CN110283913A - Rassf1a基因甲基化状态检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒，所述试剂盒包括茎环状引物，所述茎环状引物用于特异性扩增检测RASSF1A基因的转录起始区上游‑1至‑187bp中富含CpG岛的序列。本发明设计的茎环状引物，其能显著提高DNA中甲基化DNA的检出效率，防止非甲基化DNA模板的非特异性扩增；本发明的试剂盒能增加检测肿瘤特异性的同时，提高了检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别涉及RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒及其应用。
背景技术
基因甲基化是肿瘤发生的早期事件。基因先发生甲基化，影响到基因的表达，最终导致蛋白的表达出现异常，导致细胞发生癌变。最近几年以来，通过基因甲基化来早期诊断肿瘤，或者评估肿瘤患者的预后已经从实验室走向临床应用。RASS1A基因(Ras相关结构域家族1A,Ras-associated domain family 1A)目前已被广泛认为是肿瘤抑癌基因。RASSF1A基因的正常表达在细胞的正常生长和分化以及凋亡的过程中起着重要的影响和调节作用。RASSF1A基因在多种肿瘤细胞中被灭活或沉默，造成这种灭活或沉默的主要机制就是RASSF1A基因启动子发生了甲基化。RASSF1A基因甲基化现象已经在肺癌、鼻咽癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等肿瘤中有所报道。
在检测肿瘤组织的基因甲基化时，存在检测特异性的问题。肿瘤组织提取的DNA存在大量非肿瘤细胞的非甲基化DNA，以RASSF1A基因为例，存在发生了甲基化的RASSF1A基因和未发生甲基化的RASSF1A基因。若以亚硫酸盐转化的方式为来检测甲基化，RASSF1A基因序列在通过亚硫酸盐转化后，只有少数几个甲基化的CpG岛序列保持为CG序列，非甲基化的RASSF1A基因序列经过亚硫酸盐转化为TG序列，这样甲基化的RASSF1A序列和非甲基化的RASSF1A序列只有少数几个碱基不同；这样在后续的检测方法中，就需要在区分少数的碱基上在保证检测特异性的同时，还需要保证检测的效率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒，所述试剂盒包括茎环状引物，所述茎环状引物用于特异性扩增检测RASSF1A基因的转录起始区上游-1至-187bp中富含CpG岛的序列。
在一种实施方式中，所述茎环状引物的3'端序列是根据RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的位点序列进行设计，而所述茎环状引物的5'端序列不能和RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的3'端甲基化序列互补杂交，但可以和非甲基化的3'端序列互补杂交。
在一种实施方式中，所述茎环状引物是茎环状上游引物SEQ ID NO:1：AAACACAAACCAAACAAAACCGAAGTCGGGGTTCGTTTTG，其中下划线处为针对亚硫酸盐转化后的基因组DNA互补的特异扩增序列，而非划线部分为茎环形成序列。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括以下下游引物和探针：下游引物序列SEQ IDNO:3：CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG；和检测探针序列SEQ ID NO:4：AAACGCGAACCGAACGAAACC。
在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒在肿瘤检测中的应用。
在一种实施方式中，肿瘤是鼻咽癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。
本发明通过筛选比较，发现RASSF1A基因转录起始子上游-1至-187bp区段是在肿瘤组织甲基化改变最明显的区域。为此，本发明设计了进行扩增的茎环状引物，其能显著提高DNA中甲基化DNA的检出效率，防止非甲基化DNA模板的非特异性扩增。从而使用本发明的RASSF1A基因甲基化检测试剂盒用于辅助诊断肿瘤诸如肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌的检测，本发明的试剂盒能增加检测肿瘤特异性的同时，提高了检测的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是在病理上确认为鼻咽炎患者的鼻咽拭子提取的DNA进行甲基化荧光定量PCR反应图，其中参与反应的为普通上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，短虚线是RASSF1A基因的反应曲线；
图2是在病理上确认为鼻咽炎患者的鼻咽拭子提取的DN所进行的甲基化荧光定量PCR反应图，其中参与反应的为茎环状上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，短虚线是RASSF1A基因的反应曲线；
图3是在病理上确认为鼻咽癌患者的鼻咽拭子提取的DNA进行的甲基化荧光定量PCR反应图，参与反应的为普通上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，短虚线是RASSF1A基因的反应曲线；和
图4是在病理上确认为鼻咽癌患者的鼻咽拭子提取的DNA进行的甲基化荧光定量PCR反应图，其中参与反应的为茎环状上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，短虚线是RASSF1A基因的反应曲线。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一.本发明的RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒
1.检测RASSF1A基因甲基化状态的引物和探针的设计
本发明通过分析RASSF1A基因启动子的序列找到CpG序列相对富集的区域，然后通过一种茎环状的引物来特异性扩增CG碱基序列而防止TG碱基序列的扩增。
本申请的发明人在RASSF1A基因的转录起始区上游-1至-187bp处寻找到富含CpG岛的序列，以下是RASSF1A基因的转录区片段，其中高亮处的三个碱基ATG是转录起始点，下划线表示引物发生作用的序列，方框表示探针的位置，从ATG上面的CCGG到开始的序列正好是187个碱基。
本申请针对上述序列设计了以下引物和探针序列，具体参见下表1。
表1本发明的引物和探针序列
注释1：下划线处为针对亚硫酸盐转化后的基因组DNA互补的特异扩增序列非划线部分为茎环形成序列。
另外，本发明选择ACTB基因作为参照，并设计了相应引物和探针，
具体引物和探针序列如以下表2。
表2 ACTB基因的引物和探针
| 序列名称 | 序列(5’-3’) | 序列号 |
| ACTB上游引物 | ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT | SEQ ID NO:5 |
| ACTB下游引物 | CTCCCRCAAAACAACCAC | SEQ ID NO:6 |
| ACTB探针 | VIC-CCACCTTACCCTAAACACTACAAC-BHQ1 | SEQ ID NO:7 |
2.本发明茎环引物对于优先扩增DNA中的甲基化DNA的作用机制。
在基因组序列上游引物所在位置的3'部分，由于肿瘤组织或者肿瘤患者的血浆游离DNA中既存在发生甲基化的肿瘤细胞DNA，也存在不发生甲基化的正常细胞的非甲基化DNA，即存在发明所需要区分的甲基化片段和非甲基化片段。而茎环上游引物的茎环形成序列，只和非甲基化的DNA序列发生互补，因此使得非甲基化的DNA序列被茎环引物封闭而不能进行PCR扩增，这样就优先扩增了甲基化的序列。
3.本发明的PCR扩增体系和扩增程序
本发明的PCR扩增体系和扩增程序具体参见表3和表4。
表3：本发明的PCR扩增体系
| 成分 | 终浓度 |
| GoTaq缓冲液 | 1Х |
| dNTP(包括dUTP) | 0.5mM each |
| MgCl2 | 3mM |
| RASSF1A上游引物 | 0.4M |
| RASSF1A下游引物 | 0.4M |
| RASSF1A探针 | 0.15M |
表4：本发明的PCR扩增程序
实施例二.本发明的RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒的应用
以鼻咽癌分析为例，分别取经过病理确认的鼻咽癌患者和慢性鼻咽炎的鼻咽拭子，提取DNA，把DNA经过亚硫酸盐转化后，进行以上甲基化荧光定量PCR反应，比较茎环上游引物和普通上游引物的荧光定量反应曲线在特异性，和灵敏度上的反应。
如图1所示，在病理上确认为鼻咽炎患者的鼻咽拭子提取的DNA进行甲基化荧光定量PCR反应。参与反应的为普通上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线；短虚线是RASSF1A基因的反应曲线，理论上RASSF1A不参与反应，但可以发现RASSF1A基因有非特异性反应，最高信号值为0.55*106，达到了ACTB基因信号值的23.9％，若确定于信号值低于ACTB的10％为阴性，则该反应出现了RASSF1A基因甲基化检测的假阳性。
如图2所示，在病理上确认为鼻咽炎患者的鼻咽拭子提取的DNA进行的甲基化荧光定量PCR反应。参与反应的为茎环状上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线；短虚线是RASSF1A基因的反应曲线，经过茎环状引物反应后，RASSF1A的反应非特异性引物基本被消除，最高信号值只有0.18*106，为ACTB基因信号值的7.8％，若确定于信号值低于ACTB的10％为阴性，该反应为定为RASSF1A基因甲基化反应阴性，吻合临床样本的特征。
如图3所示，在病理上确认为鼻咽癌患者的鼻咽拭子提取的DNA进行的甲基化荧光定量PCR反应。参与反应的为普通上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，Ct值＝26.3；短虚线是RASSF1A基因的反应曲线，Ct值＝28.2。以ACTB基因的Ct值为参照，RASSF1A基因的Ct值-ACTB基因的Ct值＝1.9。RASSF1A基因的Ct值越小，也就是这个Ct值的差异越小，表明RASSF1A基因的甲基化扩增效率越高，若这个Ct值的差异到了负数，则说明RASSF1A的基因甲基化扩增较人的内对照基因ACTB都要高了。
如图4所示，在病理上确认为鼻咽癌患者的鼻咽拭子提取的DNA进行的甲基化荧光定量PCR反应。参与反应的为茎环状上游引物，长虚线是ACTB基因的反应曲线，Ct值＝26.5；短虚线是RASSF1A基因的反应曲线，Ct值＝23.6。以ACTB基因的Ct值为参照，RASSF1A基因的Ct值-ACTB基因的Ct值＝-3.1。表明茎环状上游引物使得RASSF1A的反应效率提高了2(1.9 +3.1)＝25＝32倍，增加了检测甲基化片段的灵敏度。
类似以上鼻咽癌和鼻咽炎的区分数据，本发明的试剂盒用于RASSF1A基因甲基化辅助诊断肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌，都能增加检测肿瘤特异性的同时，提高了检测的灵敏度。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 广州奥百阕谱生物科技有限公司
<120> RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacacaaacc aaacaaaacc gaagtcgggg ttcgttttg 39
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<212> DNA
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gaagtcgggg ttcgttttg 19
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<212> DNA
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cccgtacttc gctaacttta aacg 24
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<212> DNA
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aaacgcgaac cgaacgaaac c 21
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<212> DNA
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaccttacc ctaaacacta caac 24
Claims (6)
1.RASSF1A基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括茎环状引物，所述茎环状引物用于特异性扩增检测RASSF1A基因的转录起始区上游-1至-187bp中富含CpG岛的序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述茎环状引物的3'端序列是根据RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的位点序列进行设计，而所述茎环状引物的5'端序列不能和RASSF1A基因的转录起始区发生了甲基化的3'端甲基化序列互补杂交，但可以和非甲基化的3'端序列互补杂交。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述茎环状引物是茎环状上游引物SEQID NO:1：AAACACAAACCAAACAAAACCGAAGTCGGGGTTCGTTTTG，其中下划线处为针对亚硫酸盐转化后的基因组DNA互补的特异扩增序列，而非划线部分为茎环形成序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下下游引物和探针：
下游引物序列SEQ ID NO:3：CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG；和
检测探针序列SEQ ID NO:4：AAACGCGAACCGAACGAAACC。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒在肿瘤检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述肿瘤是鼻咽癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。
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| CN201910658196.6A CN110283913A (zh) | 2019-07-21 | 2019-07-21 | Rassf1a基因甲基化状态检测试剂盒及其应用 |
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