CN108611401A - 一种更为精准的游离dna突变检测技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种更为精准的游离DNA突变检测技术，包括以下步骤：S1、gDNA的提取；S2、gDNA的片段化；S3、向破碎后的DNA样本中添加分子条形码引物；S4、用纯化柱对完成反应后的反应液1进行纯化，并利用上游引物和基因特异性引物对样本进行纯化；S5、用纯化柱对完成反应后的反应液2进行纯化，并利用通用引物和样本特异性引物对破碎后的DNA进行文库的扩增；S6、将S5制得的反应液在PCR完成后的反应液3进行测序分析，得到突变的DNA碱基位点和突变的碱基信息。本发明通过分子条形码技术的引入，使得样本中单一DNA模板分子上都会高效地引入一个独特的分子标签，从源头对不同来源的模板DNA进行区分。
Description
技术领域
本发明涉及DNA突变检测技术领域，尤其涉及一种更为精准的游离DNA突变检测技术。
背景技术
DNA检测是指将被检测者扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。检测的时候，先把受检者的基因从血液或其他细胞中提取出来。然后用可以识别可能存在突变的基因的引物和PCR技术将这部分基因复制很多倍，用有特殊标记物的突变基因探针方法、酶切方法、基因序列检测方法等判断这部分基因是否存在突变或存在敏感基因型。随着突变位点检测要求的提高，传统基于多重PCR的靶向Panel由于测序深度的提高而存在大量背景噪音，已严重限制了靶向测序技术在更高数据精度要求的检测如液体活检中的深入应用。
因此，我们提出了一种更为精准的游离DNA突变检测技术用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种更为精准的游离DNA突变检测技术。
一种更为精准的游离DNA突变检测技术，包括以下步骤：
S1、gDNA的提取：使用gDNA提取试剂盒来提取gDNA，得到具有单一条带的gDNA，将gDNA稀释到500ng/ul；
S2、gDNA的片段化：取一个100ml的烧杯，将烧杯内盛有碎冰且加入适量的无菌水，用一个合适大小的泡沫垫，取20ul的gDNA 并放入到EP管中，将EP管置于泡沫垫的中间且烧杯中，用超声仪对 gDNA进行破碎；
S3、向破碎后的DNA样本中添加分子条形码引物：将分子条形码引物添加到破碎后的gDNA的5′端，添加反应时反应液1组成为：gDNA (20ul)，连接酶Buffer(12ul)，T4DNAligase(2ul)，DEPC水 (26ul)；
S4、对添加分子条形码的样本进行纯化：用纯化柱对完成反应后的反应液1进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用上游引物和基因特异性引物对样本进行纯化，纯化的反应液2为：DNA(5ul)，上游引物(25mM，0.25ul)，基因特异性引物(25mM，0.25ul)，DEPC 水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5ul))，Taq酶(5U/ul，0.2 ul)，dNTP(25mM，0.25ul)；
S5、DNA文库的获取：用纯化柱对完成反应后的反应液2进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用通用引物和样本特异性引物对破碎后的DNA进行文库的扩增，得到含有突变碱基的DNA序列，反应液 3的组成为：DNA(5ul)，通用引物(25mM，0.25ul)，样本特异性引物(25mM，0.25ul)，DEPC水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5 ul)，Taq酶(5U/ul，0.2ul)，dNTP(25mM，0.25ul)；
S6、将S5制得的反应液在PCR完成后的反应液3进行测序分析，得到突变的DNA碱基位点和突变的碱基信息。
优选的，所述超声仪的功率为05％，超声仪设置开的时间为2s，超声仪设置关的时间为2s，超声的时间为40min。
优选的，所述分子条形码引物设计的过程中，分子条形码引物与破碎后的DNA的5′端的重叠区域的长度为15bp-22bp，分子条形码引物的长度为61bp。
优选的，所述基因特异性引物在靠近DNA突变位点的3′端与破碎后的DNA序列的一部分完全相同，且基因特异性引物离DNA突变位点的距离大于200bp，基因特异性引物的长度为56bp-64bp。
优选的，所述通用引物靠近3′的序列为分子条形码引物上的一部分或全部，上游引物靠近3′的序列为通用引物上的一部分或全部，且通用引物和上游引物的长度为56bp-64bp。
优选的，所述样本特异性引物靠近5′的序列的一部分与基因特异性引物序列的一部分或全部重合，样本特异性引物3′端的序列为任意碱基组成，样本特异性引物的长度为56bp-64bp。
优选的，所述反应液1在配制完成后放入PCR仪内进行反应，且反应的条件为25℃，30min。
优选的，所述反应液2和反应液3在进行PCR反应时的反应条件相同，且反应的条件为：
Segment1：94℃，3min；
Segment2：94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s；
18cycles
Segment3：72℃，5min；
Segment4：4℃，forever。
优选的，所述EP管的规格是2ml，且EP管内装有420ul的DEPC 水。
优选的，所述反应液1，反应液2和反应液3的配制都应在冰上操作，且取样完成后用移液枪将反应液1，反应液2和反应液3充分混匀。
本发明的有益效果是：
1、本发明，通过分子条形码技术的引入，使得样本中单一DNA 模板分子上都会高效地引入一个独特的分子标签，从源头对不同来源的模板DNA进行区分。
2、本发明，在进行数据分析时，可以根据分子条形码序列的识别来确定来自同一DNA模板扩增出的片段，通过进一步的分析，从而过滤掉PCR错误及测序错误，提高了检测的灵敏度和突变频率准确性。此外，独特的单端特异性延伸引物设计，也为提高特殊样本的扩增覆盖度及测序数据的有效利用提供了强有力的支撑。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
一种更为精准的游离DNA突变检测技术，包括以下步骤：
S1、gDNA的提取：使用gDNA提取试剂盒来提取gDNA，得到具有单一条带的gDNA，将gDNA稀释到500ng/ul；
S2、gDNA的片段化：取一个100ml的烧杯，将烧杯内盛有碎冰且加入适量的无菌水，用一个合适大小的泡沫垫，取20ul的gDNA 并放入到EP管中，EP管的规格是2ml，且EP管内装有420ul的 DEPC水，将EP管置于泡沫垫的中间且烧杯中，用超声仪对gDNA进行破碎，超声仪的功率为05％，超声仪设置开的时间为2s，超声仪设置关的时间为2s，超声的时间为40min；
S3、向破碎后的DNA样本中添加分子条形码引物：将分子条形码引物添加到破碎后的gDNA的5′端，分子条形码引物设计的过程中，分子条形码引物与破碎后的DNA的5′端的重叠区域的长度为15 bp-22bp，分子条形码引物的长度为61bp，添加反应时反应液1组成为：gDNA(20ul)，连接酶Buffer(12ul)，T4DNA ligase(2ul)， DEPC水(26ul)，反应液1配制应在冰上操作，且取样完成后用移液枪将反应液1充分混匀，反应液1在配制完成后放入PCR仪内进行反应，且反应的条件为25℃，30min；
S4、对添加分子条形码的样本进行纯化：用纯化柱对完成反应后的反应液1进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用上游引物和基因特异性引物对样本进行纯化，基因特异性引物在靠近DNA突变位点的3′端与破碎后的DNA序列的一部分完全相同，且基因特异性引物离DNA突变位点的距离大于200bp，通用引物靠近3′的序列为分子条形码引物上的一部分或全部，上游引物靠近3′的序列为通用引物上的一部分或全部，且通用引物和上游引物的长度为56bp-64bp，基因特异性引物的长度为56bp-64bp，纯化的反应液2为：DNA(5 ul)，上游引物(25mM，0.25ul)，基因特异性引物(25mM，0.25ul)， DEPC水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5ul))，Taq酶(5U/ul， 0.2ul)，dNTP(25mM，0.25ul)，反应液2的配制应在冰上操作，且取样完成后用移液枪将反应液2充分混匀，反应液2在进行PCR反应时反应的条件为：
Segment1：94℃，3min；
Segment2：94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s；
18cycles
Segment3：72℃，5min；
Segment4：4℃，forever；
S5、DNA文库的获取：用纯化柱对完成反应后的反应液2进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用通用引物和样本特异性引物对破碎后的DNA进行文库的扩增，样本特异性引物靠近5′的序列的一部分与基因特异性引物序列的一部分或全部重合，样本特异性引物3′端的序列为任意碱基组成，样本特异性引物的长度为56bp-64bp，得到含有突变碱基的DNA序列，反应液3的组成为：DNA(5ul)，通用引物(25mM，0.25ul)，样本特异性引物(25mM，0.25ul)，DEPC 水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5ul)，Taq酶(5U/ul，0.2ul)， dNTP(25mM，0.25ul)，反应液3的配制应在冰上操作，且取样完成后用移液枪将反应液3充分混匀，反应液3在进行PCR反应时的反应的条件为：
Segment1：94℃，3min；
Segment2：94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s；
18cycles
Segment3：72℃，5min；
Segment4：4℃，forever；
S6、将S5制得的反应液在PCR完成后的反应液3进行测序分析，得到突变的DNA碱基位点和突变的碱基信息。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
S1、gDNA的提取：使用gDNA提取试剂盒来提取gDNA，得到具有单一条带的gDNA，将gDNA稀释到500ng/ul；
S2、gDNA的片段化：取一个100ml的烧杯，将烧杯内盛有碎冰且加入适量的无菌水，用一个合适大小的泡沫垫，取20ul的gDNA并放入到EP管中，将EP管置于泡沫垫的中间且烧杯中，用超声仪对gDNA进行破碎；
S3、向破碎后的DNA样本中添加分子条形码引物：将分子条形码引物添加到破碎后的gDNA的5′端，添加反应时反应液1组成为：gDNA(20ul)，连接酶Buffer(12ul)，T4DNA ligase(2ul)，DEPC水(26ul)；
S4、对添加分子条形码的样本进行纯化：用纯化柱对完成反应后的反应液1进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用上游引物和基因特异性引物对样本进行纯化，纯化的反应液2为：DNA(5ul)，上游引物(25mM，0.25ul)，基因特异性引物(25mM，0.25ul)，DEPC水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5ul))，Taq酶(5U/ul，0.2ul)，dNTP(25mM，0.25ul)；
S5、DNA文库的获取：用纯化柱对完成反应后的反应液2进行纯化，纯化后的体积为20ul，并利用通用引物和样本特异性引物对破碎后的DNA进行文库的扩增，得到含有突变碱基的DNA序列，反应液3的组成为：DNA(5ul)，通用引物(25mM，0.25ul)，样本特异性引物(25mM，0.25ul)，DEPC水(16.5ul)，10X PCR Buffer(2.5ul)，Taq酶(5U/ul，0.2ul)，dNTP(25mM，0.25ul)；
S6、将S5制得的反应液在PCR完成后的反应液3进行测序分析，得到突变的DNA碱基位点和突变的碱基信息。
2.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述超声仪的功率为05％，超声仪设置开的时间为2s，超声仪设置关的时间为2s，超声的时间为40min。
3.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述分子条形码引物设计的过程中，分子条形码引物与破碎后的DNA的5′端的重叠区域的长度为15bp-22bp，分子条形码引物的长度为61bp。
4.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述基因特异性引物在靠近DNA突变位点的3′端与破碎后的DNA序列的一部分完全相同，且基因特异性引物离DNA突变位点的距离大于200bp，基因特异性引物的长度为56bp-64bp。
5.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述通用引物靠近3′的序列为分子条形码引物上的一部分或全部，上游引物靠近3′的序列为通用引物上的一部分或全部，且通用引物和上游引物的长度为56bp-64bp。
6.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述样本特异性引物靠近5′的序列的一部分与基因特异性引物序列的一部分或全部重合，样本特异性引物3′端的序列为任意碱基组成，样本特异性引物的长度为56bp-64bp。
7.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述反应液1在配制完成后放入PCR仪内进行反应，且反应的条件为25℃，30min。
8.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述反应液2和反应液3在进行PCR反应时的反应条件相同，且反应的条件为：
Segment1：94℃，3min；
Segment2：94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s；
18cycles
Segment3：72℃，5min；
Segment4：4℃，forever。
9.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述EP管的规格是2ml，且EP管内装有420ul的DEPC水。
10.根据权利要求1所述的一种更为精准的游离DNA突变检测技术，其特征在于，所述反应液1，反应液2和反应液3的配制都应在冰上操作，且取样完成后用移液枪将反应液1，反应液2和反应液3充分混匀。
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