WO2017073862A1 - 두경부암 예후 예측용 바이오마커 마이크로 rna - Google Patents

두경부암 예후 예측용 바이오마커 마이크로 rna Download PDF

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WO2017073862A1
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head
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neck cancer
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고윤호
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • micro RNA micro RNA, hereinafter 'miRNA'
  • 'miRNA' micro RNA
  • Cancer is a group of diseases characterized by abnormal regulation of cell growth. There are more than 100 different types of cancers, classified according to the type of cells that were initially affected, such as bladder cancer, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, endometrial cancer, kidney cancer (renal cell cancer). , Leukemia, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, thyroid cancer, skin cancer, non-Hodgkin's lymphoma, melanoma and head and neck cancer.
  • head and neck cancer is the sixth most common cancer worldwide, with a worldwide incidence of more than 640,000 cases annually.
  • Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) accounts for more than 90% of all head and neck cancers, making up the majority of head and neck cancers and occurring on the mucosal surface throughout the anatomical area. These include tumors of the nasal cavity, paranasal sinus, oral cavity, nasopharynx, oropharynx, hypopopharynx and larynx. 35% to 45% of head and neck cancer patients eventually die from head and neck squamous cell carcinoma disease. In the United States alone, head and neck squamous cell carcinoma accounts for about 4% of all malignant tumors.
  • Head and neck cancer is a disease that causes significant pathological conditions, especially with regard to the ability to speak and swallow.
  • Surgery, radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof may generally be used as a treatment option.
  • the cure rate is only 30% for late stage disease. Accordingly, the use of biomarkers for prognostic prediction for head and neck cancer is required.
  • An object of the present invention is to provide a miRNA that can be used as a biomarker for predicting prognostic head and neck cancer in order to solve the problems of the prior art as described above.
  • the present invention aims to confirm the expression level of miRNA in head and neck cancer disease, and aims to make a faster and more accurate determination of subtypes of head and neck cancer through expression of miRNA.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting prognosis according to subtypes of head and neck cancer, and to provide a kit for determining subtypes of head and neck cancer disease or prognostic head and neck cancer disease.
  • head and neck cancer specifically refers to head and neck squamous cell carcinoma
  • the head and neck squamous cell carcinoma or HNSCC term is not limited to mouth, lips, nasal cavity, sinuses, pharynx, larynx, nasopharynx.
  • Cancer of the organs, such as throat In the present invention, two phenotypes of head and neck squamous cell carcinoma are divided into stromal subtypes and tumor subtypes according to correlations with functional target gene ontology, which are different in epithelial cell differentiation. It is related to the stage.
  • miRNA is a single-stranded RNA molecule consisting of 17-25 nucleic acids and binds to 3'-UTR of mRNA to control gene expression in eukaryotes.
  • the production of miRNA is made into pre-miRNA of stem-loop structure by Drosha (RNase III type enzyme), and it is moved to cytoplasm and cleaved by dicer to make miRNA.
  • Drosha RNase III type enzyme
  • the miRNAs thus produced are involved in development, cell proliferation and death, fat metabolism, and tumorigenesis by regulating the expression of target proteins. In addition, it plays an important role in the regulation of various biological activities, including immune response in the host cell.
  • miRNA has been studied in depth as a new type of biomarker in the diagnosis of various fields such as cancer, heart disease, pregnancy, diabetes, and mental diseases.
  • 41 reliable miRNAs were selected through an integrated correlation coefficient (ICC), which regulates the development, growth and differentiation in epithelial cells, and expresses HNSCC through expression patterns in each epithelial tissue and stromal tissue. It is used to determine the subtype of.
  • ICC integrated correlation coefficient
  • the 41 miRNAs used as biomarkers for head and neck cancer are divided into groups 1 and 2, and the group 1 miRNAs are miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, and miR-409-.
  • miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p It means selected from the group consisting of, the second group miRNA miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR -141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a -3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222 , miR-532-5p, miR-24-3
  • the "biomarker” refers to a marker capable of distinguishing a normal or pathological condition or predicting a therapeutic response and measuring objectively.
  • head and neck cancer subtypes may increase or decrease the expression level of the first and second group miRNAs, thereby significantly identifying the head and neck cancer subtypes by measuring the expression level in a biological sample of a subject to be diagnosed.
  • prognosis refers to determining whether a subject to a particular disease or disorder, that is, whether the subject will later have a disease, determining the subject's responsiveness to treatment, or terrametrics (therametrics (eg, monitoring the condition of an object to provide information about treatment efficacy).
  • "measuring miRNA expression level” is a process of confirming the presence and expression level of miRNAs of disease marker genes in a biological sample to determine subtypes of head and neck cancer.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real-time reverse transcriptase (Real-time RT-PCR), and RNase protection assay (RNase). protection assays (RPA), Northern blotting or DNA chips, but are not limited thereto.
  • the agent measuring the miRNA expression level of the gene refers to a molecule that can be used for detection of a marker by confirming the expression level of miRNA whose expression is increased or decreased in a target cell, but is not limited thereto. It may be to include a primer or probe specifically binding. Based on the polynucleotide sequence of the miRNA, those skilled in the art can design primers or probes that specifically amplify specific regions of these genes.
  • a "primer” in the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs, and is a starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as.
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • PCR amplification using the sense and antisense primers of miRNA polynucleotides can be used to diagnose a disease through the generation of a desired product. PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on what is known in the art.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, natural nucleotides, substitution with one or more homologs, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • kit means a set of compositions and accessories necessary for a particular purpose.
  • the kit of the present invention is to determine the subtype of head and neck cancer disease or to determine the prognosis of head and neck cancer disease.
  • the kit of the present invention includes a primer, a probe, an antibody that selectively recognizes a peptide, or an antibody that recognizes a specific peptide whose expression is specifically changed during a head and neck cancer disease infection. But may also include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay.
  • the step of identifying the expression level of miRNA of the first group and the second group in a biological sample isolated from the target subject; And subtypes of head and neck cancer can be determined according to the expression patterns of the first and second groups;
  • the first group is miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p , miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p, any one or more selected from the group consisting of the second group miR-203a, miR-200a-5p, miR -200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93 -5p, miR-17-3
  • the subtype of head and neck cancer provides a method for determining a subtype of head and neck cancer, which is a stromal subtype or a tumor subtype, and in the above embodiment, when the first group of miRNAs is up regulated.
  • a subtype of head and neck cancer provides a method of determining a substrate subtype, and in the above embodiment, a subtype of head and neck cancer is determined to be a substrate subtype when the second group of miRNAs is down regulated.
  • the head and neck cancer subtypes are provided as a method for determining tumor subtypes.
  • the second group of miRNAs is up-regulated.
  • the subtypes of head and neck cancers are provided as a method for determining tumor subtypes, and in the above embodiment, the subsample of head and neck cancers is characterized in that the biological sample is head and neck tissue.
  • the analysis of the miRNA of the step provides a method for determining the subtypes of head and neck cancer, characterized in that the measurement by performing a microarray or RNA sequencing method, in the embodiment
  • the head and neck cancer is a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) provides a method for determining the subtypes of head and neck cancer.
  • HNSCC head and neck squamous cell carcinoma
  • a primer or probe complementary to the miRNA obtained from the subject wherein the miRNA is selected from the group consisting of the first group and the second group, the first group is miR-206 , miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR At least one selected from the group consisting of -214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p, and the second group is miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b -5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p , miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p
  • the head and neck cancer subtypes when the first group of miRNA is up-regulated, provide a kit for distinguishing the head and neck cancer subtypes that are determined to be a substrate subtype, and in the above embodiment, the second group of miRNA Provides a kit for distinguishing head and neck cancer subtypes, wherein the subtype of head and neck cancer is determined to be a substrate subtype, in which the subtype of head and neck cancer is downregulated when the first group of miRNAs is down regulated.
  • kits for discriminating head and neck cancer subtypes that are determined to be tumor subtypes and in the above embodiments, when the second group of miRNAs is upregulated, the head and neck cancer subtypes are to distinguish between head and neck cancer subtypes that are determined as tumor subtypes. It provides a kit for.
  • the step of identifying the expression level of the miRNA of the first group and the second group in the biological sample isolated from the target subject; And subtypes of head and neck cancer can be determined according to the expression patterns of the first and second groups;
  • the first group is miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p , miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p, any one or more selected from the group consisting of the second group miR-203a, miR-200a-5p, miR -200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93 -5p, miR-17-3p, miR-17
  • the subtype of head and neck cancer is determined to be a substrate subtype when the first group of miRNAs are up-regulated, and information about prognostic prediction of subtypes of the head and neck cancer is determined to have a poor prognosis compared to the tumor subtype.
  • a method for providing, in the above embodiment, head and neck cancer to determine the prognosis when one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-127, miR-409, miR-432 and miR-27b-5p is expressed A method for providing information on prognostic prediction of subtypes of the subtype, wherein the subtype of head and neck cancer is determined to be a matrix subtype when the second group of miRNAs is down-regulated, and the prognosis is poor compared to a tumor subtype.
  • a method for providing information on prognostic prediction of subtypes of head and neck cancer wherein in the above embodiments, the subtype of head and neck cancer is tumor subtypes when the first group of miRNAs is downregulated.
  • the second group of miRNAs is upregulated.
  • a method for providing information on prognostic prediction of subtypes of head and neck cancers wherein the subtypes of cervical cancer are determined to be tumor subtypes and the prognosis is better than the stromal subtypes.
  • a primer or probe complementary to the miRNA obtained from the subject wherein the miRNA is selected from the group consisting of the first group and the second group, the first group is miR-206 , miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR At least one selected from the group consisting of -214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p, and the second group is miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b -5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p , miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p
  • the head and neck cancer subtype is determined to be a substrate subtype when the first group of miRNA is up-regulated, and a prognosis kit for head and neck cancer prognosis, which is determined to have a poor prognosis compared to the tumor subtype,
  • a kit for predicting head and neck cancer prognosis for determining the prognosis when one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-127, miR-409, miR-432 and miR-27b-5p is expressed
  • the subtype of head and neck cancer is determined to be a substrate subtype when the second group of miRNA is down-regulated, and provides a kit for predicting head and neck cancer prognosis, which is determined to have a poor prognosis compared to the tumor subtype.
  • the head and neck cancer prognosis is determined that the subtype of head and neck cancer is a tumor subtype when the first group of miRNAs are down-regulated, and that the prognosis is better than the stromal subtype.
  • a kit for estimating the head and neck cancer prognosis wherein in the above embodiments, the subtype of head and neck cancer is determined to be a tumor subtype when the second group of miRNAs are upregulated, and the prognosis is better than that of the substrate subtype.
  • the first step of obtaining miRNA expression data from a sample having head and neck cancer Obtaining miRNA expression data from a head and neck cancer related database; Selecting miRNAs from the top 15% correlated in the first and second stages, the second stage being able to determine subtypes of head and neck cancers whose expression data are averaged and the mean absolute deviation is 75% or less
  • the miRNA is selected from the group consisting of the first group and the second group
  • the first group is miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p and miR-99a-5p
  • Head and neck cancer is one of the most frequent cancers with low survival rate. Especially, head and neck squamous cell carcinoma is classified as malignant tumor. Accordingly, the use of biomarkers for prognostic prediction for head and neck cancer is required.
  • subtypes of head and neck cancer can be determined more quickly and accurately through miRNA expression patterns of the present invention, and as a biomarker capable of confirming the prognosis of head and neck cancer, an effective head and neck cancer It is expected to be of great use in prognostic prediction.
  • 1 is a flow chart showing the calculation of 41 miRNAs through an integrated correlation coefficient according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the change in the expression profile of miRNA according to time-point in the normal respiratory epithelial development model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a heat map showing the expression of 41 miRNAs according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 is a relationship between 41 miRNA expression levels and respiratory primary cell signal oncogenic pathways according to an embodiment of the present invention
  • 5 is a heat map
  • FIG. 5 shows 41 miRNA and gene ontology functional categories in a heat map according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the expression of 41 miRNAs in UNC and TCGA specimens for HNSCC subtypes according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a heat map of the expression of mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the survival difference between patients with tumor subtypes and stromal subtypes according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 shows survival differences in tumor subtypes and stromal subtypes in patients with HPV infection and with no HPV infection, according to one embodiment of the invention.
  • HNSCC Human tissue samples were obtained through a protocol approved by the Institutional Review Boards of the University of North Carolina (UNC). A search cohort was obtained from the UNC. Patients included in the present invention must be histologically confirmed HNSCC, and the medical records must be thoroughly reviewed to obtain clinical and pathological data. To confirm HNSCC, we included cases of tumors located in the primary sites of the oral cavity, oropharyngeal, hypopharyngeal, and larynx, and excluded difficult cases. Fresh frozen HNSCC samples from inexperienced patients were obtained by surgery at the UNC Tissue Procurement Core Facility or UNC Hospital. Five normal tissues and five tonsil epithelium samples were miRNA profiled into normal tissues from five pediatric patients who underwent general tonsillectomy.
  • Example 1-2 RNA isolation, labeling, Microarray Hybridization And UNC HNSCC Sample analysis
  • RNA Total RNA, including small RNAs, was extracted from surgical samples using Trizol from Invitrogen. RNA amount was determined with a nanodrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologieds, Wilmington, DE) and assessed with an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Calif.). 1 ⁇ g of total RNA was labeled with FlashTaq RNA Labeling Kit from Genispher (Genisphere Inc. Hatfield, Pa.). That is, poly (A) tailing was first added to the RNA, and then a biotinylated signal molecule was attached to the target RNA sample. Biotin-labeled RNA was then mixed with the hybridization mix and hybridized at 48 ° C. overnight to the Affitrix matrix chip miRNA array. After hybridization, the array was removed from the oven, washed and scanned with a GeneChip Scanner 3000.
  • Example 2-1 miRNA expression and sequence data
  • the data with low variability (average absolute deviation or MAD ⁇ 75 percentile) in expression level was filtered and the final 304 remaining miRNAs were log2-transformed.
  • overlapping 269 miRNAs were used for analysis. It was then calculated using the unified correlation coefficient to identify miRNAs for which reproducibility was measured.
  • Example 2-2 miRNA Consensus clustering and validation of expression profiles
  • MiRNA subtypes in the search and validation cohorts were determined using the Consensus ClusterPlus R package. Matched clustering was implemented using a hierarchical clustering method with 1 minus Pearson's correlation coefficient as average linkage and distance calculation. Graph output from consensus clusterplus was used to determine the optimal number of miRNA subgroups. To determine the statistical significance of the different expressions seen in miRNA clusters, SigClust was applied using the set of 41 miRNAs described. Centroids were generated for each miRNA subtype in the UNC and TCGA cohorts by calculating the mean expression values for each miRNA of all samples in a given cohort with the appropriate subtype markers. Predicted class lables were generated by minimizing the correlation-based distance (1-Pearson correlation coefficient) for each centroid. In addition, in order to confirm the reproducibility of miRNA subtypes, robust miRNA clusters were applied to independently published data such as HNSCC, Avissar et al., Lung SCC, uterine SCC and TCGA bladder cancer data sets.
  • Group 1 miRNAs are down regulated in epithelial tissue and group 2 miRNAs are down regulated in stromal tissue (FIG. 3).
  • division designation division designation division designation division designation division designation One miR-99a-5p 15 miR-193a-5p 29 miR-93-5p 2 miR-125b-5p 16 miR-744-5p 30 miR-200c-3p 3 miR-497-5p 17 miR-532-5p 31 miR-200a-5p 4 miR-195-5p 18 miR-23b-3p 32 miR-200b-5p 5 miR-150-5p 19 miR-107 33 miR-141-3p 6 miR-140-3p 20 miR-103a-3p 34 miR-200b-3p 7 miR-145-3p 21 miR-27b-5p 35 miR-200a-3p 8 miR-127-5p 22 miR-27b-3p 36 miR-149-5p 9 miR-409-5p 23 miR-361-5p 37 miR-183-5p 10 miR-214-3p 24 miR-24-3p 38 miR-17-3p 11 miR-432-5p 25 miR-1307-3p 39 miR-92a-3p 12 miR-206 26 mi
  • samRs were used to identify differentially expressed miRNAs (DEmiRs) against tumor groups (tumor versus normal or HPV-positive versus HPV-negative HNSCC). Different expressions were evaluated using a two-class unpaired test, a random sheet and a false discovery rate (FDR) of 0.05, obtained by a random sequence. For mRNAs (DEG) differentially expressed between miRNA subtypes, samR was applied to a highly variable gene set (MAD> 75 percentile) using a median false discovery rate (FDR) of 0.05. . Fifteen miRNAs were upregulated and four miRNAs were downregulated in HPV-positive HNSCC. All of the down regulated miRNAs were group 1 miRNAs.
  • DEG mRNAs
  • FDR median false discovery rate
  • Example 2-4 miRNA And respiratory primary cell signaling Oncogenic Path primary cell signal oncogenic pathway
  • MSigDB representing genes upregulated in the RAS, SRC, CTNNB1, MYC, E2F3 and PIK3CA pathways.
  • the expression of individual genes in each gene set and the Pearson correlation coefficient between individual miRNAs were calculated.
  • the mean correlations in each gene set were then converted to Z-scores and shown in the heat map (FIG. 4). High Z-scores indicate that miRNA expression levels are associated with gene expression for HNSCC samples. Low Z-scores indicate a negative correlation between the expression of miRNAs and the expression of gene sets in HNSCC samples.
  • Example 2-5 miRNA - mRNA Connectivity and Integration Analysis
  • sequence complementarity approach is then used to exploit the direct interaction between individual miRNAs and mRNA targets using predicted objective lists identified through at least two algorithms of targetScan, miRanda, miRWalk, PICTAR4, PICTAR5, and miRDB. Used. DAVID was then used to find KEGG pathways showing the accumulation of DEGs for miRNA-based subtypes and overlapping genes between predicted target genes within each subtype. Gene ontology (GO) terms in the analyzed set of genes of interest are statistically most accumulated. In extended functional correlation analysis, a Genetic Enrichment Analysis (PAGE) approach was used with parametric methods to identify significantly changed biological subjects in the expression data set. Gene sets representing the GO category were downloaded from MSigDB.
  • PAGE Genetic Enrichment Analysis
  • the matrix was constructed for 1,022 GO categories and 41 miRNAs using Z-scores for each GO category with significant scale (FDR ⁇ 0.01) (FIGS. 3-5).
  • Hierarchical clustering was performed on the Z-score matrix, and the R package cut tree was used for groups in which 1,022 GO categories fall into seven functional categories according to correlation similarities.
  • division designation division designation One miR-99a / 100 ⁇ 125b tricistrons 7 miR 106b-25 cluster (Chr7q22.1) 2 miR195 / 497 cluster 8 miR 200 family 3 RTL1 (Chr 14q32) 9 miR-103 / 107 family 4 miR 143/145 cluster 10 miR-23b / -27b cluster (Chr 9q22.32) MET gene related 5 miR 199/214 cluster 6 miR 17-92 cluster (Chr13q31.3) 11 miR-183 / 96/182 cluster
  • the soft tissue markers are: muscle development (MYOM1 and MYF5), cell adhesion (CDH11, TGFBI, FN1 and COL5A1), EMT (MMP2, ZEB2, TWIST1, KLK5 and MET), angiogenesis (VEGFC, VEGFR, PDGFA) , CAV1 and EDN3), cell proliferation (RUNX2 and IGF1) and immunomarkers (TLR4, PDCD1, CXCL12 and CD8).
  • Cox proportional hazards model was used to assess the association between survival time and expression level of each miRNA. The p-value was then adjusted using the Banzamini and Hawkberg correction methods. To assess the independent prognostic values of each miRNA subtype, multivariate Cox proportional hazards analyses were performed.
  • miR-127, miR-209, miR-432 and miR-27b-5p shown by arrows in FIG. 4 appear to be the statistically significant prognostic predictors.
  • the expression of miR-27b-5p shows a good prognosis.
  • Example 2-7 miRNA Profiles and models of normal airway epithelial development
  • hBE human bronchial epithelial
  • normal hBE cells were grown on plates and collected at 3, 10 and 35 days.
  • RNA was extracted and a small RNA library was prepared.
  • paired t-statistics were applied to compare changes in miRNA expression at days 3 and 5.
  • the mean expression of group 1 miRNAs was initially low and increased as respiratory epithelial development progressed, whereas group 2 miRNAs were initially expressed. Showed high expression and gradually decreased (FIG. 2).

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Abstract

본 발명은 두경부암 예후 예측용 바이오마커로 사용할 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 'miRNA'라 한다)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 miRNA는 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p, miR-99a-5p, miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 발현 정도에 따른 두경부암 아형의 판정 및 예후 예측을 목적으로 한다. 본 발명은 miRNA의 발현 정도를 통하여 두경부암 아형에 대하여 신속하고 보다 정확한 예후예측 판단을 할 수 있을 것으로 예상되며, 효과적인 두경부암 예후 예측 방법에 큰 활용이 기대된다.

Description

두경부암 예후 예측용 바이오마커 마이크로 RNA
본 발명은 두경부암 예후 예측용 바이오마커로 사용할 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 'miRNA'라 한다)에 관한 것이다.
암은 세포 성장의 비정상적인 조절을 특징으로 하는 질환의 일 그룹이다. 100가지가 넘는 서로 다른 유형의 암이 존재하며, 이들은 처음에 영향을 받은 세포의 유형에 따라 분류되며, 그 예로는, 방광암, 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장암(신세포암), 백혈병, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 피부암, 비-호지킨 림프종, 흑색종 및 두경부암이 있다.
사실상, 두경부암(HNC)은 세계적으로 6번째로 가장 흔한 암으로, 전세계적으로 해마다 640,000건이 넘는 발병률을 가진다. 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)은 모든 두경부암 중 90% 이상을 차지하고 있어 두경부암 중 대부분을 이루고, 해부학적 영역 전체를 통해 점막 표면에서 발생한다. 이들은 비강, 부비동(paranasal sinus), 구강, 비인두(nasopharynx), 구강인두(oropharynx), 하인두(hypopharynx) 및 후두(larynx)의 종양을 포함한다. 두경부암 환자 중 35% 내지 45%는 결국 두경부 편평세포암종 질환으로 인해 사망한다. 미국에서만도 두경부 편평세포암종은 모든 악성 종양 중 약 4%를 차지한다. 이는 매해 두경부 편평세포암종을 새로 진단받는 100,000명 중 약 17명에 해당한다(Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008, CA Cancer J. Clin. 2008 Mar-Apr; 58(2):7196).
두경부암은 특히 말하고 삼키는 능력에 관하여 현저한 병적인 상태를 유발하는 질병이다. 수술, 방사선 요법, 화학요법 또는 이들의 조합이 치료 선택권으로서 일반적으로 이용될 수 있다. 하지만 수술, 화학요법 및 방사선의 정밀한 조합에도 불구하고, 치유율은 말기 질병의 경우 생존률이 겨우 30%에 달한다. 이에 따라, 두경부암에 대한 예후 예측용 바이오마커의 사용이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해서 두경부암 예후 예측용 바이오마커로 사용할 수 있는 miRNA를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 두경부암 질환에서의 miRNA 발현 정도의 확인을 목적으로 하며, miRNA의 발현을 통하여 두경부암의 아형에 대하여 신속하고 보다 정확한 판정을 하는 것이 목적이다.
본 발명의 다른 목적은, 두경부암의 아형에 따른 예후 예측을 목적으로 하며, 두경부암 질환의 아형 판정 또는 두경부암 질환의 예후를 확인하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 일 구체예에서 “두경부암”이란, 구체적으로 두경부 편평세포암종을 의미하며, 상기 두경부 편평세포암종 또는 HNSCC란 용어는 비제한적으로 입, 입술, 비강, 부비동, 인두, 후두, 비인두, 인후 등의 기관의 암을 포함한다. 본 발명에서는 두경부 편평세포암종의 두 가지 표현형으로서 각각의 기능적인 목적 유전자 온톨로지(functional target gene ontology)와의 상관관계에 따라 기질 아형 및 종양 아형으로 나누어지며, 이는 상피세포 분화(epithelial cell differentiation)의 상이한 단계와 관련이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "miRNA"란, 17~25개의 핵산으로 이루어진 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 새로운 물질이다. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 stem-loop 구조의 pre-miRNA로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(dicer)에 의해 절단되어 miRNA로 만들어진다. 이렇게 만들어진 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다. 또한, 숙주세포에서 면역반응을 포함한 다양한 생리활성의 조절에 중요한 역할을 담당한다. 최근 들어, miRNA는 암, 심장질환, 임신, 당뇨, 정신질환 등 다양한 분야의 진단에서 새로운 형태의 바이오마커로서 심도 깊게 연구되고 있다.
본 발명에서는 통합상관계수(ICC)를 통하여 신뢰할 수 있는 41개의 miRNA를 선출하였고, 상기 miRNA는 상피세포 내 발달, 성장 및 분화를 조절하며, 각 상피 세포 조직 및 기질 조직에서의 발현 양상을 통하여 HNSCC의 아형을 판정하는데 사용된다. 두경부암의 바이오마커로 사용되는 상기 41개의 miRNA는 제 1군 및 제 2군으로 나누어지고, 상기 제 1군 miRNA는 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 의미하며, 상기 제 2군 miRNA는 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 "바이오마커"란, 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 말한다. miRNA는 두경부암 아형에 따라 제 1군 및 제 2군 miRNA의 발현량이 증가 또는 감소되어, 진단하고자 하는 피검체의 생물학적 시료에서 발현량을 측정함으로써 두경부암 아형을 유의적으로 확인할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예후"란, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자가 질환을 차후에 가지게 될 지의 여부를 판정하는 것, 치료에 대한 검사 대상자의 반응성을 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, "miRNA 발현 수준 측정”이란, 두경부암의 아형을 판단하기 위하여 생물학적 시료에서 질병 마커 유전자들의 miRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, miRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 대상 세포에서 발현이 증가 또는 감소하는 miRNA의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. miRNA의 폴리뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서의 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(Free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(Template)와 염기쌍(Base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 miRNA 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 질병을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당 업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드, 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 두경부암 질환의 아형 판정 또는 두경부암 질환의 예후를 확인하는 것이다. 본 발명의 키트에는 두경부암 아형 판정 또는 두경부암 질환의 예후를 확인하기 위한 프라이머, 프로브, 선택적으로 펩타이드를 인지하는 항체 또는 두경부암 질환 감염시 특이적으로 발현이 변화되는 특정 펩타이드를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 구체예에서, 목적 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 하기 제 1군 및 제 2군의 miRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 제 1군 및 제 2군의 발현 양상에 따라서 두경부암의 아형을 판정할 수 있으며; 상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 두경부암의 아형은 기질 아형 또는 종양 아형인 두경부암의 아형을 판정하는 방법을 제공하고, 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절(up regulated)되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 2군 의 miRNA가 하향 조절(down regulated)되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 단계의 생물학적 시료는 두경부 조직인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 단계의 miRNA의 분석은 마이크로어레이 또는 RNA 염기서열 방법을 실시하여 측정하는 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 두경부암은 두경부 편평세포암종(HNSCC)인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 피검체로부터 수득된 miRNA에 상보적인 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트를 제공하고, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트를 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트를 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 하기 제 1군 및 제 2군의 miRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 제 1군 및 제 2군의 발현 양상에 따라서 두경부암의 아형을 판정할 수 있으며; 상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 구체예에서, miR-127, miR-409, miR-432 및 miR-27b-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA가 발현되는 경우에 예후 정도를 판단하는 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 피검체로부터 수득된 miRNA에 상보적인 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암 예후 예측용 키트를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트를 제공하고, 상기 구체예에서, miR-127, miR-409, miR-432 및 miR-27b-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA가 발현되는 경우에 예후 정도를 판단하는 두경부암 예후 예측용 키트를 제공하여, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트를 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트를 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 두경부암을 가지는 시료로부터 miRNA 발현자료를 수득하는 제 1단계; 두경부암 관련 데이터베이스로부터 miRNA 발현 데이터를 수득하는 제 2단계; 제 1단계 및 제 2단계의 상관관계가 있는 상위 15%로부터 miRNA를 선별하는 단계를 포함하고, 제 2단계는 발현 데이터가 평균화되고, 평균절대편차가 75% 이하인 두경부암의 아형을 판정할 수 있는 miRNA를 선별하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 miRNA를 선별하는 방법을 제공한다.
두경부암은 발병 빈도가 높고 생존률이 낮은 암 중 하나로서 특히, 두경부암 편평세포암종은 악성 종양으로 분류된다. 이에 따라, 두경부암에 대한 예후 예측용 바이오마커의 사용이 요구되고 있는 실정이다. 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명의 miRNA 발현 양상을 통하여 두경부암의 아형을 보다 신속하고 정확하게 판정할 수 있으며, 두경부암의 예후를 확인할 수 있는 바이오마커로서, 효과적인 두경부암 예후 예측에 큰 활용이 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 41개의 miRNA를 통합상관계수를 통하여 산출한 것을 플로우 차트로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 호흡기 상피 발달 모델에서 시간-포인트에 따른 miRNA의 발현 프로파일 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 41개의 miRNA에 대한 발현을 히트맵에 나타낸 것이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 41개의 miRNA 발현 레벨 및 호흡기 일차 세포 신호 종양원성 경로간의 관계를 히트맵에 나타낸 것이며, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 41개의 miRNA 및 유전자 온톨로지 기능적 카테고리를 히트맵에 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 HNSCC 아형에 대한 UNC 및 TCGA 표본에서의 41개 miRNA의 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 mRNA의 발현을 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 아형 및 기질 아형 환자의 생존 차이를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 HPV 감염 및 HPV가 감염되지 않은 환자에서의 종양 아형 및 기질 아형에서의 생존 차이를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 두경부종양 시료의 준비 및 분석
실시예 1-1. 두경부종양 시료의 준비
노스캐롤라이나대학교(UNC)의 기관윤리시험위원회(Institutional Review Boards)에서 승인받은 프로토콜을 통하여 환자 조직 시료를 얻었다. 탐색 코호트(discovery cohort)를 UNC에서 얻었다. 본 발명에 포함되는 환자는 조직학적으로 확인된 HNSCC이어야하며, 임상적 및 병리학적인 데이터를 얻기 위해 진료 기록을 확고히 검토해야 한다. HNSCC를 확정하기 위해서, 구강, 구강인두, 하인두 및 후두의 원발 부위(primary site)에 위치한 종양의 경우를 포함하였으며, 확정이 어려운 경우를 배제하였다. 치료경험이 없는 환자의 신선한 동결 HNSCC 시료를 UNC 조직조달 핵심시설(Tissue Procurement Core Facility) 또는 UNC 병원에서 수술을 통해 얻었다. 일반적인 편도절제술을 받은 5명의 소아환자로부터 5개의 정상 조직 및 5개의 편도 상피(tonsil epithelium) 시료를 정상조직으로 miRNA 프로파일하였다.
실시예 1-2. RNA 분리, 표지, 마이크로어레이 혼성화 및 UNC HNSCC 시료 분석
작은 RNA를 포함하는 전체 RNA를 인비트로겐사의 트리졸(TRIzol)을 이용하여 외과 시료로부터 추출하였다. RNA 양을 나노드롭 ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologieds, Wilmington, DE)로 결정하였고, 애질런트 2100 바이오어낼라이저(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)로 평가하였다. 전체 RNA 1㎍을 Genispher(Genisphere Inc. Hatfield, PA)의 플래시텍(FlashTaq) RNA 표지 키트로 표지하였다. 즉, 폴리 (A) 테일링을 RNA에 먼저 첨가한 후, 비오틴이 부착된 신호분자(biotinylated signal molecule)를 목적 RNA 시료에 결합하였다. 그 다음에 비오틴-표지 RNA를 혼성화믹스(hybridization mix)와 혼합하고 아피매트릭스 유전자칩 miRNA 어레이에 하룻밤 동안 48℃에 혼성화하였다. 혼성화 후에, 상기 어레이를 오븐에서 제거하고 세척한 후 유전자칩 스캐너 3000로 스캔하였다.
실시예 2: miRNA 발현 수준 확인
실시예 2-1. miRNA 발현 및 서열 데이터
UNC 시료의 miRNA 발현 프로파일링 수행 후, 품질관리절차를 마이크로어레이 프로브-레벨 인텐시티 파일(microarray probe-level intensity file)에 사용하였고, 아피 패키지를 CEL 파일을 처리하는데 사용하였다. 전체 중 87개의 종양 및 10개의 정상 시료를 저품질 어레이 및 복제 어레이를 제거한 후에 남겨두었다. 프로브를 825개의 miRNA에 대한 발현값을 생성하기 위하여 선택하였다. TCGA 데이터 접근에 대한 허가를 미국국립보건원(National Institutes of Health)의 NCBI dbGAP(National Center for Biotechnology Information Genotypes and Phenotypes Database)에 대한 데이터 접근 위원회에서 얻었다. 검증 코호트(validation cohort)로부터 처리된(레벨 3) miRNA 발현 데이터를 TCGA 포털에서 다운로드하였다. 1215개의 인간 miRNA에 대한 발현 데이터를 평균화하였고, 표준편차를 1 당 어레이로 정규화하였다. 발현 레벨 내 낮은 가변성(평균절대편차 또는 MAD<75퍼센타일)을 가지는 상기 데이터를 여과하였고, 최종 304개의 나머지 miRNA를 log2-변환하였다. 두 개의 상이한 플랫폼 및 코호트에서 생성되는 차등적으로 발현되는 miRNA를 기술적으로 검증하기 위해서, 중첩된 269개의 miRNA를 분석에 사용하였다. 그 다음에 재현성이 측정된 miRNA를 확인하기 위해 통합상관계수를 이용하여 산출하였다. ICC 상위 15%인 전체 41개의 miRNA를 신뢰할 수 있다고 판단하였고 추가의 분석에 사용하였다. 상기 ICC를 통하여 산출된 41개 miRNA를 플로우 차트로 나타낸 것을 도 1에 기재하였다.
실시예 2-2. miRNA 발현 프로파일의 일치된 클러스터링(Consensus clustering) 및 검증
탐색 및 검증 코호트에서 miRNA 아형을 컨센서스클러스터플러스 R 패키지를 이용하여 결정하였다. 일치된 클러스터링을 평균 연결(average linkage) 및 거리 계산으로서 1 마이너스 피어슨 상관계수(1-Pearson's correlation coefficient)를 가지는 계층적 클러스터링 방법을 이용하여 이행하였다. 컨센서스클러스터플러스에서의 그래프 출력을 사용하여 miRNA 서브그룹의 최적의 수를 확인하였다. miRNA 클러스터에서 보여지는 상이한 발현의 통계학적 유의성을 결정하기 위해, 기재된 41개의 miRNA 세트를 이용하여 SigClust를 적용하였다. 적절한 아형 표지를 가지는 주어진 코호트 내 모든 시료의 각 miRNA에 대한 평균 발현값 계산을 통하여 UNC 및 TCGA 코호트 내 각 miRNA 아형에 대한 센트로이드(centroid)를 생성하였다. 예측된 클래스 레이블(class lable)을 각 센트로이드에 대하여 상관-기반 거리(1-Pearson correlation coefficient)를 최소화함으로 생성하였다. 또한, miRNA 아형의 재현성을 확인하기 위해, 강건한(robust) miRNA 클러스터를 독립적으로 공표된 데이터인 HNSCC, Avissar 등의 데이터, lung SCC, 자궁의 SCC 및 TCGA에서의 방광암 데이터 세트에 적용하였다.
87명의 UNC 및 279명의 TCGA HNASCC 환자에서 41개의 miRNA를 사용하여 발현 양상에 따라 제 1군 및 제 2군 miRNA 클러스터로 지정하였고, 각각의 HNSCC 아형에 따른 miRNA 발현 정도를 도 4에 나타내었다. 제 1군 miRNA는 상피세포 조직에서 하향 조절되며, 제 2군 miRNA는 기질 조직에서 하향 조절된다(도 3).
도 3, 도 4 및 도 6에서 1-41에 상응하는 명칭은 하기 표 1과 같다.
구분 명칭 구분 명칭 구분 명칭
1 miR-99a-5p 15 miR-193a-5p 29 miR-93-5p
2 miR-125b-5p 16 miR-744-5p 30 miR-200c-3p
3 miR-497-5p 17 miR-532-5p 31 miR-200a-5p
4 miR-195-5p 18 miR-23b-3p 32 miR-200b-5p
5 miR-150-5p 19 miR-107 33 miR-141-3p
6 miR-140-3p 20 miR-103a-3p 34 miR-200b-3p
7 miR-145-3p 21 miR-27b-5p 35 miR-200a-3p
8 miR-127-5p 22 miR-27b-3p 36 miR-149-5p
9 miR-409-5p 23 miR-361-5p 37 miR-183-5p
10 miR-214-3p 24 miR-24-3p 38 miR-17-3p
11 miR-432-5p 25 miR-1307-3p 39 miR-92a-3p
12 miR-206 26 miR-205-5p 40 miR-17-5p
13 miR-203a 27 miR-324-3p 41 miR-20a-5p
14 miR-221-3p 28 miR-106b-3p
실시예 2-3. 차등적으로 발현되는 miRNA 및 유전자
종양군(종양 대 정상군 또는 HPV-양성 대 HPV-음성 HNSCC)에 대하여 차등적으로 발현되는 miRNAs(DEmiRs)를 확인하기 위하여 패키지 samR를 이용하였다. 상이한 발현을 양방독립 검정(two class unpaired test), 랜덤 시트 및 1,000 수열에 의하여 얻어진 역치 0.05의 오류발견률(FDR)을 이용하여 평가하였다. miRNA 아형 간 차등적으로 발현되는 mRNAs(DEG)에 대하여, 매우 가변적인 유전자 세트(MAD>75퍼센타일)에 역치 0.05의 중간오류발견률(median false discovery rate)(FDR)을 이용하여 samR을 적용하였다. HPV-양성 HNSCC에서 15개의 miRNA가 상향 조절되었고, 4개의 miRNA가 하향 조절되었다. 상기 하향 조절된 miRNA는 모두 제 1군 miRNA로 나타났다.
실시예 2-4. miRNA 및 호흡기 일차 세포 신호 종양원성 경로(airway primary cell signal oncogenic pathway)
miRNA의 발현 레벨 및 호흡기 일차 세포 신호 종양원성 경로-관련 유전자 표지(gene signature) 간의 관련성을 평가하기 위해서, 6개의 세포 신호 경로-관련 유전자-표지(BILD-HRAS, BILD-SRC, BILD-MYC, BILD_CTNNB1, BILD-E2F3, BILD-PI3K)를 RAS, SRC, CTNNB1, MYC, E2F3 및 PIK3CA 경로에서 상향 조절된 유전자를 대표하는 MSigDB로 확인하였다. 각 유전자 세트 내 개별적인 유전자의 발현 및 개별적인 miRNA 간 피어슨 상관계수를 계산하였다. 그 다음에 각 유전자 세트 내 평균 상관값을 Z-점수로 변환하였고 히트맵에 나타내었다(도 4). 높은 Z-점수는 miRNA 발현 레벨이 HNSCC 시료에 대한 유전자 발현과 연관이 있음을 나타낸다. 낮은 Z-점수는 miRNA의 발현 및 HNSCC 시료 내 유전자 세트의 발현 간 부적 상관관계(negative correlation)임을 나타낸다.
실시예 2-5. miRNA - mRNA 연결성 및 통합 분석
miRNA 및 mRNA 간 동시-발현 네트워크를 확인하기 위해서, 41개의 miRNA 및 20,500개의 유전자의 발현 프로파일을 miRNA 및 mRNA 발현 데이터가 유효한 279개의 TCGA HNSCC 시료에서 개별적으로 준비하였다. 피어슨 상관계수를 miRNA 및 유전자 간 항목의 모든 가능한 조합에 대하여 계산하였다. P-값 또한 밴자미니 및 호크버그 수정방법(correction)(q-값)으로 생성하고 조정하였다. miRNA 및 유전자쌍 간의 부적상관관계의 차단은 q-값 0.01이 되는 것으로 결정하였다. 상기 차단을 적용하여, 72,039개의 유의한 상관관계가 있는 miRNA-대-유전자 쌍을 얻었다. 그 다음에 서열 상보성 접근법(sequence complementarity approach)을 개별적인 miRNA 및 targetScan, miRanda, miRWalk, PICTAR4, PICTAR5 및 miRDB 중 최소 두 가지의 알고리즘을 통하여 확인한 예측된 목적 리스트를 이용한 mRNA 타켓 간의 직접적인 상호작용을 활용하는데 사용하였다. 그 다음에 DAVID를 miRNA-기반 아형에 대한 DEG 및 각 아형 내 예측된 목적 유전자 간 중첩되어 있는 유전자에 대한 축적(enrichment)을 보이는 KEGG 경로를 찾기 위하여 사용하였다. 목적 유전자의 분석된 세트 내 유전자 온톨로지(GO) 용어는 통계학적으로 가장 축적되어있다. 확장된 기능적 상관관계 분석 시, 발현 데이터 세트에서 유의하게 변화된 생물학적 주제를 확인하는 모수적 방법(parametric)을 이용한 유전자 집합 농축 분석(PAGE) 접근법을 사용하였다. GO 카테고리를 나타내는 유전자 세트를 MSigDB에서 다운받았다. 유의한 축척(FDR<0.01)을 가진 각 GO 카테고리에 대하여 Z-점수를 사용하여, 매트릭스를 1,022개의 GO 카테고리 및 41개의 miRNA에 대하여 구성하였다(도 3 내지 도 5). 계층적 클러스터링을 Z-점수 매트릭스에서 수행하였고, 상관성 유사성에 따라 1,022개의 GO 카테고리가 7개의 기능적 카테고리 안에 속한 군에 R 패키지 컷 트리를 사용하였다.
도 5의 miR 클러스터 이름에서 1-11에 상응하는 명칭은 하기 표 2와 같다.
구분 명칭 구분 명칭
1 miR-99a/100~125b tricistrons 7 miR 106b-25 cluster(Chr7q22.1)
2 miR195/497 cluster 8 miR 200 family
3 RTL1 (Chr 14q32) 9 miR-103/107 family
4 miR 143/145 cluster 10 miR-23b/-27b cluster(Chr 9q22.32) MET gene related
5 miR 199/214 cluster
6 miR 17-92 cluster (Chr13q31.3) 11 miR-183/96/182 cluster
DAVID를 이용하여 41개의 miRNA 및 6,701개의 유전자(955개의 DEG 및 5,266개의 부적 상관 유전자) 중에서 502개의 mRNA가 예측된 타겟이며, 41개의 miRNA에 의하여 조절되는 것으로 나타났다. 상기 501개의 mRNA의 기능적인 분석을 통하여 종양 아형은 상피 암 조직의 하향 조절된 miRNA가 주도적이며, 상피 세포 마커(ELF, CSTA 및 SOX2) 및 전사 및 단백질 전달 마커(FOX1 및 CPLX3)의 상향 조절이 축적되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 암 기질 조직의 하향 조절된 miRNA가 주도적인 기질 아형에서는 연조직(soft tissue) 마커의 상향 조절이 축적되어 있는 것을 알 수 있다(도 7). 상기 연조직 마커로는 다음과 같다: 근육발달(MYOM1 및 MYF5), 세포부착(CDH11, TGFBI, FN1 및 COL5A1), EMT(MMP2, ZEB2, TWIST1, KLK5 및 MET), 혈관형성(VEGFC, VEGFR, PDGFA, CAV1 및 EDN3), 세포증식(RUNX2 및 IGF1) 및 면역마커(TLR4, PDCD1, CXCL12 및 CD8).
실시예 2-6. 생존분석
코드화된 환자 생존 데이터를 TCGA 임상 정보 파일에서 발췌하였다. 콕스 비례위험모델(Cox proportional hazards model)을 생존시간 및 각각의 miRNA의 발현 레벨 간의 연관성을 평가하는데 사용하였다. 그 다음에 p-값을 밴자미니 및 호크버그 수정방법을 이용하여 조정하였다. 각각 miRNA의 아형의 독립적인 예후 값(independent prognostic value)을 평가하기 위해서, 다변수의 콕스 비례위험모형(multivariate Cox proportional hazards analyses)을 수행하였다.
예후 정도를 판단하는데 있어서, 도 4에 화살표로 나타나는 miR-127, miR-209, miR-432 및 miR-27b-5p가 통계적으로 주요한 예후 예측 인자인 것으로 나타난다. RAS MYC, SRC 및 CTNNB1 종양원성 경로의 활성과 높은 관련이 있는 miR-127, miR-409 및 miR-432의 높은 발현은 낮은 예후를 나타내었다. 반면에, miR-27b-5p의 발현은 좋은 예후를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 8 및 도 9에서 전체적으로 종양 아형에 비교하여 기질 아형 환자군에서 생존률이 낮음을 알 수 있다(도 8). 또한, HPV가 감염된 환자에서 HNSCC 아형에 따른 환자 간 생존율에서 유의한 차이를 보이는 반면에 HPV가 감염되지 않은 환자에서는 아형 간에 차이가 미미한 것으로 나타났다(도 9).
실시예 2-7. miRNA 프로파일 및 정상 호흡기 상피 발달(normal airway epithelial development) 모델
인간 기관지 상피(hBE) 분화 동안 miRNA 프로파일 변화의 시간-경로(time-course) 연구에 대하여, 정상 hBE 세포를 플레이트에 키우고 3일, 10일 및 35일에 수집하였다. RNA를 추출하고 작은 RNA 라이브러리를 준비하였다. miRNA 발현 프로파일링 수행 후, 3일 및 5일에서의 miRNA 발현의 변화를 비교하기 위해서 대응시료 t-통계(paired t-statistic)를 적용하였다. 정상 상피 발달 모델에서 상이한 시간-포인트에 따른 miRNA 프로파일링 변화를 평가한 결과, 제 1군 miRNA의 평균 발현은 초기에는 낮은 발현을 보이다가 호흡기 상피 발달이 진행될수록 증가한 반면에 제 2군 miRNA는 초기에는 높은 발현을 보이다 점차 감소하는 것으로 나타났다(도 2).

Claims (28)

  1. 목적 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 하기 제 1군 및 제 2군의 miRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    제 1군 및 제 2군의 발현 양상에 따라서 두경부암의 아형을 판정할 수 있으며;
    상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 두경부암의 아형은 기질 아형 또는 종양 아형인 두경부암의 아형을 판정하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절(up regulated)되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2군 의 miRNA가 하향 조절(down regulated)되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2군 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 단계의 생물학적 시료는 두경부 조직인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단계의 miRNA의 분석은 마이크로어레이 또는 RNA 염기서열 방법을 실시하여 측정하는 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 두경부암은 두경부 편평세포암종(HNSCC)인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형을 판정하는 방법.
  10. 피검체로부터 수득된 miRNA에 상보적인 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하는 두경부암 아형을 구분하기 위한 키트.
  15. 목적 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 하기 제 1군 및 제 2군의 miRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    제 1군 및 제 2군의 발현 양상에 따라서 두경부암의 아형을 판정할 수 있으며;
    상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    miR-127, miR-409, miR-432 및 miR-27b-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA가 발현되는 경우에 예후 정도를 판단하는 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  19. 제 15항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  20. 제 15항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 후가 좋다고 판단하는, 두경부암의 아형의 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법.
  21. 피검체로부터 수득된 miRNA에 상보적인 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 두경부암 예후 예측용 키트.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트.
  23. 제 22항에 있어서,
    miR-127, miR-409, miR-432 및 miR-27b-5p로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA가 발현되는 경우에 예후 정도를 판단하는 두경부암 예후 예측용 키트.
  24. 제 21항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 하향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 기질 아형으로 판정하고, 종양 아형에 비해서 예후가 좋지 않다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트.
  25. 제 21항에 있어서,
    상기 제 1군의 miRNA가 하향 조절되는 경우 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트.
  26. 제 21항에 있어서,
    상기 제 2군의 miRNA가 상향 조절되는 경우에 두경부암의 아형은 종양 아형으로 판정하고, 기질 아형에 비해서 예후가 좋다고 판단하는, 두경부암 예후 예측용 키트.
  27. 두경부암을 가지는 시료로부터 miRNA 발현자료를 수득하는 제 1단계;
    두경부암 관련 데이터베이스로부터 miRNA 발현 데이터를 수득하는 제 2단계;
    제 1단계 및 제 2단계의 상관관계가 있는 상위 15%로부터 miRNA를 선별하는 단계를 포함하고,
    제 2단계는 발현 데이터가 평균화되고, 평균절대편차가 75% 이하인 두경부암의 아형을 판정할 수 있는 miRNA를 선별하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 miRNA는 하기 제 1군 및 제 2군으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제 1군은 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 제 2군은 miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 miRNA를 선별하는 방법.
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