CN106520963B - 高通量测序检测人循环肿瘤dna kras基因的捕获探针及试剂盒 - Google Patents
高通量测序检测人循环肿瘤dna kras基因的捕获探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA KRAS基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人循环肿瘤DNA KRAS基因捕获探针是多种探针的混合物,所述多种探针分别能够捕获人KRAS基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中,所述多种探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。
Description
发明领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNAKRAS基因的捕获的探针及试剂盒。
背景技术
在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-free DNA,cfDNA),它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉,因此cfDNA的含量是非常低的,通常一个健康人的1mL血浆中含25ng cfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍,其中一部分是ctDNA(circulating tumor DNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的,可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如,与传统的影像学检测相比,追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA,可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌、肠癌中检测cfDNA的KRAS突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集,在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致,因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。
血液中ctDNA含量,在癌症早期占cfDNA的比例是非常低,通常小于0.1%。ctDNA检测方法很多,如用数字化PCR(Digital PCR),或下一代测序(Next GenerationSequencing,NGS)等。通过NGS优化ctDNA的深度测序(CAPP-seq)使突变检测的敏感度达到0.02%,特异性为100%。此方法结合降低背景噪声的iDES(integrated Digital ErrorSuppression)分析方法后,使检测频率的阈值进一步下降到0.004%。从而大大提高了分析CtDNA的检出率。
KRAS突变在肺癌和结直肠癌中均很常见,其与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散和血管生成均有密切关系。同时KRAS突变是所有肿瘤中突变频率最高的基因,因此成为研究的焦点。KRAS基因是EGFR的下游因子,若KRAS基因发生突变,则患者不能从酪氨酸激酶抑制剂中获益,且对EGFR一TKIS耐药。因此KRAS的突变检测成为靶向治疗的关键。通过对人循环肿瘤DNA KRAS基因的检测可筛检出肺癌、肠癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群,利于该类疾病的早期诊断治疗。
耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化,通过测定人类基因组DNA的序列,探寻基因在染色体上的位置,明确基因的结构和功能,解读人类的全部遗传信息,人类第一次在分子水平上全面认识自我。在这期间,建立了两项非常重要的高通量技术:基因芯片和第二代测序技术。这两种技术进一步结合,就产生了一种新的解决方案:目标序列捕获测序技术。目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定区域。一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理设计与目的区域互补的探针序列,而根据杂交时状态不同,目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。液相杂交是通过在溶液中,目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交,然后通过生物素亲和素反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA,洗脱后,富集的DNA用于测序。相较于固相杂交,液相杂交具有操作简便、易于自动化等优点。
常规的探针设计方式为探针间首尾相连,且不存在重叠部分,这样做的缺点是在基因文库中KRAS基因多数片段只能被单一探针捕获,且探针交界处的捕获效果差,造成捕获效率偏低。同时,常规探针设计方式对探针长度和Tm值无特殊要求,这就导致探针间差异较大,在相同的实验条件下绝大多数探针不能同时达到最佳的捕获效果。本发明基于CAPP-seq和数字信号技术,设计KRAS探针检测血液cfDNA中KRAS的变异。当测序深度达到10000×时,有效深度可达5000×,检测突变的敏感性达到0.02%。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA KRAS基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人循环肿瘤DNA KRAS捕获探针是多条探针的混合物,所述多条探针分别能够捕获人KRAS基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中,所述多条探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域,减少非特异性捕获,同时杂交温度相近。
根据本发明的一个方面,提供用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针,所述捕获探针为多条探针的混合物;所述多条探针能覆盖全部目标区域;所述多条探针之间存在重叠区,使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖;所述多条探针的长度均为90-130bp;所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。
本发明中,目标区域是指包含人KRAS基因上的任何一个或多个变异的区域。
本发明中,全部目标区域优选为人KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。
根据本发明的一个方面,提供用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针混合物,所述捕获探针混合物至少包括具有SEQ ID NO:1-22所示序列的22条探针。
在一些实施方案中,所述捕获探针混合物由具有SEQ ID NO:1-31所示序列的31条探针组成。
在另一些实施方案中,所述捕获探针混合物还进一步包括一条或更多条具有选自SEQ ID NO:23-37的序列的探针。
在优选的实施方案中,所述捕获探针混合物为SEQ ID NO:1-37所示的37条探针的混合物。
在一些优选的实施方案中,捕获探针混合物中包含的探针按相同质量比例混合在一起。
优选地,本发明的捕获探针混合物中每条探针均具有标记,优选为生物素标记。
本发明的捕获探针混合物的工作浓度是0.1PM~6PM,优选1.5PM;其中PM=皮摩尔/升。
根据本发明的另一个方面,提供人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒,其中包含上述探针混合物。
本发明的人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒还可以包含用于人KRAS基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中,所述人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阴性对照和阳性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。在特别优选的实施方案中,所述人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。
根据本发明的又一方面,提供上述用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针在制备用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。
本发明针对当前新一代测序过程中捕获探针存在的缺陷,采用特殊的设计方式在KRAS基因外显子区域进行探针设计,解决了循环肿瘤DNA KRAS基因外显子测序数据质量较差的问题。本发明通过增加探针间的重叠区间,使文库中KRAS基因每个区域存在被两个或两个以上的捕获探针捕获的可能,提高了对目的片段的捕获能力。通过限制探针的长度和Tm值,降低了探针之间的差异性,使绝大多数探针在特定实验条件下均处于解链和二级结构充分打开的状态,可与目的区域充分结合,提高了对目的区域捕获的均一性。本发明的捕获探针具有杂交效果好,捕获效率高,目的区域测序数据质量好等优点。
具体实施方式
本文所述的“变异”是指一个或更多个核苷酸的插入、取代或缺失。
本文所述的“杂交捕获”是通过互补DNA序列与靶向DNA进行杂交,对待测核酸进行靶向富集的方法。
本文所述的“Tm值”是指DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。
本文所述的“新一代测序技术”又称大规模平行测序massively parallelsequencing(MPS),是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应,然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术,又称为高通量测序、深度测序、二代测序等。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段,经末端修复、连接接头序列、PCR扩增等步骤进行文库构建,最后使用Illumina,Ion Torrent等测序仪进行测序。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂,如无特殊说明,均可以从商业途径获得。
实施例1:人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测质控品的制备
1.1.从ATCC购买获得七株常用的可稳定传代人肿瘤细胞系HOP-62、HCT-15、AGS、NCI-H1573、COR-L23、NCI-H1355及SW1417。用Sanger法对每个细胞系的基因组DNA进行测序,经Sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点。经验证共含有6个阳性变异位点。
1.2.采用专用培养基培养这七株人肿瘤细胞系,培养条件:37℃恒温,5%CO2,湿度50%。培养至细胞密度达培养皿面积80-90%时传代,在细胞生长对数期收集,1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清。
1.3.使用预冷PBS溶液重悬,5000rpm速度4℃离心5min,吸弃上清。重复本步骤一次。
1.4.吸弃上清,使用0.1%Triton X-100重悬沉淀,冰上孵育10min,5000rpm速度4℃离心10min。吸弃上清,加入1X MNase Buffer,重悬沉淀。
1.5.吸弃上清,加入1×MNase Buffer,重悬沉淀。加入1×BSA及MNase,37℃孵育5min。加入EDTA中止酶反应。2000g离心1min后取上清使用Life Tech MagMax试剂盒提取,最终将提取的七株人肿瘤细胞系核酸稀释至15±1ng/μL,并等比例混合,-20℃保存。
实施例2:人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒的制备
2.1.设计并合成针对人循环肿瘤DNA KRAS基因上不同目标区域的多个捕获探针,所有捕获探针的集合能够覆盖人KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域;捕获探针上具有生物素标记;所述捕获探针的序列如序列表中SEQ ID NO:1-37所示。
2.2.将序列表中SEQ ID NO:1-37所示的全部捕获探针按相同比例混合在一起,并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM=皮摩尔/升),-20℃保存。
2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。
2.4.准备说明书、外包装,组装封口。
2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应,12μL/6反应,24μL/12反应,48μL/24反应;质控品的用量为5μL/3反应,10μL/6反应,20μL/12反应,40μL/24反应。
实施例3:人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的测序检测
本实施例中测序所使用的仪器为基因序列自动分析仪NextSeq CN500。
质控品的制备方法同实施例1。
3.1.从10例阳性血浆样本中提取人cfDNA,质控品直接使用,无需提取。
3.2.文库构建
3.2.1.末端修复
0.2ml PCR反应管,加入30ng提取后的cfDNA样本或质控品,用Low EDTA TE补齐至50μL,震荡混匀,短暂离心。分别加入1μL末端修复酶混合物和6μL末端修复反应缓冲液,震荡混匀短暂离心后在37℃保温5min,随后在65℃保温30min,37℃保温5min,进行末端修复。反应结束后取出PCR反应管,将产物全部转移至新的1.5mL离心管中;在每个离心管中加入108μL核酸纯化磁珠,充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上,室温静置2min后,小心吸弃上清。加入200μL 80%乙醇,室温静置30s后,小心吸弃上清,重复操作一次,确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上,室温干燥5min。在每个离心管中分别加入30μLLow EDTA TE、18μL缓冲液、1μL修复酶G3、1μL修复酶G4,充分混匀后,于20℃孵育20min。取出离心管,分别加入50μL PEG NaCl,吹打混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上,室温静置2min后,小心吸弃上清。加入200μL 80%乙醇,室温静置30s后,小心吸弃上清。重复操作一次,确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上,室温干燥5min。
3.2.2.接头连接
向干燥后的离心管中分别单独加入5μL接头,并做好标记;分别加入20μL LowEDTA TE、3μL接头缓冲液、2μL连接酶,充分混匀并重悬磁珠后,25℃恒温孵育15min。加入49.5μL PEG NaCl,充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min,小心吸弃上清。加入200μL 80%乙醇,室温静置30s后,小心吸弃上清,重复操作一次,确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上,室温干燥5min。分别加入2μL接头、30μL Low EDTA TE、16μL缓冲液、3μL连接酶,充分混匀并重悬磁珠后,40℃恒温孵育10min。加入82.5μL PEG NaCl,充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min,小心吸弃上清。加入200μL80%乙醇,室温静置30s后,小心吸弃上清,重复操作一次,确保无液体残留,室温干燥5min(不可使磁珠过度干燥)。加入20μL Low EDTA TE,室温孵育3min。将离心管转移至磁力架上,静置2min,小心吸取上清至新的1.5mL离心管中。
3.2.3文库扩增与纯化
分别加入25μL PCR扩增酶混合物、5μL引物混合物进行PCR扩增。向反应完成的离心管中,加入1.65倍的PEG NaCl溶液,并吹打混合均匀,室温孵育。孵育完成后,将离心管置于磁力架上静置2-3min,待溶液澄清后,吸弃溶液,期间切忌接触磁珠。在离心管中加入新鲜的80%乙醇200μL,静置30s后,吸弃乙醇,切勿接触磁珠,重复操作一次。吸弃乙醇后,将磁珠晾干至表明呈磨砂状,切勿使磁珠过干,出现许多裂缝,磁珠晾干后,加入Low EDTA TEbuffer 20μL,并室温孵育。孵育完成后,置于磁力架上,静置2-3min,待溶液澄清后,吸取溶液,转移至新的1.5mL LoBind离心管中。
3.3.文库捕获
3.3.1.杂交
几个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获,将文库按量混合于1.5mL LoBind离心管中成为一个样品池,样本用量不低于125ng,样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μL DNA封闭剂,震荡混匀,短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μL PCR-grade water,震荡混匀,短暂离心后,室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mL PCR反应管中,95℃保温10min。取出PCR反应管,短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物,震荡混匀3-5s,短暂离心后在68℃保温4h以上,热盖温度为78℃。
3.3.2.富集
取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液,振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mL PCR反应管中。
将步骤3.3.1中的PCR反应管取出,短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中,充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min,期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后,每管加入100μL65℃预热的1×洗液Ⅰ,将全部悬液转移至1.5mL LoBind离心管中,震荡混匀,短暂离心后转移至磁力架上静置20s,吸弃上清。
加入200μL 65℃预热的1×杂交洗液,震荡混匀,短暂离心后65℃孵育5min,转移至磁力架上静置20s,吸弃上清。重复本步骤一次。
再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL Nuclease-free water,震荡重悬后全部转移至0.2mL PCR反应管中备用。
3.3.3.捕获文库扩增与纯化
向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL,充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增:95℃3min;10个循环,每个循环为98℃20s,60℃30s,72℃30s;72℃1min;4℃保存备用。
将PCR反应管短暂离心后,将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠,震荡混匀,室温静置10min后短暂离心,转移至磁力架上静置1min,吸弃上清。加入200μL 80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。重复洗涤一次,开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-free water震荡重悬磁珠,室温静置5min,转移至磁力架上静置1min,取20μL上清至新的1.5mL LoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。
3.4.测序及数据分析
3.4.1.测序
按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度≥5000×。
3.4.2.数据分析
获得原始测序数据后,与参比数据库比对,进行变异分析和解读。
检测结果如下:
临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率:10/10=100%。所有临床样本经数字PCR法验证无误。
表1临床样本突变位点及检测结果
质控品的变异位点检测结果如表2所示,其中参考突变频率为根据混合比例以及经数字PCR法测定的变异频率计算获得的理论检测值为高通量测序实验检测结果。
表2质控品变异位点及检测结果
No. | 基因 | cDNA变异信息 | 蛋白变异信息 | 参考频率 | 检测结果 |
1 | KRAS | c.34G>T | p.G12S | 1.00% | 0.98% |
2 | KRAS | c.35G>A | p.G12D | 1.00% | 0.99% |
3 | KRAS | c.35G>C | p.G12A | 1.00% | 0.99% |
4 | KRAS | c.35G>T | p.G12V | 1.00% | 1.03% |
5 | KRAS | c.37G>T | p.G13C | 1.00% | 1.01% |
6 | KRAS | c.38G>A | p.G13D | 1.00% | 0.98% |
由表2的结果可见,质控品中变异位点检测符合率为100%。
实施例4:可重复性实验
按照实施例1的制备方法制备质控品K-P2,与实施例1的不同之处在于七株细胞系DNA等比例混合制备而成。
使用质控品K-P2按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒,批号分别为20160314,20160315,20160316。
按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160316,检测K-P2三次,检测结果见表3。不同批次试剂盒20160314,20160315,20160316,检测K-P2各三次,检测结果见表4。
表3批内差异
批号 | 样本名称 | 阳性变异符合率 |
20160316 | K-P2 | 100%(6/6) |
20160316 | K-P2 | 100%(6/6) |
20160316 | K-P2 | 100%(6/6) |
表4批间差异
批号 | 样本名称 | 阳性变异符合率 |
20160314 | K-P2 | 100%(6/6) |
20160315 | K-P2 | 100%(6/6) |
20160316 | K-P2 | 100%(6/6) |
检测结果:试剂盒可重复性满足要求。
实施例5:探针对比测试的性能分析指标
分别使用常规捕获探针和实施例2的捕获探针,按照与实施例3相同的实验步骤进行操作。其中常规捕获探针为18条探针的混合物,其中所包含的18条探针首尾相接覆盖KRAS的全部目标区域,每条探针长度随机,Tm值无限制,所有探针均具有生物素标记。
经过测序和数据分析,两种探针的性能指标比较如表5和表6所示。
表5常规捕获探针性能指标验证分析
样本 | 重复率(%) | 目标区占比(%) | 目标区边缘占比(%) | 非目标区占比(%) |
1 | 0.18 | 39.28 | 4.09 | 56.63 |
2 | 0.14 | 42.28 | 4.64 | 53.08 |
3 | 0.15 | 8.92 | 1.21 | 89.87 |
4 | 0.17 | 40.67 | 5.12 | 54.21 |
5 | 0.14 | 8.40 | 1.17 | 90.43 |
6 | 0.16 | 48.83 | 5.23 | 45.93 |
7 | 0.12 | 45.55 | 5.77 | 48.68 |
8 | 0.24 | 42.92 | 5.90 | 51.17 |
9 | 0.21 | 39.41 | 5.83 | 54.77 |
10 | 0.21 | 43.02 | 6.34 | 50.65 |
均值 | 0.17 | 35.93 | 4.53 | 59.54 |
表6实施例2探针性能指标验证分析
样本 | 重复率(%) | 目标区占比(%) | 目标区边缘占比(%) | 非目标区占比(%) |
1 | 0.13 | 68.97 | 19.90 | 11.13 |
2 | 0.12 | 79.19 | 8.47 | 12.34 |
3 | 0.14 | 68.31 | 9.43 | 22.26 |
4 | 0.23 | 78.49 | 11.85 | 9.67 |
5 | 0.19 | 74.50 | 12.01 | 13.48 |
6 | 0.09 | 76.40 | 12.18 | 11.41 |
7 | 0.11 | 69.88 | 17.27 | 12.85 |
8 | 0.10 | 71.62 | 17.42 | 10.96 |
9 | 0.14 | 69.08 | 17.56 | 13.36 |
10 | 0.19 | 69.34 | 19.33 | 11.32 |
均值 | 0.14 | 72.58 | 14.54 | 12.88 |
其中
重复率:测序重复的数据量与测序得到的总数据量之比;
目标区占比:目标区域测序测得的数据量与测序得到的总数据量之比;
目标区边缘占比:目标区边缘区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比;
非目标区占比:非目标区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比。
实施例6:利用22条探针组合对人循环肿瘤DNA KRAS基因变异进行测序检测
将序列表中SEQ ID NO:1-22所示的捕获探针按相同比例混合在一起,并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM=皮摩尔/升),-20℃保存。上述22条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应,12μL/6反应,24μL/12反应,48μL/24反应。
对人循环肿瘤DNA KRAS基因变异进行测序检测,步骤与实施例3相同,除了在文库捕获步骤中使用上述制备的22条捕获探针混合物。
检测结果如下:
临床样本的突变位点及检测结果如表7所示。临床样本检测符合率:10/10=100%。所有临床样本经数字PCR法验证无误。
表7 22条探针组合临床样本检测结果
样本编号 | 基因名称 | 转录本 | 外显子或内含子 | cDNA变异信息 | 蛋白质变异信息 | 检测结果 |
1 | KRAS | NM_004985 | 18 | c.35G>A | p.G12D | 3.14%,阳性 |
2 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.35G>C | p.G12A | 1.78%,阳性 |
3 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.35G>T | p.G12V | 5.3‰,阳性 |
4 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>A | p.G12S | 2.7‰,阳性 |
5 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>C | p.G12R | 1.62%,阳性 |
6 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>T | p.G12C | 1.19%,阳性 |
7 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.38G>A | p.G13D | 3.9‰,阳性 |
8 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.183A>T | p.Q61H | 3.27%,阳性 |
9 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.182A>C | p.Q61A | 1.9‰,阳性 |
10 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.182A>T | p.Q61L | 6.08%,阳性 |
利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的22条探针在65℃杂交条件下进行捕获,对比捕获后核酸得率如下表8所示:
表8捕获核酸得率比较
样本编号 | 常规捕获探针 | 本实施例的22条探针 |
1 | 0.09% | 1.78% |
2 | 0.12% | 1.93% |
3 | 0.97‰ | 1.36% |
4 | 0.82% | 2.28% |
5 | 0.23% | 1.43% |
6 | 0.06‰ | 1.02% |
7 | 0.38% | 2.59% |
8 | 0.41‰ | 1.77% |
9 | 1.72% | 3.01% |
10 | 0.68% | 2.36% |
注:样本捕获总量1μg;理想得率在1%-4%之间。
实施例7:利用31条探针组合对人循环肿瘤DNA KRAS基因变异进行测序检测
将序列表中SEQ ID NO:1-31所示的捕获探针按相同比例混合在一起,并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM=皮摩尔/升),-20℃保存。上述31条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应,12μL/6反应,24μL/12反应,48μL/24反应。
对人循环肿瘤DNA KRAS基因变异进行测序检测,步骤与实施例3相同,除了在文库捕获步骤中使用上述制备的31条捕获探针混合物。
检测结果如下:
临床样本的突变位点及检测结果如表9所示。临床样本检测符合率:10/10=100%。所有临床样本经数字PCR法验证无误。
表9 31条探针组合临床样本检测结果
样本编号 | 基因名称 | 转录本 | 外显子或内含子 | cDNA变异信息 | 蛋白质变异信息 | 检测结果 |
1 | KRAS | NM_004985 | 18 | c.35G>A | p.G12D | 3.79%,阳性 |
2 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.35G>C | p.G12A | 1.92%,阳性 |
3 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.35G>T | p.G12V | 5.6‰,阳性 |
4 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>A | p.G12S | 2.9‰,阳性 |
5 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>C | p.G12R | 2.12%,阳性 |
6 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.34G>T | p.G12C | 1.16%,阳性 |
7 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.38G>A | p.G13D | 5.8‰,阳性 |
8 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.183A>T | p.Q61H | 4.57%,阳性 |
9 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.182A>C | p.Q61A | 3.8‰,阳性 |
10 | KRAS | NM_004985 | 19 | c.182A>T | p.Q61L | 6.84%,阳性 |
利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的31条探针在65℃杂交条件下进行捕获,对比捕获后核酸得率如下表10所示:
表10捕获核酸得率比较
样本编号 | 常规捕获探针 | 本实施例的31条探针 |
1 | 0.39% | 1.81% |
2 | 0.18% | 2.43% |
3 | 0.72‰ | 1.28% |
4 | 0.91% | 2.57% |
5 | 0.34% | 1.25% |
6 | 0.06‰ | 1.20% |
7 | 0.29% | 2.03% |
8 | 4.58‰ | 2.66% |
9 | 1.69% | 3.13% |
10 | 1.07% | 2.94% |
注:样本捕获总量1μg;理想得率在1%-4%之间。
<110> 埃提斯生物技术(上海)有限公司
<120> 高通量测序检测人循环肿瘤DNA KRAS基因的捕获探针及试剂盒
<130> 2016
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacagtctgc atggagcagg aaaaaaatta ggtaatgcta aaacaaatgc taataattta 60
gtgtaatgta caaaaattac cacttgtact agtatgcctt aagaaaaaag tacaaattgt 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgtaatgta caaaaattac cacttgtact agtatgcctt aagaaaaaag tacaaattgt 60
atttacataa ttacacactt tgtctttgac ttctttttct tctttttacc atctttgctc 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atttacataa ttacacactt tgtctttgac ttctttttct tctttttacc atctttgctc 60
atcttttctt tatgttttcg aatttctcga actaatgtat agaaggcatc atcaacaccc 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcttttctt tatgttttcg aatttctcga actaatgtat agaaggcatc atcaacaccc 60
tgaaatacat aaaaagtatt aaaatgtgaa tatatacgat ggcttcatgt gtacaggtaa 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaaatacat aaaaagtatt aaaatgtgaa tatatacgat ggcttcatgt gtacaggtaa 60
caaatttcat taatggaaaa aatattaaga aaggattctt tatgtttctc ttcaggcaac 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttttaatact tcaagttaga atactacacc taagtagttc taaagtggtt gccaccttgt 60
tacctttaaa agacatctgc tttctgccaa aattaatgtg ctgaacttaa acttaccaga 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tacctttaaa agacatctgc tttctgccaa aattaatgtg ctgaacttaa acttaccaga 60
ttacattata atgcattttt taattttcac acagccagga gtcttttctt ctttgctgat 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttacattata atgcattttt taattttcac acagccagga gtcttttctt ctttgctgat 60
ttttttcaat ctgtattgtc ggatctccct caccaatgta taaaaagcat cctccactct 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttttttcaat ctgtattgtc ggatctccct caccaatgta taaaaagcat cctccactct 60
ctgcattgta aaacacaact tctttaaagt ctgttgcatt ggtaagagta atttactggg 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctgcattgta aaacacaact tctttaaagt ctgttgcatt ggtaagagta atttactggg 60
aaagccatgt gcaagaagtt tgagattatg agcttgagat tttttttttt ttaaacagac 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaaaaacat ttactaaata ttgttttatt tcctagtata gcataattga gagaaaaact 60
gatatattaa atgacataac agttatgatt ttgcagaaaa cagatctgta tttatttcag 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatatattaa atgacataac agttatgatt ttgcagaaaa cagatctgta tttatttcag 60
tgttacttac ctgtcttgtc tttgctgatg tttcaataaa aggaattcca taacttcttg 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgttacttac ctgtcttgtc tttgctgatg tttcaataaa aggaattcca taacttcttg 60
ctaagtcctg agcctgtttt gtgtctactg ttctagaagg caaatcacat ttatttccta 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctaagtcctg agcctgtttt gtgtctactg ttctagaagg caaatcacat ttatttccta 60
ctaggaccat aggtacatct tcagagtcct taactctttt aatttgttct ctgggaaaga 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctaggaccat aggtacatct tcagagtcct taactctttt aatttgttct ctgggaaaga 60
aaaaaaagtt atagcacagt cattagtaac acaaatatct ttcaaaacct gtccacaact 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaaaaaagtt atagcacagt cattagtaac acaaatatct ttcaaaacct gtccacaact 60
tttgtcataa aatttggctg aaagaaaaca atgtaattcc tagtttccac tacaccaaat 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatgcatggc attagcaaag actcaaaaaa taaaaactat aattactcct taatgtcagc 60
ttattatatt caatttaaac ccacctataa tggtgaatat cttcaaatga tttagtatta 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcttattata ttcaatttaa acccacctat aatggtgaat atcttcaaat gatttagtat 60
tatttatggc aaatacacaa agaaagccct ccccagtcct catgtactgg tccctcattg 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
attatttatg gcaaatacac aaagaaagcc ctccccagtc ctcatgtact ggtccctcat 60
tgcactgtac tcctcttgac ctgctgtgtc gagaatatcc aagagacagg tttctccatc 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
attgcactgt actcctcttg acctgctgtg tcgagaatat ccaagagaca ggtttctcca 60
tcaattacta cttgcttcct gtaggaatcc tgagaaggga gaaacacagt ctggattatt 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
catcaattac tacttgcttc ctgtaggaat cctgagaagg gagaaacaca gtctggatta 60
ttacagtgca ccttttactt caaaaaaggt gttatataca actcaacaac aaaaaatt 118
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cagataactt aactttcagc ataattatct tgtaataagt actcatgaaa atggtcagag 60
aaacctttat ctgtatcaaa gaatggtcct gcaccagtaa tatgcatatt aaaacaagat 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aaacctttat ctgtatcaaa gaatggtcct gcaccagtaa tatgcatatt aaaacaagat 60
ttacctctat tgttggatca tattcgtcca caaaatgatt ctgaattagc tgtatcgtca 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttacctctat tgttggatca tattcgtcca caaaatgatt ctgaattagc tgtatcgtca 60
aggcactctt gcctacgcca ccagctccaa ctaccacaag tttatattca gtcattttca 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
aggcactctt gcctacgcca ccagctccaa ctaccacaag tttatattca gtcattttca 60
gcaggcctta taataaaaat aatgaaaatg tgactatatt agaacatgtc acacataagg 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gcaggcctta taataaaaat aatgaaaatg tgactatatt agaacatgtc acacataagg 60
ttaatacact atcaaatact ccaccagtac cttttaatac aaactcacct ttatatgaaa 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agtaacattt taaatttatc aaaaggattg tttttatttt tattttaaag cattattaaa 60
tatggatcag acttgaaaag tgtttatgca atgttaattt aaccagtgtt aagagaacta 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gccaaaccta gagattgtaa aactttttca cttcattgtt taaaaaaaaa attaatgtct 60
tggcacacca ccaccccaaa atctcaactt ttgagttaat atttaaaagt aatttttaaa 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aaagagtttg ttttcttaag aaacaaaagc aatgctcttg atttgtcagc aggaccacca 60
cagagtgaga ttgtatcttg ttgagctatc caaactgccc tagtccctcc ccattttgac 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
taaccaatgc atgacaacac tggatgaccg tggggacaca gtccatgctg tgaaactctc 60
tatgaaagct caaaggttca cacagggcct ggccttgcaa ccttggtctc ttcaacacct 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aataagctat aactggccca aataatcttt taatgtcaca agcagaatta aaactatctt 60
caaagactca agttgaagaa aagatttaaa gttatactat gaaagagcag tctgacacag 120
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ggagactaca tttaattcct atgagaattt tttatacttg ttaaaatctt ttcaattatt 60
ataaaaattt agtagcatgt aaatatagcc ccaaaatggt tgctataata atccccattt 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctcacaaaca tatattctca tgactacttg catggaccag cccttccacc actccagaaa 60
cacacactaa ttggtgttat gttttagcag cactggggat accaccatca cagaatttgc 120
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctttttatag aaaaaatata atattttggg gagagtgacc atgactaata gcagtggaaa 60
ggagacaaaa cctttgtgaa cagtgtaact ttacattcat cagggatgac aaactatagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acatgatgcc tagaagaatc atcatcagga agcccataaa tttgtgttcc ctcaatgttt 60
cagtaaaaac caattagaag gtctcaactg aaattagtaa ttaatccatt tatgtgacta 120
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gataaaacac agaataggga tgattcaaaa gcttcattaa tttgtttcac accaacattc 60
acaattggta agaaaaataa gaagtaatca actgcatgca ccaaaagccc caagacagaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
atcttaggta ttcagtttct ttttcacagg cattgctagt tcaaaaacca aaactctggg 60
aatactggca cttagaggaa aaaaaaactt ccactgtcat tttaaaataa gcatttaagg 120
Claims (10)
1.用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针,所述捕获探针为多条探针的混合物;所述多条探针能覆盖全部目标区域;所述多条探针之间存在重叠区,使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖;所述多条探针的长度均为90-130bp;所述多条探针的Tm值在65-75℃之间,其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-22所示的22条探针的混合物。
2.用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针,所述捕获探针为多条探针的混合物;所述多条探针能覆盖全部目标区域;所述多条探针之间存在重叠区,使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖;所述多条探针的长度均为90-130bp;所述多条探针的Tm值在65-75℃之间,其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-31所示的31条探针的混合物。
3.用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的捕获探针,所述捕获探针为多条探针的混合物;所述多条探针能覆盖全部目标区域;所述多条探针之间存在重叠区,使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖;所述多条探针的长度均为90-130bp;所述多条探针的Tm值在65-75℃之间,其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-37所示的37条探针的混合物。
4.权利要求1-3任一项的捕获探针,其中混合物中包含的探针按相同质量比例混合在一起。
5.权利要求1-3任一项的捕获探针,其中每条探针均具有生物素标记。
6.权利要求4的捕获探针,其中每条探针均具有生物素标记。
7.人循环肿瘤DNA KRAS基因变异检测试剂盒,其中包含权利要求1-6任一项的捕获探针。
8.权利要求7的试剂盒,所述试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
9.权利要求7的试剂盒,所述试剂盒进一步包含末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠。
10.权利要求1-6任一项的捕获探针在制备用于人循环肿瘤DNA KRAS基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。
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Sensitive Detection of KRAS Mutations in Archived Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Using Mutant-Enriched PCR and Reverse-Hybridization;C Ausch等;《The Journal of Molecular Diagnostic》;20091130;第11卷(第6期);第508-513页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN106520963A (zh) | 2017-03-22 |
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