TW201905206A - 用於檢測肝癌的基因標誌物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的基因標誌物及其用途。本發明還涉及使用所述基因標誌物對肝癌進行檢測的方法。

Description

用於檢測肝癌的基因標誌物及其用途

本發明涉及肝癌的臨床分子篩檢(screen)的領域。具體地，本發明涉及通過高通量定序檢測(High-throughput Sequencing)肝癌基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量從而檢測肝癌是否存在的方法和試劑盒。

肝癌是最常見的全球惡性腫瘤之一。據世界衛生組織2008年統計，全球每年新發病748,300例，死亡695,900例，其中50%以上發生在中國。據統計，我國每年新發肝癌40餘萬例，約85%以上的肝癌患者曾感染B型肝炎病毒。中國現有慢性B型肝炎感染者占全球的四分之一，肝癌病例占全世界的一半，慢性肝炎感染帶來了的巨大疾病和醫療負擔。

B型肝炎病毒感染是誘發肝癌的重要因素。實際上，乙型肝炎感染或者肝硬化不僅被視為腫瘤病因學的危險因素，而且還是腫瘤發展的早期/中期(即「癌前狀態」)，其與導致(通常為良性)非侵襲性息肉的過度增殖性組織生長[隨之可發展為惡性腫瘤如肝癌細胞(Hepatocellular carcinoma，HCC)]相關。

目前對於B型肝炎患者這類肝癌的高危人群，臨床主要通過頻繁篩檢的方式，希望能對肝癌早發現、早治療。通常要求B型肝炎患者每半年做一次超音波檢查，或者檢查血液中的甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)含量，以便瞭解是否轉化為肝癌。然而，影像學容易受到操作者經驗影響，並且依賴於設備，費用昂貴，尤其是在醫療資源有限的情況下，其準確率難以保證，難以廣泛和常規應用。AFP檢測靈敏度很難超過60%對早期肝癌的靈敏度和特異性並不高，在一些非肝癌的慢性肝病患者、慢性肝炎及肝硬化患者的血清AFP也會升高。這使得多數患者一旦確診即為肝癌的晚期，失去了最佳的治療時期。

因此，尋找新的肝癌標誌物，尤其是針對B型肝炎高危人群的肝癌篩檢標誌物對於提高早期肝癌的篩檢率，實現早期干預治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。

本發明通過對B型肝炎樣本和帶有B型肝炎的肝癌樣本進行高通量定序，並對其中各基因上的5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)含量進行分析，出乎意料地發現了多個極具資訊的可用於檢測肝癌的基因標誌物。

因此，本發明的第一個方面涉及針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的基因標誌物，包括一個或多個選自以下的基因：骨塑型蛋白3 (Bone Morphogenetic Protein 3，BMP3)、具布羅莫結構域及PHD指的蛋白3 (Bromodomain and PHD Finger-Containing Protein 3，BRPF3)、頂蓋蛋白1 (Copine-1，CPNE1)、Fc受體樣蛋白3 (Fc receptor-like protein 3，FCRL3)、介白素1受體類型2 (Interleukin-1 receptor type 2，IL1R2)、N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶 4 (NDST4 N-deacetylase and N-sulfotransferase 4，NDST4)、蛋白磷酸酶2支架亞基α (protein phosphatase 2 scaffold subunit Aalpha，PPP2R1A)、絲氨酸/蘇氨酸激酶 35 (serine/threonine kinase 35，STK35)、酪氨酸酶相關蛋白1 (Tyrosinase-related protein 1，TYRP1)、尿苷-胞苷激酶 2 (Uridine-cytidine kinase 2，UCK2)和鋅指蛋白 254 (zinc finger protein 254ZNF254)。較佳的，所述基因標誌物包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個或至少十一個選自以下的基因：BPM3、BRPF3、CPNE1、FCRL3、IL1R2、NDST4、PPP2R1A、STK35、TYRP1、UCK2和ZNF254。更佳的，所述基因標誌物包括BPM3、BRPF3、CPNE1、FCRL3、IL1R2、NDST4、PPP2R1A、STK35、TYRP1、UCK2和ZNF254。

本發明還涉及上述基因標誌物用於在檢測肝癌的用途。

本發明的第二個方面涉及針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的方法，包括以下步驟： (a) 測定B型肝炎樣本和帶有B型肝炎的受試者樣本中，本發明所述的基因標誌物的5-hmC含量； (b) 用B型肝炎樣本中所述基因標誌物的5-hmC含量作為參照，將帶有B型肝炎的受試者樣本中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化； (c) 對經標準化的所述基因標誌物的5-hmC含量進行數學關聯，並獲得評分P；以及， (d) 根據所述評分P獲得檢測結果，評分P大於0.5則所述帶有B型肝炎的受試者樣本患有肝癌。

於本發明中，所述之「B型肝炎樣本」係指來自已經確診感染B型肝炎病毒且沒有罹患肝癌的患者的樣本；所述之「帶有B型肝炎的受試者樣本」係指來自已經確認感染B型肝炎病毒但不知是否患有肝癌的受試者的樣本。

於一較佳實施例中，所述正常樣本或所述受試者樣本是受試者或B型肝炎患者體液中游離的DNA片段，或來源於胞器、細胞以及組織中的完整基因組DNA。其中，所述體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或胰腺液等。

於一較佳實施例中，本發明所述基因標誌物的5-hmC含量可通過本領域技術人員已知的任何方法進行測定，例如包括但不限於，葡糖基化法、限制性內切酶法、化學標記法、與高通量定序方法聯用的沉澱法、單分子即時定序法(Single Molecule Real-time，SMRT)、氧化重亞硫酸鹽定序法(Oxidative Bisulfite Sequencing，OxBS-Seq)等。葡糖基化法的原理是採用T4噬菌體β-葡萄糖轉移酶(T4 Phage β-glucosyltransferase，T4-β-GT)，在葡萄糖供體受質尿核苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphateGlucose，UDP-Glu)存在下，將葡萄糖轉移至羥基位置, 從而生成β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同時可採用同位素標記受質進行定量。在葡糖基化法基礎上進一步發展出限制性內切酶法和化學標記法。限制性內切酶法的原理是：葡糖基化反應改變了一些限制性內切酶的酶切特性。甲基化依賴的限制性內切酶MspI和HpaII可識別同樣的序列(CCGG)，但它們對甲基化狀態的敏感性是不同：MspI識別並切割5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)和5-hmC，但不能切割5-ghmC；HpaII只切割完全未修飾的位點，胞嘧啶上的任何修飾(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻礙切割。若CpG位點含有5-hmC，則糖基化、酶解之後能檢測到條帶(band)，未糖基化對照反應中沒有條帶；同時可採用qPCR進行定量分析。另外，其他限制性內切酶也同樣存在阻礙5-ghmC酶切的情況，可應用於5-hmC檢測(如：GmrSD、MspJI、PvuRts1I或TaqI等)。化學標記法的原理是：將酶反應受質上的葡萄糖進行化學修飾轉變成UDP-6-N3-glucose，將6-N3-glucose轉移到羥甲基位置，生成N3-5ghmC。而後，通過點擊化學方法(Click Chemistry)在每個5-hmC上添加一分子生物素，結合下一代高通量DNA定序技術(Next Generation Sequencing)或單分子定序技術，可分析5-hmC在基因組DNA中的分佈情況。沉澱法是將5-hmC用特殊方式修飾後再將其特異性地從基因組DNA中捕獲下來，並進行定序分析。氧化重亞硫酸鹽定序法是首個以單鹼基解析度對5-hmC進行定量定序的方法。首先將5-hmC進行過釕酸鉀(KRuO4)氧化處理，生成5-甲醯胞嘧啶(5fC)，然後採用重亞硫酸鹽定序。在此過程中，5-hmC先氧化為5fC，而後脫氨形成尿嘧啶(Uracil，U)。通常，同時採用多種檢測方法對5-hmC進行定量檢測。

於一較佳實施例中，係利用化學標記法結合高通量定序來測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量。在一具體實施例中，測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量的方法包括以下步驟：將來自B型肝炎患者樣本和帶有B型肝炎的受試者樣本DNA片段化；將所述片段化的DNA末端修復並補齊；將末端補齊的DNA與定序接頭連接，獲得連接產物；通過標記反應對連接產物中的5-羥甲基胞嘧啶進行標記；生物放大(Biomagnification，亦稱生物富集)含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段，獲得放大產物；對放大產物進行PCR擴增，獲得定序基因庫；對定序基因庫進行高通量定序，獲得定序結果；根據定序結果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，標記反應包括：(i)利用糖基轉移酶將帶有修飾基團的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和(ii)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與帶有修飾基團的 5-羥甲基胞嘧啶反應。其中，步驟(i)和步驟(ii)可以按順序進行，也可以在一個反應中同時進行。這種標記方法減少了定序所需的樣本量，且5-羥甲基胞嘧啶上的生物素標籤使其在定序中顯示出更高的動力學信號，提高了核苷酸識別的準確性。在該實施例中，所述糖基轉移酶包括但不限於：T4噬菌體β-葡萄糖轉移酶(T4 Phage β-glucosyltransferase，T4-β-GT)、T4噬菌體α-葡萄糖轉移酶(T4 Phage α-glucosyltransferase，T4-α-GT)及其具有相同或相似活性的衍生物、類似物、或重組酶；所述帶有修飾基團的糖包括但不限於：帶有疊氮修飾的糖類(例如：6-N3-葡萄糖)或帶有其他化學修飾(例如：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯等)的糖類，其中較佳為帶有疊氮修飾的糖類；所述用於間接連接生物素和點擊化學受質的化學基團包括但不限於：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯。在該實施例中，較佳為使用固相材料來放大含有5-hmC標記的DNA片段。具體地，可以使用固相親和反應或其他特異性結合反應將含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段結合在固相材料上，而後經過多次洗滌去除未結合的DNA片段。所述固相材料包括但不限於帶有表面修飾的矽片或其他晶片，例如人工高分子小球(較佳直徑為1 nm至100 µm)、磁性小球(較佳直徑為1 nm至100 µm)、瓊脂糖小球等(較佳直徑為1 nm至100 µm)。固相放大中所用的洗滌液是本領域技術人員習知的緩衝液，包括但不限於：含有Tris-HCl、MOPS、HEPES (pH值為6.0至10.0，濃度在1 mM到1 M之間)、NaCl (0M至2M)或表面活性劑如Tween20 (0.01%至5%)的緩衝液。在該實施例中，較佳為直接在固相上進行PCR擴增從而製備定序基因庫。如有需要，在固相上進行PCR擴增後，可以回收擴增產物後進行第二輪PCR擴增來製備定序基因庫。所述第二輪PCR擴增可用本領域技術人員已知的常規方法進行。任選地，在製備定序基因庫的過程中可進一步包括一個或多個純化步驟。本領域技術人員知曉的或可商購的任何純化試劑盒均可用於本發明。純化方法包括但不限於：凝膠電泳切膠回收、矽膠膜離心柱法、磁珠法、乙醇或異丙醇沉澱法或其組合。任選地，在高通量定序之前，對定序基因庫進行品質檢查。例如，對基因庫進行片段大小分析並使用qPCR方法對基因庫的濃度進行絕對定量。通過品質檢查的定序基因庫可用於高通量定序。然後將一定數量(約1個至96個)含有不同barcode的基因庫按相同濃度混勻並根據二代定序儀的標準上機方法上機定序，獲得定序結果。本領域已知的各種二代定序平臺及其相關的試劑可用於本發明。

於另一較佳實施例中，優選將定序結果與標準人類基因組參考序列進行比對，挑選出其中比對到本發明基因標誌物上的序列，即選擇比對位元點與基因特徵(如組蛋白修飾位點、轉錄因子結合位點、基因外顯子內含子區域以及基因啟動子等)重合區域的讀段數量，以代表5-hmC在該基因上的修飾水準，從而測定5-hmC在該基因標誌物上的含量。較佳為在進行比對前，首先將定序結果清除低品質定序位點，其中衡量定序位點品質的因素包括但不限於：鹼基品質、reads品質、GC含量、重複序列和Overrepresented序列數量等。該步驟中涉及的各種比對軟體和分析方法是本領域已知的。

於另一較佳實施例中，測定基因標誌物的5-hmC含量是指測定該基因標誌物全長上的5-hmC含量或測定該基因標誌物上某一片段的5-hmC含量或其組合。

根據本發明，在測定各基因標誌物上5-hmC含量之後，用B型肝炎樣本中所述基因標誌物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣本中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化。舉例而言，B型肝炎樣本和受試者樣本中同一基因標誌物的5-hmC含量分別為X和Y，則受試者樣本中該基因標誌物的標準化5-hmC含量為Y/X。

根據本發明，在資料標準化後，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯以獲得評分，從而根據所述評分獲得檢測結果。本發明所述之「數學關聯」是指將來自生物樣本的基因標誌物的5-hmC含量與肝癌篩檢結果相關聯的任何計算方法或機器學習方法。本領域普通技術人員理解，可選擇不同的計算方法或工具用於提供本發明的數學關聯，例如彈性網路正則化、決策樹、廣義線性模型、邏輯回歸、最高分值對、神經網路、線性和二次判別式分析(LQA和QDA)、樸素貝葉斯、隨機森林和支持向量機。

於另一較佳實施例中，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯並獲得評分的具體步驟如下：將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以加權係數(Weighting Coefficient)，獲得該基因標誌物的預測因子t；將各基因標誌物的預測因子t相加，獲得總預測因子T；將總預測因子T經過Logistic轉換獲得評分P；若P大於(＞)0.5，則該受試者樣本患有肝癌；若P小於等於(≤)0.5，則該受試者樣本沒有肝癌。本文所述的加權係數是指在考慮可能影響5-hmC含量的因素(例如：受試者地域、年齡、性別、低於、吸煙史、飲酒史、家族史等)的情況下，通過本領域技術人員已知的各種高級統計分析方法獲得的係數。

本發明第三個方面另涉及利用上述基因標誌物進行肝癌檢測的試劑盒，其包括用於測定上述基因標誌物的5-hmC含量的試劑和說明書。用於測定基因標誌物的5-hmC含量的試劑是本領域技術人員已知的，例如T4噬菌體β-葡萄糖轉移酶和同位素標記(用於葡糖基化法)、限制性內切酶(用於限制性內切酶法)、糖基轉移酶和生物素(對於化學標記法)、PCR 和定序所用試劑等。

與現有技術相比，本發明中用於檢測肝癌的方法是基於基因標誌物上的5-hmC含量，因此可以使用更為廣泛的DNA樣本來源。因此，本發明中用於檢測肝癌的方法具有以下幾個優點：(1)安全無創，即使無症狀人群也對該檢測接受度高；(2) DNA來源廣泛，不存在影像學中的檢測盲區；(3)準確性高，對早期肝癌有較高的靈敏度和特異性，適合用於肝癌的早期篩檢；(4)操作方便，用戶體驗好，容易進行B型肝炎高危險群的動態監測。本發明的基因標誌物可與其他臨床指標相結合，為肝癌篩檢、治療與預後提供更準確的判斷。

下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明並能予以實施。需要說明的是，本領域的技術人員應該理解本發明的附圖及其實施例僅僅是為了說明的目的，並不能對本發明構成任何限制。在不矛盾的情況下，本發明中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。

實施例1　肝癌基因標誌物的篩選

(1) 抽提血漿DNA：

從來自20位帶有B型肝炎樣本和20位B型肝炎樣本中分別抽提10 ng血漿DNA。可利用本領域技術人員所熟知的任何適用於抽提血漿DNA的方法和試劑進行此步驟。

(2) 將血漿DNA進行末端補齊、懸A (A-tailing)並與定序接頭連接：

根據Kapa Hyper Prep Kit說明書製備含有50 µL血漿DNA、7 µL End Repair & A-Tailing Buffer和3 µL End Repair & A-Tailing Enzyme mix的反應混合液(總體積為60 µL)，在20°C溫浴30分鐘，然後於65°C溫浴30分鐘。在1.5 mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物：5 µL Nuclease free water，30 µL Ligation Buffer以及 10 µL DNA Ligase。在45 µL連接反應混合物中加入5 µL的定序接頭，混合，於20°C加熱20分鐘，然後保持於4°C。使用AmpureXP beads對反應產物進行純化，用20 µL含有Tris-HCl (10 mM，pH8.0)及EDTA (0.1 mM)的緩衝液進行沖提獲得最終的DNA連接樣本。

(3) 標記5-羥甲基胞嘧啶：

製備總體積為26 µL的標記反應混合液：疊氮修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(即UDP-N3-Glu，終濃度為50 µM)、β-GT (終濃度為1 µM)、Mg²⁺ (終濃度為25 mM)、HEPES (pH8.0，終濃度為50 mM)和來自上述步驟的20 µL DNA。將混合液在37°C溫浴1小時。取出混合液，用AmpureXP beads純化，獲得純化的20 µL DNA。

在上述純化的20 µL DNA中加入1 µL連接有生物素的二苯基環辛炔(DBCO-Biotin)，於37°C反應2小時，接著用AmpureXP beads純化，獲得純化的標記產物。

(4) 固相放大含有標記的5-羥甲基胞嘧啶的DNA片段：

首先，按以下步驟準備磁珠：取出0.5 µL C1 streptavidin beads (life technology)並加入100 µL緩衝液(5 mM Tris，pH7.5，1 M NaCl，0.02% Tween20)，渦旋混合30秒，然後用100 µL洗滌液(5 mM Tris，pH7.5，1 M NaCl，0.02% Tween20)洗滌磁珠3次，最後加入25 µL結合緩衝液(10 mM Tris，pH7.5，2M NaCl，0.04% Tween20 或其他表面活性劑)，並混合均勻。然後，在磁珠混合液中加入上述步驟獲得的純化的標記產物，並在旋轉混合器中混合15分鐘使其充分結合。

最後，用100 µL洗滌液(5 mM Tris，pH7.5，1 M NaCl，0.02% Tween20)洗滌磁珠3次，離心去掉上清液，加入23.75 µL不含核酸酶的水。

(5) PCR擴增：

向上述步驟的最終體系中加入25 µL的2X PCR master mix和1.25 µL PCR引子(總體積為50 µL)，按照下述PCR反應循環的溫度和條件進行擴增：

(6) 對定序基因庫進行質檢後進行高通量定序：

將獲得的定序基因庫通過qPCR進行濃度測定，並用Agilent2100對基因庫中DNA片段大小含量進行確定。將通過質檢的定序基因庫以相同濃度混合，用Illumina Hiseq 4000進行定序。

(7) 確定各基因標誌物的5-hmC含量和加權係數：

將獲得的定序結果進行初步質控評估，清除低品質定序位點後，將達到定序品質標準的讀段利用Bowtie2工具與人類標準基因組參考序列進行比較。然後利用FeatureCounts和HtSeq-Count工具來統計讀段數量以確定各基因標誌物的5-hmC含量。同時利用高通量定序結果，將可能影響5-hmC含量的因素作為共變數，通過邏輯回歸和彈性網路正則化獲得各基因標誌物的加權係數。結果如表1所示。

表1：本發明的肝癌基因標誌物的平均標準化5-hmC含量和加權係數

如上所述，平均標準化5-hmC含量是指帶B型肝炎的肝癌樣本中該基因標誌物的平均5-hmC含量與B型肝炎樣本中同一基因標誌物的平均5-hmC含量之比。從表1可以看出，本發明的肝癌基因標誌物的5-hmC含量在B型肝炎樣本中和帶B型肝炎的肝癌樣本中存在顯著差異，並且除BMP3、FCRL3、NDST4和TYRP1之外，其餘基因標誌物的5-hmC含量相對於正常人均顯著增加。

實施例2　肝癌基因標誌物的有效性

本實施例驗證本發明的肝癌基因標誌物用於檢測肝癌的有效性。

根據實施例1的方法測定110個樣本(60例帶B型肝炎的肝癌樣本和50例B型肝炎樣本)中本發明所述的11個肝癌基因標誌物的5-hmC含量，並確定各基因標誌物的加權係數。

將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以與其對應的加權係數，獲得該基因標誌物的預測因子t後，將各基因標誌物的預測因子t相加，獲得總預測因子T，然後將總預測因子T根據以下公式經過Logistic轉換獲得評分P：

若P＞0.5，則該受試者樣本患有肝癌；若P≤0.5，則該受試者樣本沒有肝癌。

圖1示出了根據本發明的方法區分該批樣本的結果。如圖1所示，本發明的方法能夠達到88%的靈敏度和90%的特異性。

無

圖1為用本發明的肝癌基因標誌物區分B型肝炎樣本和帶有B型肝炎的肝癌樣本的結果。病例組為肝癌樣本；控制組為肝炎樣本。

Claims (10)

1. 一種針對B型肝炎患者的肝癌檢測基因標誌物，包括一個或多個選自以下的基因：骨塑型蛋白3、具布羅莫結構域及PHD指的蛋白3、頂蓋蛋白1、Fc受體樣蛋白3、介白素1受體類型2、N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶 4、蛋白磷酸酶2支架亞基α、絲氨酸/蘇氨酸激酶 35、酪氨酸酶相關蛋白1、尿苷-胞苷激酶 2和鋅指蛋白 254。
2. 如請求項1所述之針對B型肝炎患者的肝癌檢測基因標誌物，包括骨塑型蛋白3、具布羅莫結構域及PHD指的蛋白3、頂蓋蛋白1、Fc受體樣蛋白3、介白素1受體類型2、N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶 4、蛋白磷酸酶2支架亞基α、絲氨酸/蘇氨酸激酶 35、酪氨酸酶相關蛋白1、尿苷-胞苷激酶 2和鋅指蛋白 254。
3. 一種將如請求項1或2所述的基因標誌物在針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌方法中的用途。
4. 一種針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的方法，包括以下步驟： (a) 測定B型肝炎樣本和帶有B型肝炎的受試者樣本中如請求項1或2所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量； (b) 用B型肝炎樣本中所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量作為參照，將帶有B型肝炎的受試者樣本中對應的所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量標準化； (c) 對步驟(b)經標準化的所述基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量進行數學關聯，並獲得評分P；以及， (d) 根據該評分P獲得檢測結果，該評分P大於0.5為該帶有B型肝炎的受試者樣本患有肝癌。
5. 如請求項4所述之針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的方法，其中步驟(a)是測定所述基因標誌物全長或其片段上的5-羥甲基胞嘧啶含量。
6. 如請求項4所述之針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的方法，其中所述B型肝炎樣本和帶有B型肝炎的受試者樣本是分別來自B型肝炎患者及帶有B型肝炎的受試者體液中游離的DNA片段，或來源於胞器、細胞以及組織中的完整基因組DNA。
7. 如請求項6所述之針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的方法，其中所述體液為血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或胰腺液。
8. 一種用於測定如請求項1或2所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量的試劑在製備針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的試劑盒中的用途。
9. 一種針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的試劑盒，其包括： (a) 用於測定如請求項1或2所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量的試劑；以及， (b) 說明書。
10. 如請求項9所述之針對B型肝炎患者的用於檢測肝癌的試劑盒，其中所述之基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量為所述基因標誌物全長或其片段上的5-羥甲基胞嘧啶含量。