KR102140581B1

KR102140581B1 - 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR102140581B1
Application number: KR1020190098971A
Authority: KR
Inventors: 김정민; 박광열; 김혜련; 변준수
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2020-08-03

Abstract

본 발명은 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 뇌경색 기전에 따라 분리된 환자의 혈전을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행한 결과, 최소 두 군에서 두 배 이상의 발현 차이를 나타내는 총 10개의 microRNA를 선별하였으며, 상기 microRNA들은 뇌경색 아형 진단에 활용이 가능한 바, 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물, 뇌경색 아형 진단용 조성물, 뇌경색 아형 진단용 키트 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosing subtype of cerebral infarction}

본 발명은 뇌경색 아형을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단용 키트에 관한 것이다.

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상으로서, 크게 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke) 두 가지로 구분된다. 허혈성 뇌졸중은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직이 허혈 상태가 되어 발생하고, 출혈성 뇌졸중은 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈이 발생되어 나타나는데, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 허혈성 뇌졸중이 발생하면 혈액의 흐름이 일시적으로 끊어짐으로써 세포가 산소와 영양분을 얻을 수 없게 되는데, 이때 수술이나 혈전용해제를 사용하여 혈관 흐름을 재개시켜 주는 조치인 재관류(reperfusion)를 통해 재산소화(reoxygenation) 과정으로 신경 손상을 최소화 할 수 있다. 재관류는 세포에 산소와 영양분을 공급한다는 점에서 회복과정에 필수적이기는 하나, 이 과정에서 과도한 산소 화합물, 즉 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 생성되고 염증반응이 수반되면서 뇌경색(infarction)이 일어나는 부위가 넓어지는 것으로 알려져 있다.

뇌경색은 뇌혈관의 폐색으로 뇌조직에 혈류 공급이 부족하여 뇌신경세포가 손상되는 질환으로, 뇌경색 손상 부위는 그 기능을 되살릴 수 없어 뇌경색에 의한 장애는 영구적으로 남아서 큰 장애로 작용할 수 있다. 그러나 최근 뇌혈관 동맥 내 혈전 제거술이 비약적으로 발전하고 있어, 뇌경색 증상 발생 후 신속하게 병원을 방문하여 성공적인 혈전 제거술이 이루어진 경우, 뇌경색에 의한 후유증을 최소한으로 줄일 수 있게 되었다.

뇌경색의 재발을 예방하기 위해서는 적절한 예방 치료가 필요한데 그 전략은 뇌경색의 기전에 따라 달라진다. 대표적으로 동맥경화성 뇌혈관 폐색인 경우, 죽상동맥경화반에서 기인한 혈전이 뇌혈관을 폐색하여 발생하기 때문에 혈전의 생성을 막기 위한 항혈소판제와 함께 적극적인 지질강화전략이 필요하다. 심장기원 뇌경색인 경우에는 대부분 심방세동 또는 심장의 판막성 질환에 의해 심장에서 저류된 혈액 내 응고 체계 활성화에 따른 것으로 알려져 있으므로 심장의 구조적/기능적인 문제에 대한 치료와 함께 지속적인 항응고 치료가 필요하다. 한편, 약 10-25% 뇌경색 환자에서는 정확한 기전을 알 수 없는 경우가 있는데, 이 경우에는 아직까지 효과적인 예방 전략을 제시할 수 없는 경우로 실제 임상 현장에서는 대체로 의사의 판단에 따라 항혈소판제 또는 항응고제 선택이 이루어진다. 따라서 효과적인 이차예방전략을 수립하기 위해서는 뇌경색의 기전을 파악하는 것이 무엇보다 중요하다.

실제 임상 현장에서는 뇌경색의 기전을 파악하고자 다양한 검사를 실시하고 있다. 대표적으로 뇌혈관의 협착 또는 폐색 여부를 확인하기 위해 CT 또는 MRI를 이용하여 혈관 상태를 파악하고, 이를 바탕으로 필요 시 혈관조영술을 실시한다. 한편, 심장 초음파 검사와 24시간 심전도 모니터링 검사를 통해 심장 기원 뇌경색의 원인이 되는 심방세동이나 심장의 구조적인 문제 여부를 확인한다. 또한, 다양한 혈액 검사를 통해서 당뇨/이상지질혈증 등 혈관 위험 인자의 존재 여부, 필요에 따라서 응고체계 활성화 정도, 뇌졸중 발생 위험을 높이는 감염증 또는 자가면역성질환 동반 여부를 확인한다. 이러한 검사를 모두 수행하여 뇌경색의 기전에 대한 결론을 도출하기 위해서는 최소한 5-6일의 시간이 소요되는데 그 동안에는 정확한 뇌경색의 기전을 알 수 없어 최적화된 치료 전략을 적용하는데 한계가 있다. 또한, 환자의 전신 상태가 불안정하거나 상태가 위독한 경우에는 충분한 검사를 수행하지 못하여 뇌경색의 원인을 제대로 파악하지 못하는 한계가 있다.

따라서 이러한 한계점을 극복하고자 최근 뇌경색의 직접적인 원인이라 할 수 있는 혈전 분석을 통해 뇌경색의 기전을 파악하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 전통적인 관점에서 동맥경화성 협착에서 기인한 혈전은 콜레스테롤 입자 및 백혈구 등 염증세포를 다수 포함하리라 예상되어 그 혈전도 비교적 백색을 띌 것으로 예측되었고(white thrombus), 반면 심장기원 혈전은 심장에서 심방세동과 심방 내 혈액응고체계의 활성화에 따라 생성되므로 적혈구 및 혈액응고인자가 주요 구성성분으로 그 혈전은 붉을 것이라 예측되었다(red thrombus). 그러나 실제 혈전분석 연구결과는 종래 가설에 일치하는 결과와 정반대의 결과가 동시에 보고되고 있어 일관된 결론은 아직 요원하며 따라서 이에 따른 치료 전략을 수립하는 것은 한계가 있다.

현재까지 발표된 혈전분석 연구결과는 대부분 헤마톡실린 & 에오신(Haematoxylin & Eosin) 염색으로 혈전 분석을 시도하였는데 이를 통해서 얻을 수 있는 정보는 백혈구의 숫자 등 비교적 큰 유핵세포 존재 여부 및 비율에 국한된다. 그러나 혈전의 생성 기전에는 적혈구, 혈소판과 혈액응고인자, 그리고 그 밖의 다양한 세포와 세포 외 안자들이 복합적으로 작용하기 마련으로 그 기전에 대한 충분한 고려 없이 특정 세포 비율로서 기전을 예측하는 것은 한계가 있다. 즉, 혈소판의 주요 활성화 인자로서 응고체계의 최종 산물인 트롬빈으로 알려져 있으며, 또한 혈액응고체계 활성화를 위해서는 혈소판 세포막이 주요 요소로서 활약하기 때문에 단순히 동맥경화성 혈전은 혈소판 및 백혈구 위주, 심장기원 혈전은 적혈구 위주로 일반화하기는 어렵다. 따라서 혈전의 생성 원인을 파악하기 위해서는 단순히 주요 구성 세포의 비율이 아니라 혈전이 생성된 생화학적 환경을 총체적으로 반영하는 바이오마커 조합이 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0023260호 (2014.02.26. 공개)

본 발명의 목적은 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 뇌경색 아형 진단용 조성물, 또는 상기 조성물을 포함하는 뇌경색 아형 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f를 포함하는 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 뇌경색 아형 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뇌경색 아형 진단용 조성물을 포함하는 뇌경색 아형 진단용 키트을 제공한다.

또한, 본 발명은 뇌경색 환자에서 분리된 시료로부터 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준을 측정하는 제 1단계; 및 상기 microRNA의 발현 수준을 뇌경색 아형에 따라 비교하는 제 2단계;를 포함하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 뇌경색 기전에 따라 분리된 환자의 혈전을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행한 결과, 최소 두 군에서 두 배 이상의 발현 차이를 나타내는 총 10개의 microRNA를 선별하였으며, 상기 microRNA들은 뇌경색 아형 진단에 활용이 가능한 바, 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물, 뇌경색 아형 진단용 조성물, 뇌경색 아형 진단용 키트 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 뇌경색 기전에 따라 분리된 환자의 혈전으로 마이크로어레이 분석을 수행하여 최소 두 군에서 두 배 이상의 발현 차이를 나타내는 총 42개의 microRNA를 선별하여 히트맵을 작성한 결과이다(large artery atherosclerosis group; LA, cardioembolism with atrial fibrillation group; CE, cardioembolism with valvular heart disease group; CV).
도 2는 상기 42개의 microRNA의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 뇌경색 이후 신경학적 악화를 경험한 환자에서 miroRNA의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 뇌경색 환자의 임상 정보 및 혈액 검사 정보와 miroRNA와의 상관 관계를 확인한 결과이다.

본 발명의 발명자들은 뇌경색 기전에 따라 분리된 환자의 혈전을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행한 결과, 최소 두 군에서 두 배 이상의 발현 차이를 나타내는 총 10개의 microRNA를 선별하였고, 상기 micrRNA들의 상대적인 발현 수준을 비교하여 뇌경색 아형 진단에 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f를 포함하는 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 뇌경색 아형은 그 기전에 따라 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색, 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색 및 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색으로 구분될 수 있다.

상기 microRNA는 단백질로 전사되지 않는 대표적인 RNA(noncoding RNA)로서, 16-22 염기서열로 구성되며, 단백질로 전사되는 RNA 말단 서열에 상보적인 결합을 통해 그 사멸을 촉진시킴으로써 결과적으로 특정 단백질 발현 수준을 제어하는 것으로 알려져 있다. 원형의 머리핀 모양의 서열을 포함하고 짧은 염기서열로 구성되어 있어 세포 및 세포 외에서 안정적으로 존재할 수 있는 바, 바이오마커 및 치료 후보물질로서 각광받고 있다.

특히, 본 발명에서 뇌경색 아형 진단을 위해 사용한 혈전은, 주요 구성 성분이 적혈구 및 혈소판으로 핵이 없기 때문에 DNA 분석이 불가능하고, 일반적인 RNA는 구조적으로 불안정하여 바이오마커 발굴을 위한 일관된 연구 결과 도출이 어렵다. 이에, 유전체의 단백질 전사를 제어하는 기능을 갖춤으로써 질병의 병태생리학적 기전을 반영하고, 또한 상당히 안정적인 구조를 갖춘 microRNA의 발현 수준을 혈전에서 분석하는 것이 뇌경색 진단에 유용할 수 있다.

상기 microRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 각 microRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 miRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭하는 것일 수 있다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

상기 "프라이머"는 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 "프로브"는 표적 핵산 예를 들면, miRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 특정 miRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 뇌경색 아형 진단용 조성물을 포함하는 뇌경색 아형 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 miroRNA의 발현 수준을 측정함으로써 뇌경색 아형을 진단할 수 있다. 상기 키트에는 뇌경색 아형 진단을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트를 포함할 수 있다.

또한, 뇌경색 환자에서 분리된 시료로부터 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준을 측정하는 제 1단계; 및 상기 microRNA의 발현 수준을 뇌경색 아형에 따라 비교하는 제 2단계;를 포함하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 낮고, miR-450b-5p의 발현 수준이 높은 것일 수 있다.

상기 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 높고, miR-450b-5p의 발현 수준이 낮은 것일 수 있다.

상기 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 높고, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-450b-5p의 발현 수준이 낮은 것일 수 있다.

상기 시료는 전혈, 혈전, 혈청, 혈장, 조직 및 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 연구 집단 선정

본 실험을 수행하기 위해 기관윤리위원회의 심의를 거쳐 급성 뇌경색으로 중앙대학교병원에 내원하여 혈전제거술을 받은 환자를 연구 집단을 선정하였다. 혈전제거술을 통해서 혈전이 제거된 환자 또는 법정대리인으로부터 동의서를 받은 후 혈전을 제공받았으며, 혈전은 영하 70℃ 질소 탱크에서 보관하였다.

환자의 뇌경색 기전을 파악하기 위한 진단 검사 및 약물 투여 등의 치료 전략은 일반 뇌경색 환자와 동일하게 진행하였으며, 일반적인 검사를 통해서 도출한 정보를 바탕으로 TOAST 분류를 적용하여 뇌경색의 기전을 다음과 같이 5가지로 분류하였다: 1) 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA), 2) 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA), 3) 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV), 4) 기타 질환(Other determined; OD), 5) 원인 미상(Undetermined; UD).

즉, 환자들 중 뇌경색 기전이 뚜렷한 환자(LAA, CEA, CEV)들을 도출군(derivation group)으로, 나머지 환자들을 확인군(confirmation group)으로 나누어 microRNA 발현 분석을 수행하였다.

실시예 2: 뇌경색 환자의 혈전으로부터 microRNA 발현 분석

총 51명의 뇌경색 환자 중 뇌경색 원인이 뚜렷한 19명의 환자로부터 혈전 분석을 수행하였고, 이중 microRNA 발현이 부족한 2명을 제외하여 최종 17명의 환자(LAA 5명, CEA 6명, CEV 6명)로 도출군을 구성하였다. 영하 70℃에서 보관한 혈전을 해동한 후 miRNeasy kit(Cat. no. 217184, QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 microRNA를 수확하였고, Agilent's 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 정도관리를 수행하였다. 이를 통과한 시료들은 AFfymetrix miRNA 4.0 array chip(Thermo Fisher, Waltham MA, USA)을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 데이터 분석은 Affymetrix Expression Console Software ver 1.1(Thermo Fisher, Waltham MA, USA)을 이용하여 진행하였다.

세 군간의 통계적 차이는 z-score를 바탕으로 ANOVA test 및 post-hoc bonferroni test로 확인하였고, 최소한 두 군에서 두 배 이상의 발현 수준이 차이를 나타내며, p 값이 0.05 미만인 microRNA를 후보군으로 선별하여 도 1과 같이 히트맵을 작성하였다. 또한, 각각의 microRNA 발현 수준은 도 2에 나타내었다.

그 결과, 42개의 microRNA를 선별하였으며, 이들을 대상으로 염기서열 정보, 문헌 검색, 및 웹 데이터베이스를 이용한 예상 제어 단백질/생화학적 경로를 분석하여 가장 변화 폭이 크고 선행 연구가 존재하며 예상 후보 물질들이 밝혀진 조건으로 10개의 microRNA를 선정하였다. 선정된 microRNA들은 다음과 같다: miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p, miR-378f.

더불어, 뇌경색 기전에 따른 상대적인 microRNA의 발현 수준은 하기 표 1에 나타내었다.

miRNAs	죽상동맥경화반 기원 (LAA)	심방세동 심장기원 (CEA)	판막질환 심장기원 (CEV)
miR-210-3p	Low	High	High
miR-93-5p	Low	High	High
miR-629-5p	Low	High	Low
miR-652-3p	Low	High	Low
miR-20a-5p	Low	High	Low
miR-107	Low	High	Low
miR-532-5p	Low	High	Low
miR-450b-5p	High	Low	Low
let-7i-5p	Low	High	Low
miR-378f	Low	High	High

총 51명의 뇌경색 환자 중 뇌경색 원인이 뚜렷한 상기 19명을 제외한 나머지 32명의 환자(확인군)로부터 혈전 분석을 수행하였다. 혈전의 microRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하였다.

간략하게, Nanodrop(Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) 및 Bioanalyzer(Thermo Fisher, Waltham MA, USA)로 microRNA의 정도관리를 수행하였고, 이를 통과한 시료를 대상으로 상기 선정된 10개의 microRNA와 2개의 reference small RNA(RNU6-2, SNORD95)에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. miScript II RT Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 Reverse transcription을 수행한 후, Green PCR Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 annealing temperature는 59℃, condition temperature는 miScript SYBR 95℃ for 15min → [94℃ for 15sec → 55℃ for 30sec → 70℃ for 30sec] 40 cycle 조건으로 qRT-PCR을 수행하였다. 각각의 microRNA 프라이머 정보는 하기 표 2와 같다.

microRNA	Cat No.	Accessin No.	sequence
miR-210-3p	MS00003801	MIMAT0000267	5'CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA
miR-93-5p	MS00003346	MIMAT0000093	5'CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG
miR-629-5p	00010395	MAT0004810	UGGGUUUACGUUGGGAGAACU
miR-652-3p	00010451	MAT0003322	AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG
miR-20a-5p	00003199	MAT0000075	UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG
miR-107	00031255	MAT0000104	AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA
miR-532-5p	00004571	MAT0002888	CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU
miR-450b-5p	00033831	MAT0004909	UUUUGCAAUAUGUUCCUGAAUA
let7i-5p	00003157	MAT0000415	UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU
miR-378f	00041629	MAT0018932	ACUGGACUUGGAGCCAGAAG

이 때 각각의 microRNA 상대적인 발현 수준은 reference를 이용하여 △Ct, 즉 Ct (gene) - Ct (reference gene)으로 계산하여 비교하였다. microRNA 발현이 부족한 11명을 제외하고 데이터를 분석한 결과, 도 3과 같이, miR-93-5p가 뇌경색 이후 신경학적 악화를 경험한 환자의 혈전에서 발현 수준이 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 이는 PDCD1LG2(programmed cell death 1 ligand 2)를 비롯한 다양한 단백질 발현을 제어할 것으로 예측하였다. 한편, miR-629-5p 발현 수준은 신경학적 악화를 경험한 환자의 혈전에서 발현 수준이 감소되어 있는 것을 확인하였으며, 이는 TCF-4(transcription factor 4)를 비롯한 단백질 발현을 제어할 것으로 예측하였다.

실시예 3: microRNA를 이용한 병태생리학적 분석

선정된 microRNA의 발현 수준이 지니는 병태생리학적 의미를 파악하기 위해, 환자의 임상 정보 및 혈액 검사 정보와의 관련성을 분석하였다. 특히 나이, 혈액 검사 중 백혈구 수(WBC) 및 그 아형의 비율 즉, 전체 백혈구 중에서 단핵구(monocyte) 및 림프구(lymphocyte)의 %, 헤마토크릿, 헤모글로빈, 혈소판, C-reactive protein(CRP), Blood urea nitrogen(BUN), Creatinine(Cr), estimated glomerular filtration rate(eGFR), total cholesterol, low density lipoprotein(LDL) cholesterol, high density lipoprotein(HDL) cholesterol, triacylglycerol(TG), fasting blood glucose, hemoglobin A1c(HbA1c), Alkaline phosphatase(ALP), alanine amino-transferase, aspartate aminotransferase, gamma-glutamyl transpeptidase, B type natriuretic peptide, troponon T, D-dimer, fibrinogen, prothrombin time(PT), activated partial thromboplastin time(aPTT), thyroid stimulating hormone, thyroid hormone T3, thyroid horomone free T4, vitamin D(VitD), parathyroid horomne(PTH), C-terminal telopeptide, osteocalcin, lipoprotein A, 심장초음파검사에서 확인한 ejection fraction(EF), e/e', 좌심방(LA) 직경, 좌심방 부피 지표, 골밀도 검사에서 측정한 허리 및 대퇴관절의 Tscore 및 bone mineral density(BMD)와 상관 분석을 진행하였다. 또한, 내원 후 신경학적 진행에 따른 microRNA 차이 여부를 확인하였다.

뇌경색 환자의 임상 정보 및 혈액 검사 정보와 microRNA와의 상관 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 통계적으로 유의한 상관 관계가 확인된 항목을 괄호 안의 Pearson's correlation R 값과 함께 표시하였다.

더불어, 도 4와 같이, 뇌경색의 기전을 진단하는 microRNA는 각종 혈액검사 및 심장 초음파 검사 지표와 의미있는 상관 관계를 나타내는 것을 확인하였다.

	RNU reference	SNORD reference
miR-210-3p	TG (0.42)	WBC (-0.379), PTH (0.404), e/e’ (0.701), LA diameter (0.535)
miR-93-5p	PT (0.453)	PTH (0.476), e/e’ (0.769)
miR-629-5p	Monocyte %(-0.470), PT (0.567)	VitD (0.388)
miR-652-3p	TG (0.412), aPTT (-0.376)	TG (0.453)
miR-20a-5p	Age (0.525), e/e’ (0.529)	BUN (0.461), PTH (0.399), e/e’(0.567)
miR-107	Cr (-0.375), TG (0.465)	Neutrophil % (-0.434), Lymphocyte % (0.436), Monocyte % (0.484), HDL (0.394), e/e’ (0.482)
miR-532-5p	Monocyte % (-0.474), PT (0.437)	EF% (-0.510)
miR-450b-5p	WBC (0.403), Monocyte % (-0.485), BUN (-0.391), PT (0.580)	EF% (-0.448)
let-7i-5p	PT (0.495)	EF% (-0.410)
miR-378f	TG (0.557)	PTH (0.559), e/e’ (0.640)

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f를 포함하는 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 뇌경색 아형은 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색, 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색 및 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물.
miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 뇌경색 아형 진단용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 뇌경색 아형은 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색, 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색 및 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단용 조성물.
제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 뇌경색 아형 진단용 키트.
뇌경색 환자에서 분리된 시료로부터 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, miR-450b-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준을 측정하는 제 1단계; 및
상기 microRNA의 발현 수준을 뇌경색 아형에 따라 비교하는 제 2단계;
를 포함하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 뇌경색 아형은 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색, 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색 및 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 죽상동맥경화반 기원(Large Artery Atherosclerosis; LAA) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 낮고, miR-450b-5p의 발현 수준이 높은 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 심방세동 심장기원(Cardioembolism due to atrial fibrillation; CEA) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 높고, miR-450b-5p의 발현 수준이 낮은 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 판막질환 심장기원(Cardioembolism with valvular heart disease; CEV) 뇌경색은 miR-210-3p, miR-93-5p 및 miR-378f의 발현 수준이 높고, miR-629-5p, miR-652-3p, miR-20a-5p, miR-107, miR-532-5p, let7i-5p 및 miR-450b-5p의 발현 수준이 낮은 것을 특징으로 하는 뇌경색 아형 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.