CN108872589A - 脑梗死外周血标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脑梗死外周血标志物及其应用，外周血蛋白为LRR和A2GL(LRG)中的至少一个。本发明的脑梗死外周血标志，可以很好地用于脑梗死的诊断。

Description

脑梗死外周血标志物及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及脑梗死的标志物及其应用。
背景技术
脑血管疾病是临床中常见的神经系统多发病，致死率和致残率均较高，是目前威胁人类生命的三大疾病之一，约有50％以上的患者即使经过治疗能够存活，也会留下失语、瘫痪等严重残疾，给患者及家庭带来严重痛苦。脑梗塞(脑梗、缺血性脑卒中)是脑血管病(Cerebrovascular Disease,CVD)的最常见类型，约占全部CVD的70-80％，本病的病死率为10％，致残率达50％以上，存活者中40％以上可复发，具有高发病率、高死亡率及高复发率的特点。
脑梗塞是由于患者脑血管发生病变或血液成分出现异常而导致的常见脑血管疾病，其中由于血栓形成性的脑梗死动脉粥样硬化是较为常见的病因及基本病因。是指由于脑部血液供应障碍、缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化，引起神经细胞缺血、缺氧、水肿、变性、坏死，引起炎性细胞的浸润，吸收坏死组织，出现相应神经功能缺损。脑梗死多发于老年人群。近年来，随着生活方式的转变及社会压力的增大，脑梗死的发病也逐渐趋于年轻化。其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，对于多数脑梗死患者，神经元死亡不可避免，是治疗难以取得满意效果的主要原因。
其发生时，缺血半暗带内的组织细胞血液灌注量极少，但仍存活，若在发病6h内进行溶栓治疗，使血流迅速恢复，神经细胞可存活并恢复功能，从而明显改善预后。
随着生活水平的提高和渐进老龄化社会，我国脑血管意外的发生率越来越高。其临床症状常因梗死部位的不同而有特异性的表现，但是情绪障碍(如抑郁、焦虑等)是共有的主要特征。临床研究显示，血液成分变化、红细胞过量增多、血液粘稠度增加以及高脂血症等都可能会促进血栓的形成，因而长期以来，糖尿病、高血压及高血脂症都被认为是导致老年患者发生脑梗死的主要原因。脑梗死的临床常见类型有脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，脑梗死占全部脑卒中的70-80％。脑梗塞的主要因素有：高血压病、冠心病、糖尿病、体重超重、高脂血症、喜食肥肉，许多病人有家族史。
1.1脑血管病的危害
上世纪50年代以后，传染病得到了有效的控制，发病率及死亡率大幅度下降，一些非传染性疾病如心血管病，脑血管病(主要为脑梗)，恶性肿瘤在人类死亡原因序列中明显前移，成为三大主要死亡原因。根据WHO脑血管病协作研究组对57个国家的统计资料，脑血管病列在前三位死亡的有40个；因此病致死的占57个国家中总死亡数的11.3％。1962年以前脑血管病在日本占死因第一位，1982年以后占第二位；在美国，加拿大，古巴和巴巴多斯等国占第三位；以我国城市人口计，在1975～1982年占死因第一位，1983年后占死因第二位，全国由此病致死的占城市死亡总数的20％左右，占农村死亡总数的16％左右。对老年人而言，脑梗更是重要的死亡或致残原因。在世界与我国人口老龄化趋势日益加速的情况下，脑梗的危害性亦必然日益突出，因此，脑梗的防治已成为卫生工作中的一项重要课题，越来越引起国内外医学界特别是神经科学界的重视。
脑血管病是一组以脑组织缺血或出血性损伤症状为主要临床表现的急性血管事件综合征(也称卒中，包括脑梗死、短暂性脑缺血发作、脑出血)，具有高发病率、高致死率、高致残率和高复发率的“四高”特点，据世界卫生组织统计，全世界每6个人中就有1人可能罹患脑血管病，每6秒钟就有1人死于脑血管病，每6秒钟就有1人因脑血管病而永久致残。目前，我国脑血管病后幸存患者至少700万，每年新发患者约200万，轻型卒中患者约2 000万，已成为我国居民最主要的致残原因，脑血管病导致的死亡超过总死亡原因的五分之一，成为危害国人健康的第一杀手。更为严重的是，“高血压、糖尿病、血脂异常”等庞大的脑血管病潜在发病人群数以亿计，我国脑血管病可能呈现“井喷”态势，其危害与负担已经成为我国重要的社会问题。脑血管病可防可治。然而，我国在脑血管病防治事业领域尚面临巨大的挑战：对疾病原因和发病机制的认识远远不能满足疾病防治的需求；缺乏符合成本效益的高危人群筛查、干预适宜技术和策略，以致无法有效遏制疾病发生；在诊断和治疗方面的循证医学证据绝大部分来自欧美发达国家，中国自己本身的证据严重缺乏，尤其是针对我国脑血管病人群突出的特有问题，如颅内大血管狭窄、出血性卒中、中医中药的应用等，导致临床实践中存在一定的盲目性，临床前评价及向临床的转化研究明显不足。
中国是全球脑血管病危害最严重的国家，死亡率是北美地区的5倍。中国脑血管病的发病年龄比高加索人群早10年，推迟发病时间是中国神经科医生面临的最为重要的任务。自1900年始，美国脑血管病的死亡率逐年下降，而中国脑血管病的死亡率却日益攀升。随着经济水平的提高和医疗水平的不断改善，轻型脑血管病的比例日益增高，重型脑血管病的比例相对下降，这个趋势全球基本一致。中国城市医院住院脑血管病患者中，脑出血的比例是西方国家的3倍。动脉粥样硬化仍是缺血性脑血管病发病的主要基础，但与西方人群不同的是，颅内动脉粥样硬化是中国人群最主要的发病基础。在过去几年，由于国家出台了一系列防控政策，我国脑血管病医疗质量得到了极大改善，但防控压力依然巨大。脑血管病是急性发病的慢性病，从出生携带易感基因，到合并各种危险因素，引起亚临床病变(动脉粥样硬化、动脉瘤)需要数十年的时间，直到60～70岁发病。把防控重点放在全人群和有危险因素的人群会取得良好的效果，但是成本难以承受，同时防控对象的依从性会很差。相反，如果把防控关口放在第1次发病后，成本会大大降低，防控对象的依从性会大幅度提高，但由于发病后很多患者已经发生严重残疾，康复效果不佳，防控效果很差。在目前中国社会经济发展水平下，确定适合中国的最佳防控人群和防控措施迫在眉睫。与国际趋势类似，我国脑血管病患者3/4为缺血性脑血管病。缺血性脑血管病发病之后按照严重程度和临床后果分为致残性(遗留残疾)和非致残性(不遗留残疾)。对致残性缺血性脑血管事件(disabling ischemic cerebrovaseular events，DICE)的主要任务是康复和功能恢复。对于非致残性缺血性脑血管事件(non.disabling ischemie cerebrovascularevents，NICE)可分为两类不同的人群：患者恢复后长期处于稳定状态，呈现良性结局；更大比例的人群处于不稳定状态，在一段时间内复发成为严重的卒中，称为高危非致残性缺血性脑血管事件(highrisk non—disabling ischemic cerebrovascular events，HR—NICE)。考虑我国的经济发展水平、人群健康素质、面临的防治任务，应该把HR-NICE作为最为重要的防治人群，也是目前脑血管病最佳防控窗口人群。NICE主要指轻型缺血性卒中(minorischemicstroke)和短暂性脑缺血发作(TIA)的患者。流行病学调查显示，我国TIA患病人群为2 390万，其中ABCD2评分在4分以上的高危人群高达78％。住院脑血管病患者中，轻型卒中占全部患者的42％，因此我国HR-NICE人群庞大，防控任务繁重。有效治疗HR-NICE人群将会大幅度降低脑血管病带来的残疾和死亡，极大降低脑血管病的疾病负担。合并多重危险因素可以预示非致残性脑血管事件发生致残性脑血管事件，包括高血压、糖尿病、高龄、代谢综合征、肾功能障碍、超重、心房颤动、伴有内科并发症和卒中后抑郁，使用这些危险因素可以建立患者复发风险预测模型。血中的某些分子标志物水平升高,包括超敏C反应蛋白(CRP)、可溶性CD配体(sCD)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)]也会预示卒中的复发，合并颅内动脉狭窄患者的复发几率更高。早期足量抗血小板治疗给HR—NICE的干预带来了希望，但过多抗血小板使用可能引起致死性出血并发症。长期以来，临床治疗陷入出血和缺血平衡的困局之中。我国人口老龄化趋势日益加速的情况下，脑梗的危害性亦必然日益突出，因此，脑梗的防治已成为卫生工作中的一项重要课题，越来越引起国内外医学界特别是神经科学界、急诊医学界的重视。
1.2国内外研究现状和发展趋势
CT扫描是脑卒中诊断的常用检查方法，CT能明确病灶部位、大小、性质。C T对发病24h内脑梗死的诊断效果不佳。若通过血液检测来早期诊断脑卒中，会使患者获益良多。血液中含量丰富的物质之一是蛋白质，任何一种疾病在其表现出任何可察觉的病症之前，某些蛋白质已经发生了变化。脑梗塞早期外周血中变化的蛋白质来源：肝脏等分泌的蛋白质，血脑屏障损坏后从损伤的脑组织释放到血液中的蛋白质。
越来越多的证据表明血清中的蛋白质常常是疾病的诊断标志，是获得生物标志分子的丰富资源之一。随着血清蛋白质组学技术的进一步发展，其将有助于了解蛋白质结构、功能和复杂的信号传导通路，揭示健康与疾病状态下细胞内蛋白质组的变化。蛋白质组不仅包括基因组表达的所有蛋白质，还包括修饰后各种形式的蛋白质，是细胞内所有蛋白的集合体，蛋白质组具有多样性和可变性。蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中各不相同，在同一细胞的不同时期、不同条件下也在不断变化。面对如此复杂的、动态的研究对象，以往的静态的、局部的研究方法表现出很大的局限性。
蛋白质是基因的功能执行者，对蛋白质结构、定位和对蛋白质与蛋白质之间相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础，仅仅从基因的角度进行研究尚不能解决基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰等问题。几乎所有的生理病理过程以及药物和环境因子作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质组变化，任何一种疾病在其表现出任何可察觉的病症之前，肯定有某些蛋白质已经发生了变化，因此，寻找各种疾病的关键蛋白和标志蛋白，对于疾病的诊断、病理研究和药物的筛选具有重要的意义。
1.3脑梗塞与蛋白组学的关系
随着我国经济的发展、社会生活方式的改变及人口老龄化程度的加快，心脑血管疾病、糖尿病、超重肥胖、肿瘤等患病率大幅上升，呈逐年上升趋势。已成为我国人民健康所面临的重大挑战，其中以心脑血管病、恶性肿瘤尤为突出.因此如何预防心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等重大慢性疾病的发生？如何为主要慢性疾病高风险人群提供风险干预和预防医疗服务,探索有效的慢病防控关键技术平台，是健康产业面临的巨大挑战，我们联合国内外预防医疗专家，分析了心脑血管疾病、糖尿病、超重肥胖、肿瘤等主要慢病的发病机理和致病风险因素,大量研究结果一致认为:人体微循环中不稳定的蛋白质(protien:unstableor intrinsically disordered proteins)、体内暴露和残留的外源性的环境毒素(Enviromental toxins,如重金属、农药、有毒化学物质)、蓄积的内源性的代谢毒素(metabolic waste andmetabolic accumulated wastes)、免疫抑制因子(immunosuppressivefactor)、慢性炎性因子(chronic inflammatory factor)是人类慢性疾病和衰老的主要因素，TE－PEMIC慢病预防医疗技术体系的建立和应用为慢病预防提供了新的研究和探索思路。
随着血清蛋白质组学技术进一步发展，其将有助于了解蛋白质结构、功能和复杂的信号传导通路，揭示健康与疾病状态下细胞内蛋白质组的变化。蛋白质组不仅包括基因组表达的所有蛋白质，还包括修饰后各种形式的蛋白质，是细胞内所有蛋白的集合体，蛋白质组具有多样性和可变性。蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中各不相同，在同一细胞的不同时期、不同条件下也在不断变化。
外周血液易于采集，含有血细胞、蛋白质、激素等物质。外周血同时含有疾病的标志物，如在外周血所检测的肿瘤标记物就大多是蛋白质。已有研究表明心肌梗塞时外周血特异的肌钙蛋白改变有助于急性心梗诊的断。外周血蛋白质的改变也有助于了解许多疾病的病理过程。然而由于脑血屏障的存在，许多分子，特别是蛋白质等大分子难以透过脑血屏障，脑部疾病有关的分子极少出现在外周血中，或分子的浓度改变极小，难以作为标志物使用。
脑梗死患者没有外周血蛋白质改变的报道，更没有哪种蛋白质改变可有助于诊断脑梗死，发明人曾检测外周血神经烯醇酶、S100等蛋白质，发现脑出血、脑肿瘤病人的外周血中，此两种蛋白改变较明显，脑梗死时有改变，但没有前2种病明显。
如能在外周血中检测到脑硬死相关的标志物，将极大地方便脑梗死的诊断，更好地指导后续的治疗。
富亮氨酸α2糖蛋白1(leucine-richα2-glycoprotein 1，LRG，又称为A2GL，leucine-rich alpha-2-glycoprotein)，1977年,从人血清中分离出,其氨基酸序列在1985年被确定，是富亮氨酸重复家族中的一员，它包括八个富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat，LRR)，LRG基因定位于染色体19p13.3，编码347个氨基酸，预测分子量为38kD，LRG的成熟形式是一种分泌蛋白，含有312个氨基酸，实验确定分子量为45kD。已经有研究表明，绝大多数在神经系统中高表达的LRR蛋白属于跨膜蛋白,它们主要作为细胞黏附分子或配体结合蛋白参与突触的形成、神经突起的生长发育、神经递质的转移和释放等神经系统正常生理活动。
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发明内容
本发明的目的在于提供一种脑梗死外周血标志物及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
外周血蛋白作为脑梗死标志物的应用，其中，外周血蛋白为LRR和A2GL(LRG)中的至少一个。
定量外周血蛋白含量的试剂在制备脑梗死诊断试剂中的应用，其中，外周血蛋白为LRR和A2GL(LRG)中的至少一个。
作为上述应用的进一步改进，LRR、A2GL(LRG)相对健康人正常表达水平上调预示脑梗死高风险。
作为上述应用的进一步改进，脑梗死为急性脑梗死。
本发明的有益效果是：
本发明的脑梗死外周血标志，可以很好地用于脑梗死的诊断，指导临床用药。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
外周血LRR、LRG浓度改变在诊断脑梗塞方面的意义
临床样本的筛选与收集:收集近2年脑梗塞病人样本300例，均为首次发作，记录性别，年龄，所有病人测血压，血脂，血糖，肝功能，肾功能，凝血四项，ECG等检查，所有病例行CT,MRI证实。同时选年龄、性别等条件匹配的正常人作为对照。标本采集：对符合纳入标准的患者采集静脉血5mL，静置15min，以3000r/min，离心15min，提取血浆，放入无菌冻存管，于－80℃保存用于研究，另选择相应的正常对照，采集抗凝血5mL。
病例患者血浆样本的研究：分离血浆及血细胞。检查方法如下：在高速离心机的作用下，分离血浆及细胞。主要设备、材料和试剂：匀浆机、高速离心机、3kDa超滤离心管、ICP-MS。试剂配制，配制50mM Tris-Buffer(pH＝7.4)及SeronormTMTrace Elements Serum-2(LOT 1309416，有效期至2020年10月)，皆购自挪威Sero公司；实验过程所用的水为18.2MΩ/cm的超纯水。样品前处理方法：取400-500ul血浆或细胞内液，加入0.3ml浓硝酸，放置过夜，在沸水浴中加热2小时，冷却后用水定容至10ml,摇匀，待测。
统计学方法：各组均值比较用T检验，使用SPSS统计软件，以P<0.05为统计学意义。
结果：
分别用日本及武汉产试剂盒检测外周血中LRG含量，日本产试剂盒查出值远高于武汉产试剂盒查出值，原因是不同公司所产抗体结合部位不一样，日本产是查的总量LRR相关蛋白，以下简称LRR，武汉产查的是LRG，正常值的确定是均数加2个标准差为正常范围，以均数加2个标准差为上限，LRR正常上限为1300ng/ml,LRG 80ng/ml。日本产检测脑梗塞120例，超过CUTOFF值118例，正常人40例，8个超CUTOFF值，武汉产检测脑梗塞220例，CUTOFF值80ng/ml,结果超过CUTOFF 214例，假阴性6例，正常人60个，16个超CUTOFF值，假阳性26％。
急性脑梗塞外周血LRR,LRG改变结果见表1。
表1、急性脑梗塞外周血LRR，LRG改变(X±SD,单位ng/ml)
急性脑梗塞与正常人比较，P<0.01。
LRR,LRG诊断急性脑梗塞时的敏感性及特异性，见表2和表3。
灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％。正确判断病人的率
特异度＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。正确判断非病人的率
假阳性率＝假阳性人数/金标准阴性人数
假阴性率＝假阴性人数/金标准阳性人数
检测120例急性脑梗塞患者LRR，依LRR 1300NG/ML为CUTOFF值，120例患者中有118例阳性，假阴性2例，40例正常人中，＜1300ng/ml者32例，阴性符合率特异性80％，假阳性20％。
表2：LRR,LRG诊断急性脑梗塞时灵敏度及特异性
表3：LRR,LRG在急性脑梗塞各个不同时期的改变(X±SD,单位ng/ml)
与正常人比较，急性脑梗塞患者从起病半小时时及起病后72小时LRR，LRG均升高，P<0.05。

Claims (4)

1.外周血蛋白作为脑梗死标志物的应用，其中，外周血蛋白为LRR和A2GL(LRG)中的至少一个。
2.定量外周血蛋白含量的试剂在制备脑梗死诊断试剂中的应用，其中，外周血蛋白为LRR和A2GL(LRG)中的至少一个。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：LRR、A2GL(LRG)相对健康人正常表达水平上调预示脑梗死高风险。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：脑梗死为急性脑梗死。
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