CN104931704B - 脂肪分化相关蛋白作为hbv-hcc患者筛查标记物的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脂肪分化相关蛋白作为HBV‑HCC患者筛查标记物的新用途。本发明要求保护用于检测脂肪分化相关蛋白（ADFP）的物质在制备筛查HBV‑HCC患者的试剂盒中的应用。本发明还要求保护用于检测脂肪分化相关蛋白的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否为HBV‑HCC患者的试剂盒中的应用。本发明还保护一种筛查HBV‑HCC患者试剂盒，包括用于检测脂肪分化相关蛋白的物质。本发明还保护一种检测或辅助检测待测患者是否为HBV‑HCC患者的试剂盒，包括用于检测脂肪分化相关蛋白的物质。ADFP可用于预警性筛查HBV‑HCC患者，且结果准确，操作简便，具有较大的应用价值。

Description

脂肪分化相关蛋白作为HBV-HCC患者筛查标记物的新用途
技术领域
本发明涉及脂肪分化相关蛋白作为HBV-HCC患者筛查标记物的新用途。
背景技术
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）属于世界范围内的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和死亡率，每年约有65万人死于HCC，其中约有50%以上发生于中国，且发病率呈现逐年升高的趋势。中国90%肝细胞癌患者具有乙型肝炎病毒（HepatitisB virus，HBV）感染史。根据是否携带乙型肝炎病毒，HCC患者可分为HBV-HCC患者（全称为乙肝病毒相关肝细胞癌，即携带乙型肝炎病毒的肝细胞癌患者）和非HBV-HCC患者（全称为非乙肝病毒相关肝细胞癌，即不携带乙型肝炎病毒的肝细胞癌患者）。药物化学治疗、肝脏次全切除和肝移植是现阶段肝癌的主要治疗方法，然而术后患者的5年手术复发率为54.1%。因此，在肝癌高发人群特别是HBV患者中筛查早期肝癌患者，及时纠正治疗，对于提高HBV感染的肝细胞癌患者的生存率具有重大价值。
HCC早期诊断困难，病情进展快，预后差。目前肝炎与肝硬化等高危人群的筛查和HCC的临床诊断与病情监测等主要依赖于B超影响学检查结合血清标志物-甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平的检测。影像研究可以用于定位肝中异常组织的具体面积，但并不能区分肿瘤和肝中组织（结节）的其它异常团或块。AFP是HCC诊断和监测的重要指标，但也仅有50％-75％的原发性肝癌患者具有异常高的AFP血清水平，其对早期肝癌的检出率不高。所以，寻找敏感的肝细胞癌生物标记物，对于早期预警和诊断肝细胞癌非常重要。
脂肪分化相关蛋白（(Adipose differentiation-related protein，ADFP）是脂滴周围蛋白PAT家族成员，主要参与细胞脂类物质代谢。ADFP是脂肪球上主要的蛋白质，通过和膜绑定嗜乳脂蛋白和细胞质黄嘌呤氧化还原酶等其它两种蛋白质相互作用把脂肪球转运到细胞膜上。
发明内容
本发明的目的是提供脂肪分化相关蛋白作为HBV-HCC患者筛查标记物的新用途。
本发明要求保护用于检测脂肪分化相关蛋白（ADFP）的物质在制备筛查HBV-HCC患者的试剂盒中的应用。所述脂肪分化相关蛋白具体可如序列表的序列1所示。所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质具体可为抗脂肪分化相关蛋白的抗体，如兔抗ADFP抗体，具体可为EPITOMICS公司的兔抗ADFP抗体。
本发明还要求保护用于检测脂肪分化相关蛋白的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否为HBV-HCC患者的试剂盒中的应用。所述脂肪分化相关蛋白具体可如序列表的序列1所示。所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质具体可为抗脂肪分化相关蛋白的抗体，如兔抗ADFP抗体，具体可为EPITOMICS公司的兔抗ADFP抗体。
本发明还保护一种筛查HBV-HCC患者试剂盒，包括用于检测脂肪分化相关蛋白的物质。所述脂肪分化相关蛋白具体可如序列表的序列1所示。所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质具体可为抗脂肪分化相关蛋白的抗体，如兔抗ADFP抗体，具体可为EPITOMICS公司的兔抗ADFP抗体。
本发明还保护一种检测或辅助检测待检患者是否为HBV-HCC患者的试剂盒，包括用于检测脂肪分化相关蛋白的物质。所述脂肪分化相关蛋白具体可如序列表的序列1所示。所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质具体可为抗脂肪分化相关蛋白的抗体，如兔抗ADFP抗体，具体可为EPITOMICS公司的兔抗ADFP抗体。
本发明还保护脂肪分化相关蛋白作为HBV-HCC患者筛查的标记物的应用。所述脂肪分化相关蛋白具体可如序列表的序列1所示。
肝癌早期预警与诊断标志物必须具备特异性好、敏感性高、重现性好和患者依从性好等特点。实验证明，ADFP可作为HBV诱发的肝细胞癌的早期预警及诊断标志物。在实施例2中，对于79例HBV-HCC患者来说，癌组织中ADFP的相对水平极为显著的高于癌旁组织中ADFP的相对水平（p<0.0001），实施例2中的灵敏度为91.13%、特异性为93.67%。实施例3中，HBV-HCC患者血清中的ADFP水平极为显著的高于正常人血清中的ADFP水平。结果表明，ADFP可用于预警性筛查HBV-HCC患者，且结果准确，操作简便，具有较大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的结果。
图2为实施例2中的免疫组织化学检测结果。
图3为实施例2中的光密度值分析结果。
图4为实施例3中的western blot结果。
图5为实施例3中的光密度值分析结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
灵敏度（真阳性率）：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100%。
特异度（真阴性率）:实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度100%。
实施例1、脂肪分化相关蛋白可以作为肝细胞癌筛查的标记物的发现过程
配对样本：5例HBx不同月龄的转基因小鼠，以及同窝的野生正常小鼠。
将经过SILAC内标的小鼠肝脏作为内标蛋白，采用定量蛋白组学UPLC-LTQOrbitrap-Velos超高压液相与质谱分析HBx不同月龄的转基因小鼠肝脏组织蛋白表达变化；搜索引擎（版本4.0.4）搜索Swiss-Prot（版本20110710）数据库，选择掺入内标的分析策略。经典卡值：蛋白质丰度增加1.0倍或者蛋白质丰度减少1.0倍。通过人工检测质谱图，选择ADFP蛋白的一个定量肽段（GAVTGSVERTK），发现ADFP基因在12月龄和24月龄HBx转基因小鼠中表达显著上调，结果如图1A所示。
通过免疫组织化学，western blot等技术证实ADFP基因在12M HBx转基因轻度炎症组和24M HBx转基因癌症组中表达量显著上调。具体的实验方法如下:首先对配对样本进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转到硝酸纤维素膜上后放入封闭液（TBST中5%脱脂奶粉）中封闭l h，在1:1000稀释ADFP抗体（EPITOMICS,货号：3293-1）中4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，加入1:5000稀释羊抗兔二抗（KPL公司，074-1806）室温下孵育l h，TBST缓冲液洗膜5次，ECL试剂盒（Pierce公司）显色。以乳酸脱氢酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH作为内参，结果如图1B、1C和1D所示。
实施例2、ADFP在癌组织与癌旁组织中的水平差异
配对样本：79例HBV-HCC患者的癌组织以及配对的癌旁组织；
11例非HBV-HCC患者的癌组织以及配对的癌旁组织。
各个患者均为知情同意的志愿者。
分别取各个样本，进行免疫组织化学检测。采用一抗为EPITOMICS公司兔抗ADFP抗体，货号3293-1。免疫组织化学试剂盒采用康为世纪生物科技有限公司SP Rabbit&Mouse HRP Kit兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒，货号CW0120A。采用DAB显色反应。某个HBV-HCC患者和某个非HBV-HCC患者的结果见图2（A为放大100倍单位照片，B为放大200倍的照片）。采用Image-Pro Plus6.0软件对各个样本的癌组织和癌旁组织的照片分别进行扫描和光密度值分析，得到ADFP的相对水平，结果见图3（每个点代表1个样本）。对于HBV-HCC患者来说，癌组织中ADFP的相对水平极为显著的高于癌旁组织中ADFP的相对水平。
基于如下标准评判：对于某个待测患者而言，如果A值≥2、判断为HBV-HCC患者，如果A值＜2、判断为非HBV-HCC患者；A值=癌组织的积分光密度值（IOD）/非癌旁组织的积分光密度值（IOD）。灵敏度为91.13%，特异性为93.67%。
实施例3、ADFP在不同人群血清中的水平差异
五个人群：正常人10例、慢性丙型肝炎患者10例、乙型肝炎患者10例、HBV-HCC患者10例、药物诱导的肝急损伤患者10例，均为知情同意的志愿者。
分别采集各个志愿者的血清，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行westernblot。采用的一抗为EPITOMICS公司兔抗ADFP抗体（货号3293-1）。采用的二抗为KPL公司辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔IgG（货号474-1506）。化学发光试剂WwesternPlus-ECL是PerkinElmer公司产品（货号203-12381）。某个正常人（泳道1）、某个丙型肝炎患者（泳道2）、某个乙型肝炎患者（泳道3）、某个HBV-HCC患者（泳道4）、某个药物诱导的肝急损伤患者（泳道5）的结果见图4。
采用Bandscan5.0软件对各个样本的western blot照片分别进行扫描和光密度值分析，得到ADFP的相对水平（以正常人组的平均光密度值为1），结果见图5（各个人群的平均值）。图5中，1代表正常人、2代表慢性丙型肝炎患者、3代表乙型肝炎患者、4代表HBV-HCC患者、5代表药物诱导的肝急损伤患者。HBV-HCC患者血清中的ADFP水平极为显著的高于正常人血清中的ADFP水平。
实施例2和实施例3的结果说明，ADFP蛋白的水平可用于检测或辅助检测待测患者是否为HBV-HCC患者。

Claims (6)

1.用于检测脂肪分化相关蛋白的物质在制备筛查HBV-HCC患者的试剂盒中的应用；
对于HBV-HCC患者来说，癌组织中的脂肪分化相关蛋白水平高于癌旁组织中的脂肪分化相关蛋白水平；HBV-HCC患者血清中的脂肪分化相关蛋白水平高于正常人血清中的脂肪分化相关蛋白水平。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质为抗脂肪分化相关蛋白的抗体。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述脂肪分化相关蛋白如序列表的序列1所示。
4.用于检测脂肪分化相关蛋白的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否为HBV-HCC患者的试剂盒中的应用；
对于HBV-HCC患者来说，癌组织中的脂肪分化相关蛋白水平高于癌旁组织中的脂肪分化相关蛋白水平；HBV-HCC患者血清中的脂肪分化相关蛋白水平高于正常人血清中的脂肪分化相关蛋白水平。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述用于检测脂肪分化相关蛋白的物质为抗脂肪分化相关蛋白的抗体。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述脂肪分化相关蛋白如序列表的序列1所示。
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