CN109161590B - 整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和或COPD早期诊断的生物标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，涉及整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物的应用，具体涉及一种用于哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物及检测方法。
背景技术
支气管哮喘(哮喘)和COPD(慢性阻塞性肺疾病)是呼吸系统的常见疾病，但是到目前为止哮喘和COPD临床治疗效果不理想，仍然不能根治，给患者造成了极大的经济负担和心理负担，已经成为全球关注的公众健康问题。有调查发现成人哮喘和COPD在近30年的死亡率和发病率呈递增趋势，占全球疾病总负担1％。据估计，哮喘、COPD相关的肺疾病到2020年将成为人类死亡的第三大原因。目前研究认为哮喘、COPD为多基因遗传与环境因素相互作用导致的复杂疾病。
表观遗传学是联系环境因素与遗传易感因素之间的纽带，通过影响基因修饰和调节遗传基因的功能与特性，使机体免疫系统的发育及功能紊乱。DNA甲基化是表观遗传调控中研究得最早，也是最重要的一种修饰方式，它参与了基因－环境间复杂的相互作用，与基因调控、生物发育以及疾病的发生密切相关。DNA甲基化主要表现为DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶碱基在DNA甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合，在细胞分裂过程中传递给子细胞的表观遗传现象。DNA的甲基化主要发生于CpG岛，人类基因组中CpG岛大小为100–1000bp，富含CpG二核苷酸，常位于转录调控区附近，与56％的人类基因组编码基因相关，且处于未甲基化状态。基因启动子区DNA高甲基化意味着基因的沉默，而低甲基化意味着基因激活。已有研究证实，DNA甲基化的水平与哮喘、COPD发病密切相关，他们可以作为肿瘤、哮喘、COPD等发病早期风险预测的易感基因。另外，DNA甲基化序列是以一种高度稳定的形式存在于人类血清中，能够抵御RNA酶，蛋白酶的消化作用以及细胞的各种应激状态。
综上所述，哮喘、COPD的发病率和病死率近年来呈逐年上升趋势，临床上仍然不能根治，造成了严重的家庭经济负担和社会健康问题。但是，哮喘、COPD作为一类多基因遗传与环境因素相互作用导致的复杂疾病，到目前为止临床上尚无有效的风险预测标志物。由于血清相对比较容易获取，循环血清中的DNA甲基化生物标志物有望作为非侵入式的风险标志物用于哮喘、COPD发病的早期风险预测。
发明内容
本发明发明人前期研究发现：与正常人的气道粘膜上皮相比，哮喘、COPD患者的气道上皮有明显的损伤，脱落，气道及黏膜下组织重构等病理改变。气道上皮细胞的结构功能稳态依赖于上皮细胞粘附分子家族蛋白的表达和结构性粘附。整合素β4是粘附分子家族中的一个非常重要的成员，它组成性的表达在上皮细胞基地膜侧，在气道上皮细胞形成半桥粒结构进而将上皮细胞锚定在基底膜上，整合素β4介导的半桥粒结构是上皮细胞结构粘附的分子基础。
哮喘、COPD患者的气道粘膜均存在不同程度的上皮细胞的损伤和脱落，我们思考这种上皮细胞的损伤脱落可能是由于整合素β4基因的DNA甲基化导致的气道上皮整合素β4表达降低所引起的。因此，整合素β4基因DNA甲基化水平及其特异的DNA甲基化位点的突变可能参与并构成哮喘和COPD的发病过程。
为了获得一种哮喘、COPD的非侵入式的血清标志物用于哮喘发病风险的早期预测，我们评估了哮喘病人、COPD病人和健康对照人群中整合素β4基因DNA甲基化序列的表达水平及其特异变异的甲基化位点，进一步验证整合素β4基因DNA甲基化序列作为生物标志物区分哮喘人群、COPD人群与健康人群。
根据本发明的实验数据，表明甲基化的整合素β4基因可用于制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物。所述整合素β4基因中覆盖甲基化位点的甲基化区域如SEQ IDNO.1—SEQ ID NO.3所示。作为哮喘早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。
上述整合素β4基因DNA甲基化位点还可以用于制备哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒。
所述哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒中含有检测整合素β4基因甲基化的引物。
所述引物检测整合素β4基因的上述8个甲基化位点。
优选地，所述引物如SEQ ID NO.4—SEQ ID NO.6所示。
具体实施方式
(1)利用MethylTargetTM甲基化位点评估技术进行评估，明确整合素β4的CpG岛和其它序列信息，为确定候选研究区域提供信息，估算所需片段数和体系数。
评估标准
A.寻找基因转录起始位点上游2K到第一外显子下游1K区域内CpG岛(包含所有剪切方式)。
甲基化CpG岛评估的参数为：
Observed/Expected ratio>0.60，Percent C+Percent G>50.00％，Length>200bp。
B.片段数评估
a)常规(默认评估)：每个CpG岛预计设计一对引物进行检测，对于较长的CpG岛增加(200bp-1K，1对，1K-2K，2对，依此类推)；
b)全覆盖：按照每个CpG岛长度进行计算；
c)客户指定区间：对指定区间全片段进行引物设计。
C.体系数按照每6个片段一个体系估算。
评估结果
根据<MethylTarget标准评估方法进行操作，对照评估标准，评估结果显示整合素β4基因CpG岛片段总长度为679bp，预计全覆盖有3个片段。
(2)收集临床明确诊断为哮喘病人及对照健康对照测试者的外周血
收集病例的时间为2016年1月到2016年12月。
1、哮喘组选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的197人，年龄范围为18-60岁，其中男性患者112人，女性患者85人，平均年龄为(35.81±11.37)岁。对照组选择同一时间段在中南大学湘雅医学体检无明显异常人群137人，对照组的年龄范围为18-60岁，其中包括男性87人，女性50人，平均年龄为(37.21±10.62)岁。所有受试者均告知入组的目的，并且全部都签署了知情同意书，并对两组间的性别、年龄、身高进行比较发现无显著性差异，发现哮喘组和对照组具有可比性。为了减少实验误差，故采用统计学方法对哮喘组和对照组的性别和年龄进行匹配。
2、COPD选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的228人，年龄范围为22-65岁，其中男性患者151人，女性患者77人，平均年龄为(42.27±9.47)岁。对照组选择同一时间段在中南大学湘雅医学体检无明显异常人群169人，对照组的年龄范围为27-63岁，其中包括男性98人，女性71人，平均年龄为(41.37±8.57)岁。所有受试者均告知入组的目的，并且全部都签署了知情同意书，并对两组间的性别、年龄、身高进行比较发现无显著性差异，发现哮喘组和对照组具有可比性。为了减少实验误差，故采用统计学方法对哮喘组和对照组的性别和年龄进行匹配。
支气管哮喘的诊断标准
符合2008年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组，支气管哮喘防治指南中的支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案，具体如下：
1.反复发作喘息、气急、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、病毒性上呼吸道感染、运动等有关。
2.发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。
3.上述症状可经治疗缓解或自行缓解。
4.除外其他疾病所引起的喘息、气急、胸闷或咳嗽。
5.临床症状不典型者(如无明显喘息或体征)应至少具备以下一项试验阳性：
(1)支气管激发试验或运动试验阳性；(2)支气管舒张试验阳性(FEV1增加15％以上，且FEV1绝对值增加>200ml)；(3)PEF日内变异率或昼夜波动率≥20％。符合以上1～4条或4、5条者，可诊断为哮喘。
COPD的诊断标准
符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版),COPD防治指南中的COPD的定义、诊断、治疗和管理方案，具体如下：
1、慢阻肺的诊断应根据临床表现、危险因素接触史、体征及实验室检查等资料，综合分析确定。任何有呼吸困难、慢性咳嗽或咳痰，且有暴露于危险因素病史的患者，临床上需要考虑慢阻肺的诊断。
2、诊断慢阻肺需要进行肺功能检查，吸入支气管舒张剂后FEV1/FVC＜70％即明确存在持续的气流受限，除外其他疾病后可确诊为慢阻肺。因此，持续存在的气流受限是诊断慢阻肺的必备条件。肺功能检查是诊断慢阻肺的金标准。
3、凡具有吸烟史和(或)环境职业污染及生物燃料接触史，临床上有呼吸困难或咳嗽、咳痰病史者，均应进行肺功能检查。
4、慢阻肺患者早期轻度气流受限时可有或无临床症状。胸部X线检查有助于确定肺过度充气的程度及与其他肺部疾病鉴别。
(3)标本采集
获得哮喘患者、COPD患者及健康体检人群的同意后，签署知情同意书。在其肘部抽取外周血5ml，并取1ml全血到另一个EP管中，用于DNA的提取。
(4)测序比对
1)样品质控
a.琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染。
b.Nanodrop 2000检测基因组DNA质量：浓度≥20ng/μL，总量≥1μg(可供10个多重PCR Panel的检测)，OD260/280＝1.7～2.0，OD260/230≥1.8；
2)引物设计与单位点PCR条件优化
基于Primer5软件，针对客户提供的目标区域设计高质量的测序引物。挑选能够以经重亚硫酸盐处理的人基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物用于后续实验。本专利一共设计3组引物PCR合成3个片段产物覆盖整合素β4基因启动子区域三条引物序列及产物片段仔细如下：
第一对引物信息：
ITGB4_1F GAGAGGATTTYGTGAATTGTAGAGTAGAG(SEQ ID NO.4)
ITGB4_1R ACTACCCCRAACTAAAAACRACCTCT(SEQ ID NO.5)
第一个PCR片段
GAGAGGACCCCGTGAACTGCAGAGCAGAGCTGGGACGGGGAGTCAGGCCTCCCGACCGGGCCGGGGGCACTCCCTGGGCCCATGCCTCGCGCTGGCACGGAGAGCGGGGAGGGGGGTACGCGGCTGACGACCGTCGGGGCAGCAGCAGCAGCACAGCCCGGCGTTGGCTAGCGGCCCAGAGTCGGGGCAGGGAGGGTTCCCGTGCGGACGGGGGCTAAGAGGCCGCCTCCAGCCCGGGGCAGT(共243bp)(SEQ ID NO.1)
覆盖20个甲基化位点
第二对引物信息：
ITGB4_2F YGGGGTAGGGAGGGTTTT(SEQ ID NO.6)
ITGB4_2R AAAAACCACCRCTCTCCCTCTC(SEQ ID NO.7)
第二个PCR片段
CGGGGCAGGGAGGGTTCCCGTGCGGACGGGGGCTAAGAGGCCGCCTCCAGCCCGGGGCAGTCCGCGCACCCGAGCCTGGAGCCCGGAGCCTGGAGGGGTGGGGAGGCCCCGCGCCCAGGGCCGGACCGGAGGGAGAGGGAGAGCGGTGGCTCCT(共154bp)(SEQ ID NO.2)
覆盖13个甲基化位点
第三对引物信息
ITGB4_3F GGGAGGTTGGGTATTTGTTTT(SEQ ID NO.8)
ITGB4_3R CTACAACCCCATCTCCTAACRAC(SEQ ID NO.9)
第三个PCR片段
GGGAGGCTGGGCACCTGTCCTGCGCAGCGTGGACAGAGGGACCGGGGCCTGTCAGCCTTCAGGGAGGGGAAGGGGAGACAAAAGCCACCGGCCCTGCCCGACCAGCTCCCCTGCGCGGCTGCCCAGCTGGGGCGGGCACTCACCCTCTCCCGGCCAGCCTCGGCTGCTGCTGTGCGCCCGTCCTGGACCTACCTCGGGGCGGACTCGCTCCCTCCGCGCCTGGGCTGCCGCTAGGAGATGGGGCTGCAG(共249bp)(SEQ ID NO.3)
覆盖16个甲基化位点
多重PCR引物panel优化
将经步骤2)优化后的引物混合为多重PCR引物panel。并使用多重PCR的专利技术，以标准人基因组为模板进行扩增。基于毛细管电泳的特殊方法，我们能够判断多重体系中每对引物是否高效、特异地进行扩增，并以此调整，优化多重PCR panel中的引物组成及浓度。
3)重亚硫酸盐处理
使用EZ DNA Methylation-Gold Kit进行样本处理，将基因组DNA未被甲基化修饰的胞嘧啶C转化为胸腺嘧啶U。
4)样本目标片段多重PCR反应
使用优化后的多重PCR引物panel，以转化后的样品基因组为模板，进行多重PCR扩增。经质控后，将以同一个样品基因组DNA为模板的所有多重PCR引物panel的扩增产物混合，并确保每个位点引物扩增产物的量相当。
5)样本添加特异性标签序列
利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。反应采用11个循环数的PCR程序，尽可能降低PCR的倾向性。
6)定量后上机测序
将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的MethylTarget测序文库，文库的片段长度分布经Agilent 2100Bioanalyzer验证。文库摩尔浓度精确定量后，最终于Illumina Hiseq/Nextseq平台，以2×150bp的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据。
(5)数据统计分析
采用SPSS17.0版本的统计学软件进行数据分析，对于甲基化数据处理在ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper(Applied Biosystems Co,Ltd,USA)来分析,采用SPSS17.0版本的统计学软件进行数据分析，获得的甲基化水平均以均数±标准差(x±s)％来表示。
1、通过测序结果比对显示，哮喘病人的血清DNA与正常对照组DNA相比，存在显著差异的整合素β4基因甲基化序列位点，见表1：
表1：在哮喘组中筛选出的差异甲基化位点信息
| Target | Position | Chr | GenomePosition | meth.diff |
| ITGB4_3 | 43 | 17 | 73717793 | 0.0057347156 |
| ITGB4_3 | 89 | 17 | 73717747 | 0.0054967238 |
| ITGB4_3 | 99 | 17 | 73717737 | 0.0047258471 |
| ITGB4_3 | 114 | 17 | 73717722 | 0.0044063493 |
| ITGB4_3 | 116 | 17 | 73717720 | 0.0046543513 |
| ITGB4_3 | 133 | 17 | 73717703 | 0.0028266764 |
由此可见，本发明所提供的这6个甲基化序列位点组成的血清DNA甲基化生物标记物可以适用于哮喘的早期诊断。另外，将哮喘病人按照年龄，性别进行分层比较，显示这些临床因素均与整合素β4基因甲基化水平无关(p＞0.05)，因此这6个甲基化序列位点联合起来可以用于哮喘的发病风险预测与早期诊断。
2、通过测序结果比对显示，COPD病人的血清DNA与正常对照组DNA相比，存在显著差异的整合素β4基因甲基化序列位点，见表2：
表2：在COPD组中筛选出的差异甲基化位点信息
| Target | Position | Chr | GenomePosition | meth.diff |
| ITGB4_3 | 28 | 17 | 73717808 | 0.0050233 |
| ITGB4_3 | 43 | 17 | 73717793 | 0.0044322 |
由此可见，本发明所提供的这2个甲基化序列位点组成的血清DNA甲基化生物标记物可以适用于COPD的早期诊断。另外，将COPD按照年龄，性别进行分层比较，显示这些临床因素均与整合素β4基因甲基化水平无关(p＞0.05)，因此这2个甲基化序列位点联合起来可以用于COPD的发病风险预测与早期诊断。
6、发明的效果或特点
本发明提供了一种哮喘、COPD发病风险预测的试剂盒，包括所诉的整合素β4基因的DNA甲基化序列位点信息和引物的组合。用筛选出的甲基化位点进一步验证哮喘样本组、COPD样本组和对照正常样本血液中的阳性率，结果显示本专利中筛选出的甲基化位点在对照组与哮喘组和COPD组的甲基化程度有统计学意义(P<0.001)。
哮喘组整合素β4筛选出的甲基化位点的验证效果，见表3：
表3：筛选出的甲基化位点出现率在哮喘组和对照组的比较(x±s)(％)
COPD组整合素β4筛选出的甲基化位点的验证效果，见表4：
表4：筛选出的甲基化位点出现率在COPD组和对照组的比较(x±s)(％)
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物
的应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gagaggaccc cgtgaactgc agagcagagc tgggacgggg agtcaggcct cccgaccggg 60
ccgggggcac tccctgggcc catgcctcgc gctggcacgg agagcgggga ggggggtacg 120
cggctgacga ccgtcggggc agcagcagca gcacagcccg gcgttggcta gcggcccaga 180
gtcggggcag ggagggttcc cgtgcggacg ggggctaaga ggccgcctcc agcccggggc 240
agt 243
<210> 2
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cggggcaggg agggttcccg tgcggacggg ggctaagagg ccgcctccag cccggggcag 60
tccgcgcacc cgagcctgga gcccggagcc tggaggggtg gggaggcccc gcgcccaggg 120
ccggaccgga gggagaggga gagcggtggc tcct 154
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<211> 249
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gggaggctgg gcacctgtcc tgcgcagcgt ggacagaggg accggggcct gtcagccttc 60
agggagggga aggggagaca aaagccaccg gccctgcccg accagctccc ctgcgcggct 120
gcccagctgg ggcgggcact caccctctcc cggccagcct cggctgctgc tgtgcgcccg 180
tcctggacct acctcggggc ggactcgctc cctccgcgcc tgggctgccg ctaggagatg 240
gggctgcag 249
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gagaggattt ygtgaattgt agagtagag 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
actaccccra actaaaaacr acctct 26
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
yggggtaggg agggtttt 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
aaaaaccacc rctctccctc tc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gggaggttgg gtatttgttt t 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ctacaacccc atctcctaac rac 23
Claims (4)
1.整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断生物标志物的应用，其特征在于，所述整合素β4基因中覆盖甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID NO.1—SEQ IDNO.3所示；作为哮喘早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。
2.整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述整合素β4基因中覆盖甲基化位点的甲基化区域如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3所示；作为哮喘早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。
3.一种哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测整合素β4
基因甲基化的引物；所述引物检测整合素β4基因的8个甲基化位点；作为哮喘早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.4—SEQ ID NO.9所示。
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2017
- 2017-08-23 CN CN201710727688.7A patent/CN109161590B/zh active Active
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