CN113373204A

CN113373204A - 用于人rassf1a基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113373204A
Application number: CN202110795567.2A
Authority: CN
Inventors: 张佳幸; 刘枭男; 崔亚丽
Original assignee: Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Current assignee: Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2021-09-10

Abstract

本发明属于DNA甲基化检测领域，特别涉及一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物、试剂盒及方法。克服现有特定CpG位点的甲基化检测方法操作繁琐，检测仪器成本高的技术问题。引物组包括甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点进行识别与扩增；在甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对中正向引物的5'端均标记地高辛，反向引物的5'端均标记生物素。通过优化引物在保证准确性、操作简便性的同时提高了速度和灵敏度，0.1％的靶点变异可在90分钟内区分，较之前DNA甲基化试纸条检测方法显著提高了速度和灵敏度。且检测过程中仅通过试纸条目视化判读结果，极大地降低了整个检测的成本。

Description

用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于DNA甲基化检测领域，特别涉及一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法。

背景技术

近年来，随着肿瘤表观遗传学形成机制的研究深入，DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，通过甲基供体S-腺苷甲硫氨酸将一个甲基转移到特定碱基上进行共价修饰。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化位于胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的胞嘧啶C-5位上。DNA甲基化状态的改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。一些抑癌基因的CpG的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，肿瘤相关的基因的启动子甲基化是癌症的重要指标，包括癌症的诊断和早期检测，致癌基因的风险预测，癌症预后的预测，治疗后的随诊，抗癌治疗的反应的预测。

Ras相关结构域家族基因1(ras association domain family gene 1，RASSF1)是2000年发现的一种新的抑癌基因，定位于3号染色体短臂2区1带3亚带(3p21.3)。根据mRNA转录过程中不同的选择性剪切和启动子的差异，形成3种主要的转录本，即RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C。RASSF1A拥有Ras结构域，Ras结构域与RASSF1A以GTP依赖方式相结合，是RASSF1A蛋白发挥其抑癌作用的关键。其中RASSF1A在正常组织中均有表达，但在胃癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等绝大多数肿瘤中存在较高的表达缺失率。目前认为RASSF1A表达失活主要与启动子区域CpG岛特异的高甲基化、杂合性丢失及染色体缺失有关。研究证明在多种肿瘤细胞中，如：肺癌、乳腺癌、结肠癌及泌尿系肿瘤中有RASSF1A的缺失及高甲基化，胃癌中也有高甲基化的表达。研究发现，RASSF1A启动子区域的高甲基化具有广泛的肿瘤谱。多数相关研究证明启动子区域CpG岛的超甲基化状态是导致RASSF1A的表达失活的机制之一。

现有的DNA甲基化检测方法可归类为限制性内切酶消化、亲和性富集和亚硫酸盐转化3种策略。而基于亚硫酸盐转化的方法是最为广泛研究的，亚硫酸盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)相似，当进行PCR反应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧啶，而5-甲基胞嘧啶在亚硫酸盐处理过程中不发生改变，经PCR扩增后的产物依然是胞嘧啶，最后对PCR产物进行分析就可判断CpG位点是否发生甲基化。目前开发了很多基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化检测方法，例如实时荧光定量甲基化特异性PCR，甲基化敏感高分辨率熔解曲线，毛细管电泳等。虽然这些方法可以准确测定特定CpG位点的甲基化状态，但由于仪器复杂昂贵或操作繁琐，阻碍了这些方法在基层医疗机构的应用和精准医疗的普及。因此，研究并开发一种快速简便，无需大型仪器设备的DNA甲基化检测方法对癌症的诊断以及癌症预后都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物、试剂盒及方法，克服现有特定CpG位点的甲基化检测方法操作繁琐，检测仪器成本高的技术问题。

本发明的技术方案是提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组，其特殊之处在于：包括甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点进行识别与扩增；在甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对中正向引物的5'端均标记地高辛，反向引物的5'端均标记生物素。

进一步地，上述甲基化特异性引物对中正向引物的核苷酸序列为：

5'-digoxin-GGGTTTTGCGAGAGCGC-3'；

上述甲基化特异性引物对中反向引物的核苷酸序列为：

5'-biotin-CGCTAACAAACGCGAACCG-3'；

上述未甲基化特异性引物对中正向引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-GGGGGGTTTTGTGAGAGTGT-3'；

上述未甲基化特异性引物对中反向引物的核苷酸序列为：5'-biotin-CTTTAAACACTAACAAACACAAACCA-3'。

本发明还提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的试剂盒，其特殊之处在于：包括人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液和试纸条；人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液包括甲基化特异性PCR反应组分、上述用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组。

进一步地，上述试纸条包括样本垫、结合垫及检测区；上述结合垫上喷涂地高辛单抗修饰的金磁微粒；上述检测区包括检测线和质控线，上述检测线上喷涂链亲和素，质控线上喷涂羊抗鼠IgG。

进一步地，上述地高辛单抗修饰的金磁微粒，为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe₃O₄磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗。

本发明还提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

步骤1、提取并处理样本基因组DNA；

提取样本基因组DNA，并进行亚硫酸盐处理，以用于PCR反应；

步骤2、针对待检测基因设计特异性引物组；

针对待检测RASSF1A基因的CpG位点，设计特异性引物组，上述特异性引物组为权利要求1或2上述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组；即甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点进行识别与扩增；待检测RASSF1A基因为需要检测的基因唯一具有、其它生物中不具有、并且通过公用数据库可以获得的核酸序列信息；

步骤3、样本甲基化状态检测；

步骤3.1、针对步骤1处理后的任一样本，平行做两管PCR反应，其中一管加入甲基化特异引物对，另一管中加入未甲基化特异引物对，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物；该步骤的扩增是特异的，只扩增步骤2中RASSF1A基因的特定核酸序列片段，不扩增其它序列片段；

步骤3.2、将两管扩增产物分别滴加至权利要求4上述试剂盒中的试纸条样本垫进行层析；根据检测线显示状态，确定样本甲基化状态。

进一步地，步骤3.2中根据检测线显示状态，确定样本甲基化状态具体为：

当只有滴加含有甲基化特异引物对的扩增产物在试纸条的检测线上显色时，表示DNA甲基化状态为完全甲基化；

当只有滴加含有未甲基化特异引物对的扩增产物在试纸条的检测线上显色时，表示DNA甲基化状态为未甲基化；

当滴加含有甲基化特异引物对的扩增产物和含有未甲基化特异引物对的扩增产物均在试纸条的检测线上显色时，则表示DNA甲基化状态为部分甲基化。

进一步地，步骤1中上述样本基因组DNA为组织基因组DNA、外周血游离DNA或尿液游离DNA。

进一步地，步骤3.1中PCR反应体系包括以下组分：以总体积50μL计：1×EpiTaqPCR Buffer，上下游引物各80-120nM，0.25-0.4mM dNTPs，3mM MgCl₂，0.5U HotMaster TaqDNA Polymerase，模板DNA，无菌水补齐50μL。

进一步地，步骤3.1中反应条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，15s；退火60℃，25s；延伸72℃，30s；共30个循环，最终延伸72℃，5min，结束4℃，∞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)检测速率和灵敏度较高；

本发明通过优化引物在保证准确性、操作简便性的同时提高了速度和灵敏度，0.1％的靶点变异可在90分钟内区分，较之前DNA甲基化试纸条检测方法显著提高了速度和灵敏度；并通过优化反应体系等条件可进一步提高速度和灵敏度。

(2)检测成本低，便于推广使用

已有的DNA甲基化检测技术，如荧光定量法、基因芯片杂交法、结合凝胶电泳法、结合毛细管电泳法、直接测序法等，通常需要配备一些特殊仪器，如基因测序仪，芯片点样仪，荧光定量仪，电泳及成像设备等，或者需要复杂的扩增产物酶处理过程，需要耗费高额成本以完成检测。本发明无需特殊仪器设备，仅通过试纸条目视化判读结果，极大地降低了整个检测的成本，便于在各级医疗机构推广使用。

附图说明

图1为本发明CpG位点为完全甲基化状态时的试纸显色结果示意图。

图2为本发明CpG位点为部分甲基化状态时的试纸显色结果示意图。

图3为本发明CpG位点为未甲基化状态时的试纸显色结果示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明通过下述过程实现基因甲基化检测：

步骤一、样本基因组DNA的提取、分离，本发明中，样本类型可以是组织基因组DNA、外周血游离DNA或尿液游离DNA。作为从上述试样提取、分离DNA的方法，没有特别限制，可以适当选择使用公知的方法。

步骤二、采用亚硫酸盐转换策略对样本基因组DNA进行处理，本发明中，作为DNA的亚硫酸盐处理的方法，没有特别限制，可以适当选择使用公知的方法。

步骤三、针对待检测RASSF1A基因的CpG位点，设计两对特异性引物，即甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对特定CpG位点进行识别与扩增；在正向引物的5'端标记地高辛，在反向引物的5'端标记生物素。

步骤四、针对每一个样本CpG位点的甲基化状态检测，平行做M、U两管PCR反应(M指示甲基化，U指示未甲基化)，其中M管加入甲基化特异引物对，U管中加入未甲基化特异引物对，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物，PCR的扩增体系包括以下组分：以总体积50μL计：1×EpiTaq PCR Buffer，上下游引物各80-120nM，0.25-0.4mM dNTPs，3mM MgCl₂，0.5U HotMaster Taq DNAPolymerase，模板DNA，无菌水补齐50μL；PCR扩增条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，15s；退火60℃，25s；延伸72℃，30s；共30个循环，最终延伸72℃，5min，结束4℃，∞。

步骤五、以地高辛单抗修饰的金磁微粒作为载体，通过地高辛和地高辛单抗作用，生物素和链亲和素作用，对步骤四中得到的扩增产物进行免疫层析，判读DNA甲基化状态，所述的地高辛单抗修饰的金磁微粒喷涂在试纸条的结合垫上，链亲和素和羊抗鼠IgG分别喷涂在试纸条的检测线和质控线上。所述地高辛单抗修饰的金磁微粒，为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe₃O₄磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。

具体过程为：将步骤四完成的M、U两管扩增产物分别滴在两支试纸条的样本垫上进行层析，由于地高辛和生物素标记引物的引入，获得的扩增产物一端标记有地高辛，另一端标记有生物素，将反应液滴加至试纸条的样本垫上后，扩增子标记有地高辛的一端可以被地高辛单抗金磁微粒识别和偶联，接着层析上移至检测线处，扩增子标记有生物素的一端与链亲和素特异结合显色，依次判断其甲基化状态。

当只有滴加含有甲基化特异引物对的扩增产物在试纸条的检测线上显色时，表示DNA甲基化状态为完全甲基化；相反，当只有滴加含有未甲基化特异引物对的扩增产物在试纸条的检测线上显色时，表示DNA甲基化状态为未甲基化；而当滴加含有甲基化特异引物对的扩增产物和含有未甲基化特异引物对的扩增产物均在试纸条的检测线上显色时，则表示DNA甲基化状态为部分甲基化。

本发明还提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的试剂盒，包括人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液和上述试纸条；人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液包括甲基化特异性PCR反应组分及上述用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组。

下面以实施例阐述本发明提供的一种位点特异性的人RASSF1A基因甲基化试纸条检测方法的实施过程。

实施例1、引物的设计与优化

针对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点设计两对特异性引物，即甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对特定CpG位点进行识别与扩增；为了利于后续层析检测技术，针对设计的引物进行生物标记。在正向引物的5'端标记地高辛，在反向引物的5'端标记生物素；为增加扩增特异性和检测分辨率，同时设计多组引物进行试验筛选。

根据以下目标筛选最优引物：(1)扩增特异性高：完全甲基化、未甲基化特异性引物均只能对相应的模板扩增出特异的目的条带。(2)扩增灵敏度高，能在样本中存在低至0.1％目的序列的情况下有效扩增出目的片段。(3)对样本类型的适应度高，不仅适用于常见的基因组DNA样本，而且对外周血游离DNA和尿液游离DNA也能有效特异地扩增。

其中，对于扩增准确性和灵敏度，按照下述步骤进行筛选：用已知确定的完全甲基化和未甲基化的人基因组DNA作为模板进行梯度稀释，使得目的序列占总模板中的比例为：50％、25％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％。利用设计的多套备选引物上述各个比例的模板进行扩增，同时设置阳性质控和阴性质控。将扩增后的产物分为2部分，分别进行琼脂糖凝胶电泳检测和本申请的试纸条层析系统检测，确定所设计的引物准确性与灵敏度。

最终确定甲基化特异性引物对的正向引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-GGGTTTTGCGAGAGCGC-3'；甲基化特异性反向引物的核苷酸序列为：5'-biotin-CGCTAACAAACGCGAACCG-3'；未甲基化特异性引物对的正向引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-GGGGGGTTTTGTGAGAGTGT-3'；未甲基化特异性反向引物的核苷酸序列为：5'-biotin-CTTTAAACACTAACAAACACAAACCA-3'。

实验结果表明，优化后的引物对样品进行扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳和试纸条层析系统均能检测出比例低至0.1％的突变。另外，用肉眼判断层析试纸条对于0.1％模板的检测信号强度明显高于琼脂糖凝胶电泳的信号强度且没有假阳性的出现，与预期的结果相吻合。

实施例2、退火温度和循环数的优化

对于新建立的方法，需经过系统的优化使该检测方法的检测效果达到最佳。本发明通过对该检测方法的PCR反应扩增部分加以优化，增加扩增特异性和检测分辨率。本发明选择一系列梯度温度(57℃、58℃、59℃、60℃、61℃)对该检测方法进行优化，以选择最佳的退火温度。选择合适的退火温度后，还需确定扩增反应的最佳循环数。本发明选择一系列循环数(28、29、30、31、32)对该检测方法进行优化，以选择最佳的反应循环数。

利用设置的一系列梯度温度及循环数进行扩增，同时设置阳性质控和阴性质控。PCR反应结束后，通过层析系统检测扩增特异性和检测分辨率，并分析假阳性的有无来判断检测目的位点的最优退火温度和循环数。

实验结果表明，优化后的退火温度(60℃)和循环数(30个)对样品进行扩增后，通过层析系统能检测出最优的扩增特异性和检测分辨率且没有假阳性的出现。

实施例3、组织DNA样本的检测

取10例石蜡包埋组织样本，纯化基因组DNA后亚硫酸盐处理转化备用；

对每一个样本CpG位点的甲基化状态检测，取M、U两支离心管中分别加入以下物质(M管中加入甲基化特异性引物对，U管中加入未甲基化特异性引物对)：两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物，PCR的扩增体系包括以下组分：以总体积50μL计：1×EpiTaq PCR Buffer，上下游引物各80-120nM，0.25-0.4mM dNTPs，3mMMgCl₂，0.5U HotMaster Taq DNA Polymerase，模板DNA，无菌水补齐50μL；PCR扩增条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，15s；退火60℃，25s；延伸72℃，30s；共30个循环，最终延伸72℃，5min，结束4℃，∞。

将M、U两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，按照如下原则进行突变与否的判断：如果结果如图1所示，M管甲基化特异性引物组对应的试纸条的检测线显色、而U管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的检测线不显色则表明位点为完全甲基化。结果如图2所示M管甲基化特异性引物组对应的试纸条的检测线不显色、而U管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的检测线显色则表明位点为未甲基化，结果如图3所示两个管对应的试纸条的检测线均显色则表明位点为部分甲基化。

Claims

1.一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组，其特征在于：包括甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点进行识别与扩增；在甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对中正向引物的5'端均标记地高辛，反向引物的5'端均标记生物素。

2.根据权利要求1所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组，其特征在于：

所述甲基化特异性引物对中正向引物的核苷酸序列为：

5'-digoxin-GGGTTTTGCGAGAGCGC-3'；

所述甲基化特异性引物对中反向引物的核苷酸序列为：

5'-biotin-CGCTAACAAACGCGAACCG-3'；

所述未甲基化特异性引物对中正向引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-GGGGGGTTTTGTGAGAGTGT-3'；

所述未甲基化特异性引物对中反向引物的核苷酸序列为：5'-biotin-CTTTAAACACTAACAAACACAAACCA-3'。

3.一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：包括人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液和试纸条；人RASSF1A基因甲基化特异性扩增反应液包括甲基化特异性PCR反应组分、权利要求1或2所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组。

4.根据权利要求3所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：所述试纸条包括样本垫、结合垫及检测区；所述结合垫上喷涂地高辛单抗修饰的金磁微粒；所述检测区包括检测线和质控线，所述检测线上喷涂链亲和素，质控线上喷涂羊抗鼠IgG。

5.根据权利要求4所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：所述地高辛单抗修饰的金磁微粒，为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe₃O₄磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗。

6.一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取并处理样本基因组DNA；

提取样本基因组DNA，并进行亚硫酸盐处理，以用于PCR反应；

步骤2、针对待检测基因设计特异性引物组；

针对待检测RASSF1A基因的CpG位点，设计特异性引物组，所述特异性引物组为权利要求1或2所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组；

步骤3、样本甲基化状态检测；

步骤3.1、针对步骤1处理后的任一样本，平行做两管PCR反应，其中一管加入甲基化特异引物对，另一管中加入未甲基化特异引物对，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物；

步骤3.2、将两管扩增产物分别滴加至权利要求4所述试剂盒中的试纸条样本垫进行层析；根据检测线显示状态，确定样本甲基化状态。

7.根据权利要求6所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特征在于，步骤3.2中根据检测线显示状态，确定样本甲基化状态具体为：

8.根据权利要求7所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特征在于，步骤1中所述样本基因组DNA为组织基因组DNA、外周血游离DNA或尿液游离DNA。

9.根据权利要求8所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特征在于，步骤3.1中PCR反应体系包括以下组分：以总体积50μL计：1×EpiTaq PCR Buffer，上下游引物各80-120nM，0.25-0.4mM dNTPs，3mM MgCl₂，0.5U HotMaster Taq DNA Polymerase，模板DNA，无菌水补齐50μL。

10.根据权利要求9所述的用于人RASSF1A基因甲基化检测的方法，其特征在于，步骤3.1中反应条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，15s；退火60℃，25s；延伸72℃，30s；共30个循环，最终延伸72℃，5min，结束4℃，∞。