CN115261457A

CN115261457A - 用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用

Info

Publication number: CN115261457A
Application number: CN202210661263.1A
Authority: CN
Inventors: 谭永红
Original assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Current assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Priority date: 2022-06-13
Filing date: 2022-06-13
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-06-13
Also published as: CN115261457B

Abstract

本发明公开了用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用，其中，所述标志物为Sox11基因和/或LOC400541，Sox11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，LOC400541的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明首次发现了Sox11基因和LOC400541表达情况可以作为脑梗塞的诊断、辅助诊断的标志物，其AUC可达AUC值为0.9016，检测敏感性为0.7625，特异性为0.9474，能够准确用于脑梗塞的诊断、辅助诊断，为脑梗塞的预防与治疗提供有利的数据支持。

Description

用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用

技术领域

本发明属于基因诊断领域，具体涉及用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用。

背景技术

脑梗塞(cerebral ischemic stroke)，又称脑梗死、缺血性脑卒中，具体指各种原因导致脑供血障碍，使局部脑组织发生缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死和脑软化，脑梗死发病率、致残率较高，对于人体健康具有极大的危害，防治脑梗死已成为神经科研究领域关注的重要课题之一。

相关技术中，脑梗塞的的诊断方法包括：(1)心电图、超声心动图、胸部X线摄片及监测血压等，可提供原发疾病的征象，如高血压病及不同类型的心脏疾病等，但该方法需要根据操作人员的主观经验进行判断，准确率较低；(2)头颅X线摄片，通过发现颈内动脉虹吸部有钙化影等方式进行判断，但该方法同样受制于操作人员的主观经验，且仅适用于梗死范围较广者，对于其他小范围梗死探查效果差；(3)脑血管造影，属于有创伤性检测；(4)脑CT及核磁共振检查是目前最为普遍的诊断方法，但其仅限于发生后的检测，对于发生风险和预后情况并无参考价值，而且，检测成本较高，对于患者的经济压力较大。

因此，提供一种能够用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合，并基于此开发相关诊断试剂盒对于脑梗塞的早期预测、诊断以及预后情况评估具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用，发明人首次发现了外周血中的Sox11基因和LOC400541能够有效用于指示脑梗塞的发生风险，并通过单独检测两者或两者的组合的表达量能够准确诊断出受试者的患病情况，其检测灵敏度高，特异性强，对于脑梗塞的早期诊断和风险预测提供了有效的技术支持，有效提高了临床治疗的针对性和有效性。

本发明的第一个方面，提供下述(1)～(3)中任一种基因或其蛋白作为脑梗塞诊断靶点或治疗靶点的用途；

(1)Sox11基因；

(2)LOC400541；

(3)Sox11基因和LOC400541。

人类Sox11基因是转录因子Sox(SRY-related HMG-box)超家族C亚族成员，该超基因家族由众多SRY(sex-determining region of Y chromosome)相关基因构成，编码一系列具有DNA 结合能力的蛋白质，被认为是一类重要的转录调控因子。Sox11在发育期神经系统中广泛表达，这揭示了其在神经发生，神经存活和神经突生长中的潜在作用，但现有技术中对于Sox11的功能还没有完全理解，也未有公开其在脑梗塞诊断方面的相关内容。

LOC400541是一个RNA基因，属于lncRNA类，Gene ID:400541，现有技术中对于LOC400541的功能和报道极少，也未有公开其在脑梗塞诊断方面的相关内容。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Sox11基因的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO:1所示序列；或

(2)SEQ ID NO:1所示序列经基因突变得到的同一性为98％以上的序列，所述基因突变包括碱基置换、移码、片段缺失和插入。

在本发明的一些实施方式中，(2)中所述序列为SEQ ID NO:1所示序列经基因突变得到的同一性为99％以上的序列，所述基因突变包括碱基置换、移码、片段缺失和插入。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LOC400541的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO:2所示序列；或

(2)SEQ ID NO:2所示序列经基因突变得到的同一性为98％以上的序列，所述基因突变包括碱基置换、移码、片段缺失和插入。

在本发明的一些实施方式中，(2)中所述序列为SEQ ID NO:2所示序列经基因突变得到的同一性为99％以上的序列，所述基因突变包括碱基置换、移码、片段缺失和插入。

在本发明的一些实施方式中，上述(2)中所述序列未发生功能性改变。

在本发明中，所述蛋白为该基因(DNA)经过翻译得到的蛋白，对于RNA，其具体指该RNA经逆转录为DNA后翻译得到的蛋白。

本发明的第二个方面，提供检测下述(1)～(3)中任一种基因的表达情况的试剂在制备脑梗塞诊断或辅助诊断产品中的应用；

(1)Sox11基因；

(2)LOC400541；

(3)Sox11基因和LOC400541。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品具有如下(1)～(2)任一种功能：

(1)脑梗塞诊断、辅助诊断；

(2)脑梗塞易感人群筛选。

在本发明的一些实施方式中，所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品包括检测试剂、检测试剂盒、检测试纸条、基因芯片。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择其他的产品形式用于实现脑梗塞诊断或辅助诊断。

在本发明的一些实施方式中，所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品的使用方法为：

使用所述脑梗塞诊断产品检测样品中的Sox11基因和/或LOC400541表达量，根据样品 2^-△△Ct值判断受试者患病风险或预后情况。

在本发明的一些实施方式中，检测方法包括但不限于PCR扩增、Northern blot或基于蛋白表达情况分析，如采用Western blot、ELISA、HPLC等。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择其他的检测方法用于检测样品中的 Sox11基因和/或LOC400541表达量，包括但不限于上述方法

在本发明的一些实施方式中，所述检测方法为PCR扩增。

在本发明的一些实施方式中，PCR扩增体系为：

在本发明的一些实施方式中，PCR扩增体系为：

组分	25μL体系
		2×TaqMan PCR Mix	12.5μL
Sox11-F(20μM)	0.5μL
		Sox11-R(20μM)	0.5μL
Sox11-P(0.2μM)	1μL
		LOC400541-F(20μM)	0.5μL
LOC400541-R(20μM)	0.5μL
		LOC400541-P(10μM)	1μL
GAPDH-F(20μM)	0.5μL
		GAPDH-R(20μM)	0.5μL
GAPDH-P(0.2μM)	1μL
		ROX Reference Dye II	0.25μL
cDNA模板(1:10稀释)	5μL
		ddH<sub>2</sub>O	1.25μL

其中，GAPDH作为内参基因，其中，内参基因GAPDH的特异性引物组和探针为：

上游引物(GAPDH-F)：5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’(SEQ ID NO：9)；

下游引物(GAPDH-R)：5’-GGTGCAGGAGGCATTGCT-3’(SEQ ID NO：10)；

探针(GAPDH-P)：5’-ACAGCCTCAAGATC-3’(SEQ ID NO：11)；

在本发明的一些实施方式中，反应程序为：反应程序为：95℃预变性5-10min；95℃变性15～30s，56～64℃退火15～30s，72℃延伸40s，40个循环。

在本发明的一些实施方式中，95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸40s，40个循环。

在72℃时收集荧光信号，绘制溶解曲线(温度范围60℃-95℃)。

在本发明的一些实施方式中，受试者患病风险及患病情况判断标准为：

以正常健康人标准样品作为对照，若检测样品2^-△△Ct值大于阈值，则受试者有脑梗塞患病风险或患有脑梗塞；

若否，则不具有脑梗塞患病风险；

在本发明的一些实施方式中，根据样本实际情况，所述阈值包括1或1以上的数值。

在本发明的一些实施方式中，所述阈值为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；或1.2…1.4…1.6…1.8…2.0…2.2…2.4…10.0……

在本发明的一些实施方式中，所述阈值为1。

发明人发现，对比健康对照受试者外周血样本，脑梗塞患者外周血样本中的Sox11基因和LOC400541的表达量均存在显著差异，因此，通过定量对比健康对照受试者和样品的既可以有效的对脑梗塞的患病风险进行有效且准确的预估。

本发明的第三个方面，提供一种脑梗塞诊断试剂，所述试剂中含有Sox11基因和/或 LOC400541的特异性引物组和探针；

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择其他的Sox11基因和/或LOC400541 的检测试剂用于定性或定量检测Sox11基因和/或LOC400541。

在本发明的一些实施方式中，所述Sox11基因的荧光定量PCR引物及探针序列具体为：

上游引物(Sox11-F)：5’-GGAGCCTACATTTTCAACCACAAT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物(Sox11-R)：5’-AAAACGAAGGTATGGTAGGAATCAA-3’(SEQ ID NO：4)；

探针(Sox11-P)：5’-TTTATGAAACTGAGCTCTCTT-3’(SEQ ID NO：5)。

本发明中的Sox11基因特异性引物组和探针是基于Sox11基因设计得到的，能够有效用于Sox11基因的识别和定量检测。

在本发明的一些实施方式中，所述Sox11探针序列上连接有报告基团，在本实施例中，荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，在不影响检测精度的条件下，合理选择其他的报告基团，包括但不限于上述FAM、BHQ1。

在本发明的一些实施方式中，所述LOC400541的荧光定量PCR引物及探针序列具体为：

上游引物(LOC400541-F)：5’-GCGTCGCGACCAATGAA-3’(SEQ ID NO：6)；

下游引物(LOC400541-R)：5’-GGATGACTCGGCGTTTCCT-3’(SEQ ID NO：7)；

探针(LOC400541-P)：5’-CCATGCCCTAAGAAA-3’(SEQ ID NO：8)。

本发明中的LOC400541特异性引物组和探针是基于LOC400541序列设计得到的，能够有效用于LOC400541的识别和定量检测。

在本发明的一些实施方式中，所述LOC400541探针序列上连接有报告基团，在本实施例中，荧光基团为VIC，猝灭基团为BHQ1。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，在不影响检测精度的条件下，合理选择其他的报告基团，包括但不限于上述VIC、BHQ1。

本发明的第四个方面，提供一种脑梗塞检测试剂盒，所述脑梗塞检测试剂盒中含有本发明第三个方面所述诊断试剂和对照试剂。

本发明的一些实施方式中，所述对照试剂包括阴性对照试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照试剂为正常健康人标准样品。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次发现了Sox11基因和/或LOC400541表达情况可以作为脑梗塞的诊断、辅助诊断的标志物，其在健康人和脑梗塞患者的外周血样品中表达差异显著，两者组合作为标志物时判定效果更加显著，AUC可达0.9016，敏感性为0.7625，特异性为0.9474。

2.本发明提供了一种可用于检测脑梗塞发生风险情况、以及预后情况的检测产品，其检测效果准确，能够显著区分不同的患病风险，并可有效筛查易感人群，可有效用于脑梗塞的早期预测与诊断，为脑梗塞的预防与治疗提供有利的数据支持。

附图说明

图1为健康对照受试者外周血(Normal)和脑梗塞患者外周血(Stroke)中Sox11基因的表达量对比图；

图2为健康对照受试者外周血(Normal)和脑梗塞患者外周血(Stroke)中LOC400541 的表达量对比图；

图3为Sox11基因单独作为脑梗塞的诊断标志物的ROC曲线图；

图4为LOC400541单独作为脑梗塞的诊断标志物的ROC曲线图；

图5为Sox11基因和LOC400541组合使用作为脑梗塞的诊断标志物的ROC曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

样本纳入准则

在本实施例中，脑梗塞队列的招募严格按照纳入准则进行。其中，脑梗塞的定义为因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。脑梗塞的表现为：有脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等。

在本实施例中，脑梗塞队列是于2020年03月至2021年08月在广州市妇女儿童医疗中心按照上述纳入准则招募得到的，共招募40名脑梗塞患者和19名年龄相匹配的健康对照受试者。所有标本采集均获得受试者家属签署的知情同意，并得到广州市妇女儿童医疗中心审查委员会批准。

样品处理

分别从上述招募的健康对照者和脑梗塞(Stroke)患者中抽取外周静脉血，并用于提取 RNA进行定量分析。

其中，定量分析方法采用荧光定量PCR。

结果发现，以健康对照者作为对照，SRY-box transcription factor 11(Sox11)基因和长链非编码RNA(lncRNA)LOC400541基因特异性高表达于脑梗塞患者中，对Sox11基因和 LOC400541基因进行测序分析，

其中，Sox11基因编码区核苷酸序列为：

5’-ATGGTGCAGCAGGCGGAGAGCTTGGAAGCGGAGAGCAACCTGCCCCGGGAGGC GCTGGACACGGAGGAGGGCGAATTCATGGCTTGCAGCCCGGTGGCCCTGGACGAGAGC GACCCAGACTGGTGCAAGACGGCGTCGGGCCACATCAAGCGGCCGATGAACGCGTTCA TGGTATGGTCCAAGATCGAACGCAGGAAGATCATGGAGCAGTCTCCGGACATGCACAAC GCCGAGATCTCCAAGAGGCTGGGCAAGCGCTGGAAAATGCTGAAGGACAGCGAGAAG ATCCCGTTCATCCGGGAGGCGGAGCGGCTGCGGCTCAAGCACATGGCCGACTACCCCGA CTACAAGTACCGGCCCCGGAAAAAGCCCAAAATGGACCCCTCGGCCAAGCCCAGCGCC AGCCAGAGCCCAGAGAAGAGCGCGGCCGGCGGCGGCGGCGGGAGCGCGGGCGGAGG CGCGGGCGGTGCCAAGACCTCCAAGGGCTCCAGCAAGAAATGCGGCAAGCTCAAGGC CCCCGCGGCCGCGGGCGCCAAGGCGGGCGCGGGCAAGGCGGCCCAGTCCGGGGACTA CGGGGGCGCGGGCGACGACTACGTGCTGGGCAGCCTGCGCGTGAGCGGCTCGGGCGGC GGCGGCGCGGGCAAGACGGTCAAGTGCGTGTTTCTGGATGAGGACGACGACGACGAC GACGACGACGACGAGCTGCAGCTGCAGATCAAACAGGAGCCGGACGAGGAGGACGAG GAACCACCGCACCAGCAGCTCCTGCAGCCGCCGGGGCAGCAGCCGTCGCAGCTGCTGA GACGCTACAACGTCGCCAAAGTGCCCGCCAGCCCTACGCTGAGCAGCTCGGCGGAGTC CCCCGAGGGAGCGAGCCTCTACGACGAGGTGCGGGCCGGCGCGACCTCGGGCGCCGG GGGCGGCAGCCGCCTCTACTACAGCTTCAAGAACATCACCAAGCAGCACCCGCCGCCG CTCGCGCAGCCCGCGCTGTCGCCCGCGTCCTCGCGCTCGGTGTCCACCTCCTCGTCCAG CAGCAGCGGCAGCAGCAGCGGCAGCAGCGGCGAGGACGCCGACGACCTGATGTTCGA CCTGAGCTTGAATTTCTCTCAAAGCGCGCACAGCGCCAGCGAGCAGCAGCTGGGGGGC GGCGCGGCGGCCGGGAACCTGTCCCTGTCGCTGGTGGATAAGGATTTGGATTCGTTCAG CGAGGGCAGCCTGGGCTCCCACTTCGAGTTCCCCGACTACTGCACGCCGGAGCTGAGC GAGATGATCGCGGGGGACTGGCTGGAGGCGAACTTCTCCGACCTGGTGTTCACATATTG A-3’(SEQID NO：1)。

LOC400541基因核苷酸序列为：

5’-AAAAACAGGTGGCGTAGCAGGTGGGCAGCACGTTGCCATGATGTGCCGTGGCCC GGCCGTGGCTGGCGTGATCCCACCAGAGTGAGCTGGAGCAGATCTGCACCATGGGCCA AGTTTCTCAGAAAATACATAGCTTCCTGTGGGCTGCAGCCTAATGCCCACGTTCCTCTCG GGGAAGACCAAAGGTTATTCAACCAGGGCAAAGGACAGCCTTGCAAACCAACTACGTC CTCCTTCTGGAGTTTGTGTGACCCCTGGCCCCTGAGCCCACACCCTCTCGGAGCGGGGTTCCAACTCCGTGGAAGCTCTGCTGAGATGCAGATGGCTTTGGAGGGGTGCAAATGCTAC GTGTTTGGAAGAGCAGAGGAGGCCTGCAGCTCTCAGTCACCTGTCTCCATCTTCGGAGG AGGGCGTCGCGACCAATGAAATCCATGCCCTAAGAAAGAAAGGAAACGCCGAGTCATC CAGCGACACTCAGACCCTCGGCACAGAGAGCAGCACCGTGGGAAGGGTCCCCTGGTGT CACTGCAATGGGGCACAGCCGCCTCCTCCCACAACCCTGCCAGCTTTT-3’(SEQ ID NO： 2)。

其中，Sox11基因的荧光定量PCR引物及探针序列具体为：

上游引物(Sox11-F)：5’-GGAGCCTACATTTTCAACCACAAT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物(Sox11-R)：5’-AAAACGAAGGTATGGTAGGAATCAA-3’(SEQ ID NO：4)；

探针(Sox11-P)：5’-TTTATGAAACTGAGCTCTCTT-3’(SEQ ID NO：5)。

LOC400541的荧光定量PCR引物及探针序列具体为：

上游引物(LOC400541-F)：5’-GCGTCGCGACCAATGAA-3’(SEQ ID NO：6)；

下游引物(LOC400541-R)：5’-GGATGACTCGGCGTTTCCT-3’(SEQ ID NO：7)；

探针(LOC400541-P)：5’-CCATGCCCTAAGAAA-3’(SEQ ID NO：8)。

具体检测方法为：

1.外周静脉血中RNA的提取：

抽取受试者外周静脉抗凝全血(使用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝血剂)或者去纤维蛋白血液(采用本领域常规方法即可)3-10mL，放入预先盛有等体积的单核细胞分离液(来自Solarbio人外周血单核细胞分离液试剂盒)的离心管中。室温下，水平转子500～800g离心20～30min。离心后，溶液会出现明显的分层，小心吸取第二层白色单核细胞层到另一无菌的15mL离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g离心10min。弃去上清，加入5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g离心10min。弃去上清，加入RNA提取裂解液，根据试剂盒(细胞/组织总RNA提取试剂盒，购自优宁维生物)使用说明书操作说明提取RNA。提取得到的RNA定量后放入-80℃环境中保存或直接进行逆转录反应。

2.cDNA的获得：

取2～5μg步骤1获得的RNA，使用反转录试剂盒(One Step SuperRT-PCR Mix Kit，Solarbio)，按照说明书操作合成cDNA。

3.荧光定量PCR(qPCR)扩增：

采用SEQ ID NO：2～5所示的引物及探针对Sox11基因进行PCR扩增。

采用SEQ ID NO：6～8所示的引物及探针对LOC400541基因进行PCR扩增。

扩增方式采用一管法(多重PCR)。PCR扩增体系参考表1所示体系。

其中，Sox11探针序列上连接有报告基团，在本实施例中，荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1。LOC400541探针序列上也连接有报告基团，在本实施例中，荧光基团为VIC，猝灭基团为BHQ1。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，在不影响检测精度的条件下，合理选择其他的报告基团，包括但不限于上述FAM、VIC、BHQ1。

使用GAPDH作为内参基因，其中，内参基因GAPDH的特异性引物组和探针为：

上游引物(GAPDH-F)：5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’(SEQ ID NO：9)；

下游引物(GAPDH-R)：5’-GGTGCAGGAGGCATTGCT-3’(SEQ ID NO：10)；

探针(GAPDH-P)：5’-ACAGCCTCAAGATC-3’(SEQ ID NO：11)；

其中，GAPDH探针序列上连接有报告基团，在本实施例中，荧光基团为CY5，猝灭基团为BHQ1。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，在不影响检测精度的条件下，合理选择其他的报告基团，包括但不限于上述CY5、BHQ1。

PCR扩增仪器选择7500Real-Time PCR System。

表1 qPCR反应体系

其中，2×Taqman PCR Master Mix购自Solarbio。

反应程序为：95℃预变性5-10min(本实施例中为5min)；95℃变性15～30s(本实施例中为20s)，56～64℃(本实施例中为60℃)退火15～30s(本实施例中为20s)，72℃延伸40s，40个循环。

在72℃时收集荧光信号，绘制溶解曲线(温度范围60℃-95℃)。

使用2^-△△Ct法判断检测结果。

具体判断方法为：

(1)计算2^-△△Ct值：使用脑梗塞患者Sox11基因或LOC400541的Ct值减去其GAPDH 的Ct值，再取其负数值为-△Ct(脑梗塞)；健康对照者Sox11基因或LOC400541的Ct值减去其GAPDH的Ct值，再取其负数值为-△Ct(正常)；然后根据下述公式计算得到-△△Ct 值。

-△△Ct＝[-△Ct(脑梗塞)]-[-△Ct(正常)]。

以-△△Ct值为幂值，计算2^-△△Ct值。

(2)若2^-△△Ct值大于1，则认定检测样品中含有Sox11基因或LOC400541，该受试者为脑梗塞患者。

临床效果验证

为了进一步验证上述检测方法的有效性和准确性，发明人针对于19例健康对照受试者 (Normal)和40例脑梗塞患者(Stroke)进行临床检测验证。

根据上述实施例中提供的方法获取外周血RNA样本，逆转录为cDNA并进行检测。

结果如图1和图2所示。

对比Sox11基因在健康对照受试者外周血样本(Normal)和脑梗塞患者外周血样本(Stroke) 中的表达量，可以发现，Sox11在脑梗塞患者中特异性高表达，说明Sox11可以作为脑梗塞患者诊断的有效检测标志物。

对比LOC400541在健康对照受试者外周血样本(Normal)和脑梗塞患者外周血样本(Stroke)中的表达量，可以发现，LOC400541在脑梗塞患者中特异性高表达，说明LOC400541可以作为脑梗塞患者诊断的有效检测标志物。

为了进一步验证Sox11和LOC400541作为脑梗塞的有效诊断标志物，发明人基于临床数据进行特异性和敏感性分析。

结果如图3～图5和表2所示。

表2 Sox11和LOC400541单独或组合作为标志物的差异性评估

通过将健康对照受试者外周血Sox11和LOC400541的表达情况和脑梗塞患者外周血Sox11和LOC400541的表达情况输入到GraphPad Prism 9.0软件进行ROC曲线分析，可以发现，仅以Sox11基因的表达情况绘制ROC曲线，其AUC(Area under the ROC curve)值为0.6921，检测敏感性为0.5250，特异性为0.8947。而仅以LOC400541的表达情况绘制ROC 曲线，其AUC值为0.7079，检测敏感性为0.6250，特异性为0.7368。两者的AUC值均为0.7 左右，可以认为两者均可以单独作为脑梗塞诊断标志物使用。而进一步结合Sox11和 LOC400541的表达情况绘制ROC曲线，其AUC值为0.9016，检测敏感性为0.7625，特异性为0.9474，显著大于两者单独使用，且从而可以说明结合Sox11和LOC400541共同作为脑梗塞诊断标志物能够更加准确的评估脑梗塞患病风险。

综上所述，从上述结果中可以认定，单独使用Sox11、LOC400541或两者的组合均能够作为脑梗患者诊断的有效检测标志物，且当两者组合使用时，具有较高的特异性和敏感性，能够作为更加准确的诊断或用于脑梗塞预后评价的有效检测标志物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市妇女儿童医疗中心

<120> 用于辅助诊断脑梗塞及其预后评价的标志物组合及含有其的试剂盒与应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> Sox11

<400> 1

atggtgcagc aggcggagag cttggaagcg gagagcaacc tgccccggga ggcgctggac 60

acggaggagg gcgaattcat ggcttgcagc ccggtggccc tggacgagag cgacccagac 120

tggtgcaaga cggcgtcggg ccacatcaag cggccgatga acgcgttcat ggtatggtcc 180

aagatcgaac gcaggaagat catggagcag tctccggaca tgcacaacgc cgagatctcc 240

aagaggctgg gcaagcgctg gaaaatgctg aaggacagcg agaagatccc gttcatccgg 300

gaggcggagc ggctgcggct caagcacatg gccgactacc ccgactacaa gtaccggccc 360

cggaaaaagc ccaaaatgga cccctcggcc aagcccagcg ccagccagag cccagagaag 420

agcgcggccg gcggcggcgg cgggagcgcg ggcggaggcg cgggcggtgc caagacctcc 480

aagggctcca gcaagaaatg cggcaagctc aaggcccccg cggccgcggg cgccaaggcg 540

ggcgcgggca aggcggccca gtccggggac tacgggggcg cgggcgacga ctacgtgctg 600

ggcagcctgc gcgtgagcgg ctcgggcggc ggcggcgcgg gcaagacggt caagtgcgtg 660

tttctggatg aggacgacga cgacgacgac gacgacgacg agctgcagct gcagatcaaa 720

caggagccgg acgaggagga cgaggaacca ccgcaccagc agctcctgca gccgccgggg 780

cagcagccgt cgcagctgct gagacgctac aacgtcgcca aagtgcccgc cagccctacg 840

ctgagcagct cggcggagtc ccccgaggga gcgagcctct acgacgaggt gcgggccggc 900

gcgacctcgg gcgccggggg cggcagccgc ctctactaca gcttcaagaa catcaccaag 960

cagcacccgc cgccgctcgc gcagcccgcg ctgtcgcccg cgtcctcgcg ctcggtgtcc 1020

acctcctcgt ccagcagcag cggcagcagc agcggcagca gcggcgagga cgccgacgac 1080

ctgatgttcg acctgagctt gaatttctct caaagcgcgc acagcgccag cgagcagcag 1140

ctggggggcg gcgcggcggc cgggaacctg tccctgtcgc tggtggataa ggatttggat 1200

tcgttcagcg agggcagcct gggctcccac ttcgagttcc ccgactactg cacgccggag 1260

ctgagcgaga tgatcgcggg ggactggctg gaggcgaact tctccgacct ggtgttcaca 1320

tattga 1326

<210> 2

<211> 571

<212> DNA

<213> LOC400541

<400> 2

aaaaacaggt ggcgtagcag gtgggcagca cgttgccatg atgtgccgtg gcccggccgt 60

ggctggcgtg atcccaccag agtgagctgg agcagatctg caccatgggc caagtttctc 120

agaaaataca tagcttcctg tgggctgcag cctaatgccc acgttcctct cggggaagac 180

caaaggttat tcaaccaggg caaaggacag ccttgcaaac caactacgtc ctccttctgg 240

agtttgtgtg acccctggcc cctgagccca caccctctcg gagcggggtt ccaactccgt 300

ggaagctctg ctgagatgca gatggctttg gaggggtgca aatgctacgt gtttggaaga 360

gcagaggagg cctgcagctc tcagtcacct gtctccatct tcggaggagg gcgtcgcgac 420

caatgaaatc catgccctaa gaaagaaagg aaacgccgag tcatccagcg acactcagac 480

cctcggcaca gagagcagca ccgtgggaag ggtcccctgg tgtcactgca atggggcaca 540

gccgcctcct cccacaaccc tgccagcttt t 571

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagcctaca ttttcaacca caat 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaacgaagg tatggtagga atcaa 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttatgaaac tgagctctct t 21

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgtcgcgac caatgaa 17

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatgactcg gcgtttcct 19

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccatgcccta agaaa 15

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgggtgtgaa ccatgagaag tatg 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtgcaggag gcattgct 18

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acagcctcaa gatc 14

Claims

1.下述(1)～(3)中任一种基因或其蛋白作为脑梗塞诊断靶点或治疗靶点的用途；

(1)Sox11基因；

(2)LOC400541；

(3)Sox11基因和LOC400541。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Sox11基因的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO:1所示序列；或

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述LOC400541的核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO:2所示序列；或

4.检测下述(1)～(3)中任一种基因的表达情况的试剂在制备脑梗塞诊断或辅助诊断产品中的应用；

(1)Sox11基因；

(2)LOC400541；

(3)Sox11基因和LOC400541。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品包括检测试剂、检测试剂盒、检测试纸条、基因芯片。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品的使用方法为：

使用所述脑梗塞诊断或辅助诊断产品检测样品中的Sox11基因、LOC400541或两者的组合的表达量，根据样品2^-△△Ct值判断受试者患病风险。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，受试者患病风险判断标准为：

若否，则不具有脑梗塞患病风险。

8.一种脑梗塞诊断试剂，其特征在于，所述试剂中含有Sox11基因、LOC400541或两者的组合的检测试剂以及检测脑梗塞的其他试剂，

所述检测试剂优选包括Sox11基因的特异性引物组和探针和/或LOC400541的特异性引物组和探针；

所述Sox11基因特异性引物组的核苷酸序列为：

上游引物Sox11-F：5’-GGAGCCTACATTTTCAACCACAAT-3’；

下游引物Sox11-R：5’-AAAACGAAGGTATGGTAGGAATCAA-3’；

所述Sox11基因探针的核苷酸序列为：

探针Sox11-P：5’-TTTATGAAACTGAGCTCTCTT-3’；

所述LOC400541特异性引物组的核苷酸序列为：

上游引物LOC400541-F：5’-GCGTCGCGACCAATGAA-3’；

下游引物LOC400541-R：5’-GGATGACTCGGCGTTTCCT-3’；

所述LOC400541探针的核苷酸序列为：

探针LOC400541-P：5’-CCATGCCCTAAGAAA-3’。

9.一种脑梗塞检测试剂盒，其特征在于，所述脑梗塞检测试剂盒中含有权利要求8中所述诊断试剂和对照试剂。

10.根据权利要求9所述的脑梗塞检测试剂盒，其特征在于，所述对照试剂包括阴性对照试剂；所述阴性对照试剂为正常健康人标准样品。