTCAGA ATCACCAATA CGAGCAGCAT CGC 103
<210> 64
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
CCCTAGCGCT TACTAGTTTG CTGTGTGATC CGCCACTACG CCGATGCTGC CGCGCAGTCG 60
CCCCTGTCCT GCCATCTACC CACCGGGGGG GGTGCCTTTA ATC 103
<210> 65
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
TACATCAATT CTGCCGCCCC AACTCCTTAG CTTTTCAAGC AAGAAACAAG GTTAAGGTCT 60
ATTGAATTCA CTATATGTGC TATAGCCATT ACTTTCGTCT ATC 103
<210> 66
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
CCATGAGCAG ACCCATGCCC TATTGCCGGC CGCCCACCTA TTCTTCGATG GGTGCGGACC 60
GCAACATGTG TGGCCAGCTG GACCATGCCC ACCACCGGTG CAA 103
<210> 67
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
GGCGCTTCAA AATAATTCGT GTAGCATGTA GCATCGGATC CAATCGGTCA TCAACTGCTT 60
TTAACATCAG TAACCGGTAC TCACAGGCCG TCGTTACTGG ACG 103
<210> 68
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
TAGAGCACCA ATTGACGTAC TAGAAATTAT GTATAGTACC TCCAAACTAA CGTCTCGCTA 60
TCGAATATGA GTTCTACATA AAGTAAGTCC TTAGGCAGCA ATT 103
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
CTATCTAACC TATACTTGCT ACTCCCAAAA TTTCCTGTGG ATCTCGCTCA ACGGATCCTC 60
CTCTATCCAG TCCGTATATC AGGTCACCGC AGACTCCTAT ATT 103
<210> 70
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
CGGTTGGCGT GCGCCTCCGC GCGCCGGCCC ATCGAGCCCG ACGCATCGCC CGCGCGACCC 60
GCCTGCGCCT CCCACGTGGA GCCGCCGGCG ACGGCGATCC AAG 103
<210> 71
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
CCGACCTGGT CCCCGTGACC CGGTTGGCGC ACCCGCCGAC CGCCGTCGAG TCCTGAGCTA 60
GGGCCTCCCA GCCCCGCGAC CCCCAGCCTC GACACCGCCC CAA 103
<210> 72
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
TCATGCTTAG AGACCTCAGA ACGAGGAGCA CCCGTCGCCC ACCAGGACTG CAAGAAGTAG 60
CTTAGTCTGG CGCCCGCCTT GTGAAGCCCC CCGGGGAAAA TGA 103
<210> 73
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
CGGCGCTACG TGATCGGCTA GTAGTGGTCA GTCTCCCGCG GGTCCGGGCT GAGGTCTAGG 60
ATTGACCAGC GGGGCCGCGC CCTTATGCCG TGACGAACCT CGG 103
<210> 74
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
TAGGTTCCGG CCCCAGTGAA CTGCCTGGAT TCTGGCTCAC GGCGTCCTGG GAAGATGGGG 60
GCGCCCACGT CGCACGACGT CCAGGGCGCA GTTTGAGACC GGG 103
<210> 75
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
CCGCTCTCGG AGTTGCATGC TCTTACGGGA TGTACAGTCC GCCCCATCCG CGCACGCCAG 60
CGTGTTAAGG TCGGGCACCA GCTCAACCAC TGTTGTCTCC GTG 103

Claims (5)

1.一种探针组合物，其特征在于：其核酸序列为如SEQ ID NO.1～75所示的探针。
2.一种用于肺癌基因检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的探针组合物。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括接头，所述接头为具有UMI双分子标签的接头或Short-Y接头；其中，所述具有UMI双分子标签的接头为在基于Illumina通用接头的基础上添加6-8个碱基序列随机组成。
4.权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒适用于FFPE、组织及外周血ctDNA的分子检测。
5.权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于基于NGS方法肺癌基因检测。
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