CN109136362B

CN109136362B - 一种脑卒中LncRNA生物标记物及其应用

Info

Publication number: CN109136362B
Application number: CN201810993312.5A
Authority: CN
Inventors: 申红星; 邵世和; 娄培安; 刘庭君; 肖卉
Original assignee: Xuzhou Center For Disease Control Prevention (xuzhou Health Education Institute); Jiangsu University
Current assignee: Xuzhou Center For Disease Control Prevention (xuzhou Health Education Institute); Jiangsu University
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN109136362A

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种脑卒中LncRNA生物标记物及其应用。本发明所述的LncRNA生物标记物的特异性扩增引物对，在脑卒中病人血液中呈高表达，本发明所提供的标记物在制备脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估产品中具有重要的应用前景。

Description

一种脑卒中LncRNA生物标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种脑卒中LncRNA生物标记物及其应用。

背景技术

脑卒中（cerebral stroke）是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60%～70%。颈内动脉和椎动脉闭塞和狭窄可以引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，男性较女性多，严重者可引起死亡。出血性卒中的死亡率较高。调查显示，城乡合计脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因，脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。

发生脑卒中的危险因素有：冠心病伴有房颤患者、高血压、糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、胶原性疾病、高血压病动脉改变、风心病或动脉炎、血液病、代谢病、药物反应、肿瘤、结缔组织病等。其中，高血压是中国人群卒中发病的最重要危险因素，尤其是清晨血压异常升高。研究发现清晨高血压是卒中事件最强的独立预测因子，缺血性卒中在清晨时段发生的风险是其他时段的4倍，清晨血压每升高10mmHg，卒中风险增加44%。

不同类型的脑卒中，其治疗方式不同。由于一直缺乏有效的治疗手段，目前认为预防是最好的措施，其中高血压是导致脑卒中的重要可控危险因素，因此，降压治疗对预防卒中发病和复发尤为重要。目前，在我国对脑卒中防控工作及“三早”干预效果仍不理想，大多数患者都是出现卒中征兆后才就诊，现迫切需要一种非侵入性的，操作简便且特异性及灵敏度均较高的早期评估方法来对脑卒中进行早期辅助筛查。

如今，越来越多的研究结果表明，LncRNA（长链非编码RNA）在脑血管等疾病的发生与发展过程中发挥着重要作用。在脑血管疾病中，LncRNA转录水平的异常往往可以标志着疾病的进展程度，有时也可以用来预测个体的患病风险。目前关于LncRNA标记物在脑卒中调控机制中的研究还处于起步阶段。因此，通过分析、研究LncRNA在脑卒中的发生发展机制，对脑卒中的早期筛查具有重要作用，并且为脑卒中的基因靶向治疗提供可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种在脑卒中人群血液中高表达的LncRNA标记物，提供扩增LncRNA标记物的特异性引物对，以及利用引物对进行脑卒中早期筛查辅助评估或脑卒中预测评估信息中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术发案是：一种在脑卒中人群血液中的高表达的LncRNA标记物，本发明所述LncRNA标记物在NONCODE数据库(http://www.noncode.org/)中的编号为NONHSAT138821，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述LncRNA标记物的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，即：5’- TAATGTCTTCCAGCCTACTT -3’；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，即：5’-GGATATTGAGCCAGTTGATG -3’。

所述引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，根据LncRNA标记物NONHSAT138821的核苷酸序列，所设计的特异性引物对脑卒中患者血液样本进行PCR扩增，可获得171bp大小的特异性片段。

本发明还提供一种检测血液中LncRNA的方法，所述方法为非诊断和治疗目的的方法，该方法具体包括：

提取待检测样本的总RNA作为模板；制备cDNA模板，以上述的LncRNA标记物的特异性引物对作为扩增引物，通过PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现171bp的DNA条带，则待检测样本中具有LncRNA。

本发明还提供一种LncRNA标记物在制备脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估产品中的应用；所述应用通过测定样本中的LncRNA标记物的表达水平与参考水平相比上调而确定。所述应用具体为通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测LncRNA标记物基因的表达水平。

另一方面，本发明还提供一种非诊断和治疗目的的试剂盒，其包含上述LncRNA标记物。进一步地，试剂盒还包括标准DNA模板、PCR反应液。

进一步地，所述PCR反应液中包括ddH₂O，PCR缓冲液、BSA、MgCl₂、dNTP和Taq DNA聚合酶。

进一步地，所述试剂盒，用于获取脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估信息。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明成功检测出脑卒中血液中高表达的 LncRNA标记物，可应用于制备脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估产品中，有利于进一步阐明脑卒中的发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。

附图说明

图1为分别对脑卒中患者和健康体检人群中LncRNA的实时荧光定量PCR电泳图；M为DNA分子量标准；编号1~5代表脑卒中患者的个体，编号6代表健康体检人群的个体。

图2为利用实时荧光定量PCR的方法检测脑卒中患者和健康体检人群中LncRNA的表达情况图。

具体实施方式

下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例一：

1．样本收集

各收集100例健康体检人群血液和脑卒中患者的血液，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2．RNA样本的制备

（1）临床血清样本收集后12000rpm高速离心10min，重复2次，所得血清样本-80℃保存；

（2）冻存血清样本4℃解冻；

（3）吸取250µL的血清样本至1.5m1EP管，加750µL Trizol LS Reagent，吹打混匀，静置5min；

（4）加氯仿(CHCl3：Trizol 250µL:750µL)，颠倒混匀，静置15min；

（5）4℃，12000rpm，离心15min；

（6）小心吸取上层液体至一新EP管；

（7）加适量异丙醇(异丙醇：trizo1500 µL：750 µL)，颠倒混匀，静置10min；

（8）4℃，12000 rpm离心10min；

（9）弃上层离心液，加75％乙醇(RNA酶灭活)；

（10）4℃，8000rpm离心5min；

（11）保留沉淀，弃上层离心液，室温静置5-10min；

（12）适量DEPC水溶解沉淀，取适量RNA溶液测浓度及观察RNA抽提情况；

（13）标记名称、浓度及日期，-80℃保存。

3、逆转录

（1）反应体系：

RNA模板1µL，随机引物1µL，双蒸水加至12µL，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。继续在12µL反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4µL，RNA酶抑制剂(20U/µL)1µL，10mM dNTP混合液 2µL，AMV反转录酶(200U/µL)1µL；充分混匀并进行离心处理；

（2）逆转录反应条件：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min，4℃保温60min。

（3）聚合酶链反应

引物设计：根据NONHSAT138821基因的序列设计qPCR扩增引物。

NONHSAT138821基因的具体引物序列如下：

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，即：5’- TAATGTCTTCCAGCCTACTT -3’；

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，即：5’- GGATATTGAGCCAGTTGATG -3’。

配制PCR反应体系：2×qPCR混合液12.5µL、基因引物2.0µL、反转录产物2.5µL、ddH₂O 8.0µL。

PCR反应条件如下： 94 ℃预变性5min后；94 ℃变性30 s, 65 ℃退火30 s(每个循环降低0.5 ℃), 72 ℃ 延伸1 min，共20个循环；94 ℃ 再变性30 s， 55 ℃ 再退火30s，72 ℃ 再延伸1 min，共20 个循环；最后72 ℃补平 7 min，终止温度为16℃。将扩增产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 µL，与6×上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于1×TAE溶液中、在100V电压下电泳30 min，电泳结束后经0.5 mg/L的溴化乙锭浸泡染色20 min，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。

4、结果

按照上述方法，分别以脑卒中患者作为阳性实验组，以健康体检人群作为阴性对照组进行检测，电泳结果见图1，其中， M为DNA分子量标准，编号1~5代表的阳性实验组在171bp处出现一条特征性的条带MOCK代表对照组未见有171bp的DNA条带。

实施例二：标记物LncRNA在脑卒中组织中的表达

1.样本收集

按照实施例1的方法收集健康体检人群血液和脑卒中患者血液各50例

2.RNA提取步骤如实施例1所述。

3．逆转录步骤如实施例1所述。

4．PCR扩增

配制PCR反应体系：2×qPCR混合液12.5µL，基因引物2.0µL，反转录产物2.5µL，ddH₂O 8.0µL。

PCR反应条件如下：95℃预变性10min，(95℃变性15s，60℃退火60s)×40个循环，60℃延伸5min。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5.统计学意义

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，正常人与脑卒中病人的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

利用2-ΔΔCt法计算差异倍数，以脑卒中患者作为脑卒中组，以健康体检人群作为正常组；如图2所示，与正常组相比，脑卒中组的INC-RP1-177G6的差异表达倍数为38.01，说明在脑卒中病人血液中LncRNA表达显著上调，即二者存在着明显的正相关的关系，具有统计学意义（P<0.05）。

序列表

<110> 江苏大学

徐州市疾病预防控制中心（徐州市健康教育所）

<120> 一种脑卒中LncRNA生物标记物及其应用

<140> 201810993312.5

<141> 2018-08-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

aatcagtgtc ttccagaaag aaatccaggt cttccagtca atcagtgtct tccagaaaga 60

aatccaggtc ttccagtcag tcagtgtctt ccagaaaaat ctacgtcttc caccaaatcc 120

aggtcttcca gtcaatccac atcttccgga aaaaatccag gtcttccagc caatatatgt 180

cttcctgaag atccacgtct tccagaaaat ccatgtcttc cagaaaatcc atgtcttcca 240

gtaacctccc agtcttccag aaaatccacg tcttccagac tatccatgtc ttccagaaaa 300

tccttgtctt cccttaaatc tatagcttcc aaaaaatccg ggtcttccag gaaatccgtg 360

tcttccagca agtccacgtc ttccaacaaa gccatgtctt ccagactatc catgtcttcc 420

agaaaatcct tgtcttccct caaatccata gcttccgaaa aatccaggtc ttccaggaaa 480

tccgtgtctt ccagcaaatc cacgtcttcc aacaaagcca tgtcttccat caaattaatg 540

tcttccagcc tacttgtgtc ttccaacaaa ggtcttccag catctccagg gcttccagca 600

tctgctcgtc ttccaacatc tccacgtctt ccagcatctc tgtgtcttcc agcatcttca 660

tgtcttccaa caactaccca gtcttccatc aactggctca atatccatgt cttccaacgt 720

ctccagtgtg ctgatcttct gacattcagg tcttccagtg tctgcaatat ccaggtattc 780

taacatgttc tatagtccag atcttccagc ctttccccag gtccaggcct tttcaaatct 840

aggcttcccc tgtctgagcc tt 862

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatgtcttc cagcctactt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatattgag ccagttgatg 20

Claims

1.一种脑卒中LncRNA标记物的特异性引物对，其特征在于，所述LncRNA标记物的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.一种检测血液中LncRNA的方法，所述方法为非诊断和治疗目的的方法，其特征在于，以权利要求1所述的LncRNA标记物的特异性引物对作为扩增引物，通过PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现171bp的DNA条带，则待检测样本中具有LncRNA。

3.如权利要求1所述的LncRNA标记物的特异性引物对在制备脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用具体为通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测LncRNA标记物基因的表达水平。

5.一种非诊断和治疗目的的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的LncRNA标记物的特异性引物对。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含标准DNA模板和PCR反应液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包括ddH₂O，PCR缓冲液、BSA、MgCl₂、dNTP和Taq DNA聚合酶。

8.如权利要求5-7任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于获取脑卒中辅助评估或脑卒中早期评估信息。