CN109825581A - 一种检测rassf1a基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测rassf1a基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测RASSF1A基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及应用，包括特异性扩增引物和测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:3。本发明还提供了所述的特异性引物的应用、检测RASSF1A基因甲基化的试剂盒和RASSF1A甲基化检测方法。本发明的检测方法具有高通量性和高准确性，无需在PCR后进行TA克隆，大大节约时间，减少检测成本，提高检测效率。本发明为结肠癌的早期诊断提供了有效手段，具有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测RASSF1A基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
结肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于第三位和第四位。全球每年约有120万名患者被确诊为结肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌(Brenner H,et al,2014)。在我国结肠癌的发病率每年以4.2％的速度发展，每年新发病例高达15万，随着我国居民生活饮食结构的不断改善，其发病率和死亡率都呈逐年上升趋势。虽然早期检查及诊断技术的提高，手术及综合辅助治疗的进步，使得患者的预后有较明显的改善，但是IV期患者的总生存率并不理想(Ciardiello F,2015)。对于特定的分子亚型，其对于药物的原发或继发耐药、加之缺乏特定的治疗靶点，使得部分中晚期患者缺乏有效的治疗手段。
结肠癌的发生发展是一个多阶段、多步骤、多因素综合作用的复杂病理过程。在结肠癌发生过程中，结肠癌上皮细胞可出现遗传和表观遗传两种改变，包括一系列癌基因的激活及抑癌基因的失活等(Markowitz SD,et al,2009)。近年来研究表明CpG岛甲基化是结肠癌发生中抑癌基因失活的重要途径之一，Ras相关结构域家族1A基因(Ras associationdomain familylA，RASSF1A)是新发现的一种抑癌基因，失活比率在结肠癌中高达80％，其失活可导致多条信号通路在不同水平上发生调控异常，从而促进肿瘤细胞的增殖和存活。
RASSF1A的cDNA全长1968bp，内含6个外显子，编码340个氨基酸，产生一组长为38.8KD的蛋白。RASSF1A主要含有4个结构域：C1/DAG结构域。即蛋白激酶C(PKC)保守结构域1，RASSF1A的PKC磷酸化可以调节其微管系统的能力。ATM磷酸化位点，是一种DNA损伤修复位点激酶，参与调节基因的稳定性。RAS相关结构域，能与Ras-GTP结合介导MEK-ERK信号通路。SARAH(Sav/RASSF/Hpo)结构域，能与MST1/2结合而发挥效应。染色体缺失和点突变均可导致RASSF1A失活，在肿瘤细胞中，其功能丧失的原因通常是启动子超甲基化引起的转录子的沉默(Oliveira C,et al,2005)。研究表明，RASSF1A在人体正常组织中均成阳性表达，但在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等绝大多数恶性肿瘤中低表达或表达缺失。将RASSF1A转染入表达阴性的肿瘤细胞中，可显著抑制肿瘤细胞的生长和克隆形成，接种裸鼠后其成瘤生长率也明显降低。利用甲基化特异性PCR进行检测，发现RASSF1A在结直肠癌细胞系、各种类型的实体肿瘤及结直肠癌患者血清中均存在较高的启动子甲基化(Sakamoto N,et al,2004)，进一步提示RASSF1A在结肠癌发生发展过程中发挥着重要的作用。
目前针对RASSF1A基因启动子甲基化的检测方法有很多，如甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)、荧光定量法等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但不能做到定量检测，并且存在较高的假阳性风险；BSP法主要是通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化状态，但由于其操作繁琐，因此不适合大批量检测，同时挑选克隆的数目可能会影响检测结果；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CpG位点的甲基化状态；荧光定量法是基于MSP开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但是探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测RASSF1A基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及应用，将亚硫酸氢盐处理与测序相结合，无需进行TA克隆，直接对PCR产物进行测序；该检测方法特异性强，灵敏度高、快速、成本低，操作简单，可高通量，有利于临床使用和推广。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测RASSF1A基因甲基化的引物，包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的特异性扩增引物，以及SEQ ID NO:3所示序列的测序引物。
本发明提供的引物能检测出RASSF1A基因在启动子区域的甲基化。
本发明还提供一种检测RASSF1A基因甲基化的试剂盒，该试剂盒含有上述的检测RASSF1A基因甲基化的引物。
进一步地，所述试剂盒还含有下列常规组分中的一种或几种：CT ConversionReagent(CT转化试剂)、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、去离子水。所述聚合酶为Taq酶。
在本发明某些实施例中，所述试剂盒制成EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒。
本发明还提供一种利用上述试剂盒进行RASSF1A基因甲基化的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取细胞或组织中的DNA；
(2)使用EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒，将步骤(1)提取的DNA进行亚硫酸氢盐修饰；
(3)RASSF1A基因甲基化检测：
将已经过亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增；
电泳检测PCR产物，然后直接进行测序。
进一步地，所述PCR扩增为降落PCR扩增反应。
进一步地，所述降落PCR扩增反应条件如下：
PCR反应条件为：a、94℃，10min预变性；b、94℃，30s变性；72℃-60℃每间隔45s降低2度；72℃，10min；c、94℃，30s；58℃，45s；72℃，1min；此步骤35个循环；d、72℃，1min；e、4℃，停止。
本发明还提供所述的检测RASSF1A基因甲基化的引物在RASSF1A基因甲基化检测中的应用。
本发明还提供所述的检测RASSF1A基因甲基化的引物在制备RASSF1A基因甲基化检测试剂盒中的应用。
本发明公开了以下技术效果：本发明将亚硫酸氢盐处理与测序相结合，无需进行TA克隆，直接对PCR产物进行测序；该检测方法检测周期短、通量高、操作简单、灵敏度高、特异性好，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预后具有很好的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明针对细胞的DNA模板扩增结果；
图2为本发明针对细胞的DNA模板中RASSF1A基因甲基化测序结果图；
图3为本发明针对组织的DNA模板扩增结果；
图4为本发明针对组织的DNA模板中RASSF1A基因甲基化测序结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1结肠癌细胞中RASSF1A基因甲基化检测
1、实验材料
结肠癌细胞(DLD1，HCT116，LOVO)、蛋白酶K、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒(ZYMO RESEARCH)、去离子水，primers，Taq酶,PCR仪，1％的琼脂糖凝胶，电泳仪。
2、实验步骤及结果
2.1DNA提取
(1)复苏并培养结肠癌细胞，当细胞长至80％的密度后，离心收集细胞沉淀。
(2)加入蛋白酶K(10mg/mL)10μL，温和的翻转8次，混匀，56℃温育过夜，不时翻转混匀。
(3)加入等体积Tris-饱和酚，翻转10min混匀。
(4)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(5)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，翻转10min混匀。
(6)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(7)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，翻转10min混匀。
(8)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(9)加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，摇晃或者涡旋，出现白色絮状DNA沉淀。
(10)12000rpm，4℃，离心10min，小心倒掉上清，在吸水纸上扣干残液。
(11)加入70％乙醇1mL重悬沉淀，12000rpm，4℃，离心10min，小心倒掉上清，在吸水纸上扣干残液。
(12)打开管盖，室温晾干，加入去离子水30-50μL，低速涡旋或用枪吹洗混匀，室温静置10min。
(13)测定浓度和A260/A280,同时电泳检测DNA有无降解。置于-20℃保存。
2.2亚硫酸盐处理
使用EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，具体步骤如下。
(1)在PCR单管中加入130μL的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品(如样品少于20ul，用水补齐)。
(2)将上述样品置于PCR仪上反应(98℃10min；64℃2.5h；4℃停止)。
(3)将600μL的M-Binding Buffer(结合缓冲液)加入Zymo-SpinTMIC Column(吸附柱)中，并将其放入收集管中。
(4)将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTMIC Column中，关上盖子并颠倒混匀。
(5)离心(12000rpm)30s，弃收集管中的液体。
(6)加入100μL的M-Wash Buffer(洗涤缓冲液)，离心(12000rpm)30s。
(7)加入200μL的M-Desulphonation Buffer(脱磺化缓冲液)，在室温下(20℃～30℃)静置15-20分钟，离心(12000rpm)30s。
(8)加入200μL的M-Wash Buffer，离心(12000rpm)30s。重复一次。
(9)将Zymo-SpinTMIC Column置入1.5mL离心管中，加入10μL的M-Elution Buffer(洗脱缓冲液)，尽量靠近柱子中心，离心(12000rpm)30s。产物放入-20℃保存。
2.3PCR反应
将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，配置如下体系：
| Taq mix | 10μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 10μM primers(正向引物和反向引物) | 2.5μL |
| H<sub>2</sub>O | 5.5μL |
PCR反应条件为：a、94℃，10min预变性；b、94℃，30s变性；72℃-60℃每间隔45s降低2度；72℃，10min；c、94℃，30s；58℃，45s；72℃，1min；此步骤35个循环；d、72℃，1min；e、4℃，停止。PCR反应结束后，铺1％的琼脂糖凝胶检测，检测结果如图1所示，结果显示PCR对RASSF1A基因启动子区域出现特异性扩增；然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序检测。测序结果如图2所示，DLD1细胞中RASSF1A基因出现甲基化，HCT116和LOVO细胞中RASSF1A基因没有甲基化。
实施例2结肠癌组织中RASSF1A基因甲基化检测
1、实验材料
结肠癌组织(2例结肠癌组织，1例正常组织)、蛋白酶K、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒(ZYMO RESEARCH)、去离子水，primers，Taq酶,PCR仪，1％的琼脂糖凝胶，电泳仪。
2、实验步骤及结果
2.1DNA提取
(1)将手术收收集的组织样本置于组织裂解液中。
(2)加入蛋白酶K(10mg/mL)10μL，温和的翻转8次混匀，56℃温育过夜，不时翻转混匀。
(3)加入等体积Tris-饱和酚，翻转10min混匀。
(4)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(5)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，翻转10min混匀。
(6)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(7)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，翻转10min混匀。
(8)离心：12000rpm，15min，吸取上层水相。
(9)加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，摇晃或者涡旋，会出现白色絮状DNA沉淀。
(10)12000rpm，4℃，离心10min，小心倒掉上清，在吸水纸上扣干残液。
(11)加入70％乙醇1mL重悬沉淀，12000rpm，4℃，离心10min，小心倒掉上清，在吸水纸上扣干残液。
(12)打开管盖，室温晾干，加入去离子水30-50μL，低速涡旋或用枪吹洗混匀，室温静置10min。
(13)测定浓度和A260/A280,同时电泳检测DNA有无降解。置于-20℃保存。
2.2亚硫酸盐处理
使用EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，具体步骤如下。
(1)在PCR单管中加入130μL的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品(如样品少于20ul，用水补齐)。
(2)将上述样品置于PCR仪上反应(98℃10min；64℃2.5h；4℃停止)。
(3)将600μL的M-Binding Buffer加入Zymo-SpinTMIC Column中，并将其放入收集管中。
(4)将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTMIC Column中，关上盖子并颠倒混匀。
(5)离心(12000rpm)30s，弃收集管中的液体。
(6)加入100μL的M-Wash Buffer，离心(12000rpm)30s。
7、加入200μL的M-Desulphonation Buffer，在室温下(20℃～30℃)静置15-20分钟，离心(12000rpm)30s。
8、加入200μL的M-Wash Buffer，离心(12000rpm)30s。重复一次。
9、将Zymo-SpinTMIC Column置入1.5mL离心管中，加入10μL的M-Elution Buffer(尽量靠近柱子中心)，离心(12000rpm)30s。产物放入-20℃保存。
2.3PCR反应
将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，配置如下体系：
| Taq mix | 10μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 10μM primers(正向引物和反向引物) | 2.5μL |
| H<sub>2</sub>O | 5.5μL |
PCR反应条件为：a、94℃，10min预变性；b、94℃，30s变性；72℃-60℃每间隔45s降低2度；72℃，10min；c、94℃，30s；58℃，45s；72℃，1min；此步骤35个循环；d、72℃，1min；e、4℃，停止。PCR反应结束后，铺1％的琼脂糖凝胶检测，检测结果如图3所示，结果显示PCR对RASSF1A基因启动子区域出现特异性扩增；然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序检测。测序结果如图4所示，2例结肠癌组织中RASSF1A基因出现甲基化，1例正常组织中RASSF1A基因没有甲基化。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种检测RASSF1A基因甲基化的引物、检测方法、试剂盒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
agggttttcc cagtcacggg ttttatagtt tttgtattta ggttttta 48
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
caactcaata aactcaaact ccc 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
agggttttcc cagtcacg 18
Claims (8)
1.一种检测RASSF1A基因甲基化的引物，其特征在于，包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的特异性扩增引物，以及SEQ ID NO:3所示序列的测序引物。
2.一种检测RASSF1A基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的检测RASSF1A基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有下列常规组分中的一种或几种：CT转化试剂、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、去离子水。
4.一种RASSF1A基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取细胞或组织中的DNA；
(2)使用权利要求2或3所述的试剂盒，将步骤(1)提取的DNA进行亚硫酸氢盐修饰；
(3)RASSF1A基因甲基化检测
将已经过亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增；
电泳检测PCR产物，然后直接进行测序。
5.根据权利要求4所述的RASSF1A基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增为降落PCR扩增反应。
6.根据权利要求5所述的RASSF1A基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述降落PCR扩增反应条件如下：
PCR反应条件为：a、94℃，10min预变性；b、94℃，30s变性；72℃-60℃每间隔45s降低2度；72℃，10min；c、94℃，30s；58℃，45s；72℃，1min；此步骤35个循环；d、72℃，1min；e、4℃，停止。
7.如权利要求1所述的检测RASSF1A基因甲基化的引物在RASSF1A基因甲基化检测中的应用。
8.如权利要求1所述的检测RASSF1A基因甲基化的引物在制备RASSF1A基因甲基化检测试剂盒中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN109825581A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229908A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-13 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒 |
| CN110669842A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 上海中科生物医学高科技开发有限公司 | 一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法 |
| CN113373204A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-10 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 用于人rassf1a基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005049861A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-06-02 | Epigenomics Ag | Method for the analysis of gynaecological cell proliferative disorders |
| CN101512014A (zh) * | 2006-05-03 | 2009-08-19 | 香港中文大学 | 新的胎儿甲基化标记物 |
| CN102628087A (zh) * | 2012-04-25 | 2012-08-08 | 四川大学 | 肝癌早期预警和筛查试剂 |
| US20140155279A1 (en) * | 2012-11-14 | 2014-06-05 | JBS Science Inc. | Detection of a panel of urine DNA markers for HCC screening and disease management |
| CN104774957A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-07-15 | 上海透景生命科技股份有限公司 | 诊断人shox2基因和人rassf1a基因甲基化的方法和试剂盒 |
| CN106048035A (zh) * | 2016-07-02 | 2016-10-26 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | Sfrp4基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
| CN106119373A (zh) * | 2016-07-02 | 2016-11-16 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | Sfrp5基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
| CN106434965A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-02-22 | 福州艾迪康医学检验所有限公司 | Msh3基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
| CA3010052A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Technische Universitat Dresden | Method and means for diagnosing tumours |
| CN107974503A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-05-01 | 上海透景诊断科技有限公司 | 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用 |
-
2019
- 2019-02-28 CN CN201910150721.3A patent/CN109825581A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005049861A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-06-02 | Epigenomics Ag | Method for the analysis of gynaecological cell proliferative disorders |
| CN101512014A (zh) * | 2006-05-03 | 2009-08-19 | 香港中文大学 | 新的胎儿甲基化标记物 |
| CN102628087A (zh) * | 2012-04-25 | 2012-08-08 | 四川大学 | 肝癌早期预警和筛查试剂 |
| US20140155279A1 (en) * | 2012-11-14 | 2014-06-05 | JBS Science Inc. | Detection of a panel of urine DNA markers for HCC screening and disease management |
| CN104774957A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-07-15 | 上海透景生命科技股份有限公司 | 诊断人shox2基因和人rassf1a基因甲基化的方法和试剂盒 |
| CA3010052A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Technische Universitat Dresden | Method and means for diagnosing tumours |
| CN106048035A (zh) * | 2016-07-02 | 2016-10-26 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | Sfrp4基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
| CN106119373A (zh) * | 2016-07-02 | 2016-11-16 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | Sfrp5基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
| CN107974503A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-05-01 | 上海透景诊断科技有限公司 | 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用 |
| CN106434965A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-02-22 | 福州艾迪康医学检验所有限公司 | Msh3基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| PARRISH RR, DAY JJ, LUBIN FD: "Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation patterns with gene and nucleotide resolution from brain tissues", 《CURR PROTOC NEUROSCI》 * |
| QIAN ZR, SANO T, YOSHIMOTO K等: "Inactivation of RASSF1A tumor suppressor gene by aberrant promoter hypermethylation in human pituitary adenomas", 《LAB INVEST》 * |
| 张莉君，王先良，孙晞等: "改进的亚硫酸氢钠测序法检测HepG2 RASSF1A基因CpG岛甲基化状态", 《华中科技大学学报(医学版)》 * |
| 梁永，董柏萍，邱镇等: "RASSF1A和APC基因启动子区甲基化与前列腺癌的关系", 《第二军医大学学报》 * |
| 潘宝龙，黄尤光，林明等: "结直肠癌患者RASSF1A基因启动子区甲基化及表达缺失的研究", 《实用检验医师杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229908A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-13 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒 |
| CN110229908B (zh) * | 2019-07-03 | 2023-01-31 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒 |
| CN110669842A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 上海中科生物医学高科技开发有限公司 | 一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法 |
| CN113373204A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-10 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 用于人rassf1a基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法 |
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