KR20170114099A - 뇌졸중 진단용 조성물 및 이를 진단하는 방법 - Google Patents

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Abstract

개체의 뇌졸중을 진단하기 위한 진단용 조성물 및 키트, 및 뇌졸중을 진단하기 위한 방법에 의하면 시료 내 miRNA 등의 유전적 변화를 이용하여 뇌졸중을 효율적으로 진단할 수 있고, 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법에 따르면 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 사이의 결합을 저해하는 물질을 선별하여 상기 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

뇌졸중 진단용 조성물 및 이를 진단하는 방법{composition for diagnosing stroke and method for diagnosing stroke}
개체의 뇌졸중을 진단하기 위한 진단용 조성물 및 진단하는 방법에 관한 것이다.
뇌허혈이 진행되면 뇌의 혈액 세포들이 손상을 입어 뇌졸중의 병태에 빠진다. 중추 신경계(CNS)의 손상은 혈액-유래 염증 세포의 활성화와, 이에 의한 순환 염증 유발성(circulating pro-inflammatory) 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)의 생성 및 방출을 유도한다. 활성화된 백혈구는 허혈성 뇌로 이동하고 염증을 악화시켜, 결국 신경 세포가 사멸에 이르게 한다. 그러나, 이러한 말초 혈액 세포의 뇌에 손상을 입히는 급성 면역 반응의 메커니즘에 대한 분자 수준의 메커니즘은 알려지지 않았다.
최근 마이크로어레이 기술의 개발로 인해 뇌졸중을 포함하는 다양한 질병들의 분자적 징후들을 알 수 있게 되었다. 여러 마이크로 어레이 연구에서 뇌졸중을 겪는 도중 말초 혈액 세포에서의 분명한 유전적 변화가 보고되었다. 말초 혈액의 유전적 프로파일링은 뇌졸중과 뇌졸중의 서브타입, 또는 신규한 뇌졸중의 분자적 병태 생리를 확인하는데 이용될 수 있다. 이러한 유전적 변화 중 miRNA의 변화에 대한 연구 역시 활발히 진행되고 있다.
miRNA는 비-암호화된 18-25 뉴클레오티드 길이의 작은 RNA로서, 유전자 발현의 주요한 내생적 조절자이다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(3'-UTR)에 결합하여 번역 억제 또는 mRNA 분해를 유도하여 표적 유전자의 발현을 저해한다. miRNA로 추정되는 약 1,500종의 RNA가 밝혀졌고, 포유류 유전자의 최대 30% 정도가 miRNA로 조절되는 것으로 예측된다. 많은 miRNA들이 세포 주기, 조혈 및 세포 대사에서 주요한 역할을 하고 있으며, 여러 연구에서 miRNA가 뇌허혈증의 진행 또는 재관류에서 뇌뿐만 아니라 말초 혈액에서도 일시적으로 조절되는 것을 밝혀내었다. 뇌졸중에서 발현이 변화하는 miRNA들은 염증, 내피(endothelial)/혈관 기능, 적혈구 생성(erythropoiesis), 혈관 신생(angiogenesis), 신경 기능 및 저산소증(hypoxia)과 관련있는 것으로 추정된다. 그러나 뇌졸중의 급성기(acute phase)에서의 혈액 miRNA의 발현 패턴에 대한 연구는 거의 수행되지 않았다. 그러므로, miRNA 프로파일링 및 이들의 표적 유전자에 대한 조절 역할에 관한 추가적인 연구가 필요한 실정이다.
특히 급성 허혈성 뇌졸중의 진단은 신경학적 이상의 임상적 진단과 CT, MRI등을 이용한 영상의학적 방법에 의존적으로 수행되고 있다. 그러나 신속한 진단이 필요한 급성 허혈성 뇌졸중의 특성상, 혈액에서 뇌졸중에 특이적인 유전적 변화를 찾기 위한 노력이 계속되고 있다.
일 양상은 개체의 뇌졸중을 진단하기 위한 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체의 뇌졸중을 진단하기 위한 방법을 제공한다.
다른 양상은 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 뇌졸중 진단용 조성물을 제공한다.
용어 "miRNA"는 microRNA 또는 miRs로 지칭될 수 있다. miRNA의 길이는 약 10 내지 30, 또는 21 내지 25개의 뉴클레오티드인 RNA 가닥일 수 있다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않으므로, 비-코딩 RNA를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. miRs는 공지의 원발성 전사체 pri-miRNA로부터 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 (stem-loop) 구조로 프로세스되고, 최종적으로 생성된 단일 가닥 miRNA로 프로세스된다. pre-miRNA는 자가-상보 영역내에서 자체적으로 안으로 접히는 구조를 형성할 수 있다. 그 후 상기 구조는 동물에서는 뉴클레아제에 의해 프로세스된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA 분자에 부분적으로 상보적이며, 단백질의 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA의 확인된 서열은 www.microRNA.org, www.mirbase.org, 또는 www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi.와 같은 공개된 이용가능한 데이터베이스에서 평가할 수 있다. miRNAs는 "mir-[숫자]"와 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]- mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"가 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"가 붙는다. 본 발명의 내용에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA (miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다. miR 명명에 대한 상세한 내용은 www.mirbase.org 또는 Ambros et al., A uniform system for microRNA annotation, RNA 9:277-279 (2003)을 참고한다.
상기 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a은 각각 서열번호 17 내지 46의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 서열번호 17 내지 46의 뉴클레오티드 서열로 구성된 miRNA일 수 있다. 상기 miRNA들은 뇌졸중 환자의 말초 혈액 내에서 정상인과 비교하여 그 수준이 변화하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 상기 miRNA들의 개체 내 수준 변화를 측정하여 뇌졸중을 진단할 수 있다. 또한 개체로부터 분리된 시료 중 상기 miRNA들의 수준을 2종 이상 측정하는 것으로서 뇌졸중 진단의 민감도 또는 특이도를 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 있어서, 모든 miRNA는 천연적으로 존재하는 miRNA 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.
상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 개체의 염색체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조직은 뇌, 뇌신경 또는 말초 혈관일 수 있다. 상기 혈액은 말초 혈액일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 또한 상기 개체는 그로부터 분리된 조직 또는 세포를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 포유동물은 인간, 영장류, 마우스, 랫, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이 또는 그 조합일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "뇌졸중"은 다른 설명이 없는 한 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중 모두를 포함하는 의미로 사용된다.
상기 개체의 뇌졸중 진단용 조성물은 상기 하나 이상의 miRNA의 양을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질은 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항체(antagonist), 폴리뉴클레오티드 또는 그 조합일 수 있다. 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 등 당업계에 알려진 방법에 따라 선별할 수 있고, 또는 상업적으로 구매 가능한 것일 수 있다.
상기 프라이머는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합개시점을 제공하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법 (cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. PCR은 보통 열변성에 의하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA으로 변성시키는 단계, 프라이머를 상기 단일가닥 DNA에 어닐링하는 단계; 및 상기 프라이머로부터 상보적 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 등온 증폭 방법은 단일 온도 또는 증폭 과정의 주요 양상이 단일 온도에서 수행되는 방법이다. 이중가닥을 분리하기 위하여 반응 산물을 가열하여 추가적 프라이머가 결합할 수 있도록 하는 PCR과는 대조적으로, 등온 방법은 이중가닥을 분리하고 주형을 재카피하기 위하여 가닥 치환 폴리머라제 (strand displacing polymerase)에 의존한다. 등온 방법은 반복 주형 카피 (reiterative template copying)를 개시하기 위하여 프라이머의 치환에 의존하는 방법과 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법으로 구분할 수 있다. 프라이머의 치환에 의존하는 방법은 헬리카제 의존적 증폭 (helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭 (exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭 (recombinase polymerase amplification: RPA) 및 루프 매개된 증폭 (loop mediated amplification: LAMP)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법은 가닥치환증폭 (strand displacement amplification: SDA) 및 핵산 기반 증폭 (nucleic acid based amplification : NASBA 및 TMA)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 하나, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있다.
miRNA 수준 측정은 뇌졸중 유무 및 정도를 진단하기 위하여 개체의 miRNA의 존재 여부와 수준을 확인하는 과정으로서 miRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 miRNA를 직접 분리하거나, 상기 miRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이 또는 그 조합을 이용하는 것을 포함할 수 있다. RT-PCR은 RNA를 분석하는 방법으로, miRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하는 방법이다. 상기 RT-PCR 중 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 miRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 정상대조군과 비교함으로써, 개체의 뇌졸중의 유무 또는 그 발병 정도를 간편하게 판단할 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "프라이머"는 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 상기 하나 이상의 miRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 뇌졸중의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "프로브"란 표적 핵산 예를 들면, miRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 상기 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 miRNA의 발현량을 측정함으로써 개체의 뇌졸중의 유무 또는 그 발병 정도를 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 예를 들면 miRNA의 발현량을 측정할 수 있는, 뇌졸중 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 뇌졸중 진단용 마이크로어레이는 상기 miRNA를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상술한 miRNA 또는 그와 상보적 서열, 또는 그에 대응되는 핵산 서열이 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 핵산 서열은 DNA, PNA (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids), 이들의 조합, 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 키트가 예를 들면 상술한 유전자의 miRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 miRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 키트에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 다른 것에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은 이미 언급된 바와 같다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 수준을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군에서 측정된 동일한 miRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체의 뇌졸중을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 진단하는 방법은 개체로부터 분리된 시료와 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 상기 miRNA와 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체로부터 상기 시료 중의 상기 miRNA의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 수준을 대조군에서의 동일한 miRNA의 수준과 비교하는 단계; 및 상기 분리된 시료에서 측정된 상기 miRNA의 수준이 대조군의 수준과 비교하여 변화한 경우 개체가 뇌졸중에 걸린 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 복합체의 수준을 측정하여 시료 중의 상기 miRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 miRNA의 수준을 측정하는 것, 또는 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 그 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩(protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다.
상기 방법은 상기 측정된 miRNA의 수준을 대조군에서 측정된 동일한 miRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 뇌졸중에 걸리지 않은 개체일 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 개체의 상기 miRNA의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우 개체를 뇌졸중에 걸린 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 개체의 상기 miRNA 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 결정하는 단계는 상기 miRNA의 수준이 양성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 동일한 miRNA의 수준보다 낮은 경우, 상기 개체는 뇌졸중이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 상기 miRNA의 수준이 양성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 동일한 miRNA의 수준과 동등하거나 높은 경우, 상기 개체는 뇌졸중에 걸리지 않은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 이미 언급된 바와 같다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 ARG1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 ARG1 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 개체의 뇌졸중을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 뇌졸중 환자의 말초 혈액에서 miR-340-5p의 수준이 유의하게 감소하고, miR-340-5p가 ARG1의 발현을 억제하는 것을 밝혀내었다. 따라서 뇌졸중 환자의 감소한 miR-340-5p의 수준에 따라 ARG1의 수준은 증가할 것이므로, ARG1의 수준을 측정하여 뇌졸중을 진단할 수 있다.상기 방법은 ARG1 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 ARG1 단백질의 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우 개체를 뇌졸중에 걸린 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 ARG1 단백질의 수준이 음성 대조군 또는 정상 대조군에서 측정된 ARG1 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 뇌졸중에 걸린 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 ARG1 단백질의 수준을 측정하여 뇌졸중을 진단하는 방법은 상기 miRNA들의 수준을 측정하는 방법과 함께 수행하여 뇌졸중을 진단하는데 이용될 수 있다.
상기 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 이미 언급된 바와 같다.
다른 양상은 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 시료에서 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 결합 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 결합 수준을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조군의 결합 수준과 비교하는 단계; 및 상기 대조군의 결합 수준과 비교하여 상기 피검 물질이 처리된 시료의 결합 수준을 변화시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
ARG1은 대식세포에 의해 생성되는 단백질로서, 염증에 대해 항 염증 활성을 발휘한다. 본 발명자들은 뇌졸중 환자에서 miR-340-5p의 수준이 유의하게 감소하는 것과, miR-340-5p가 ARG1 mRNA 및 이에 경쟁적인 효소인 NO를 조절한다는 것을 밝혀내었다. 따라서 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 결합을 저해하는 물질은 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질이 될 수 있다. 상기 허혈성 질환 또는 염증성 질환은 뇌졸중일 수 있다.
상기 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 인공적으로 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 첨가한 시료일 수 있다. 상기 시료는 miR-340-5p 및 ARG1 유전자를 발현하는 세포를 포함하는 것일 수 있다.
상기 피검물질, ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 표지는 상기 피검 물질 또는 뉴클레오티드에 유전자 재조합 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열 내부에 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 결합 수준의 측정은 표지의 종류 또는 측정 방식에 따라 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩(protein chip), 또는 이들의 조합으로 수행할 수 있다. 또는 당업계에 알려진 방법을 이용하여, ARG1 유전자 또는 ARG1의 유전자 서열을 조작하여 표지가 연결된 ARG1 mRNA 또는 ARG1 융합 단백질을 발현하는 벡터 및 miR-340-5p를 세포에 형질 주입한 후, 피검물질을 처리하고 변화하는 ARG1 mRNA 수준 또는 ARG1 단백질 수준을 측정하는 것으로써, 상기 결합 수준을 측정할 수 있다.
상기 방법은 상기 피검 물질이 처리된 시료의 결합 수준이 무처리 대조군의 결합 수준과 비교하여 변화한 경우, 상기 피검 물질을 허혈성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 피검 물질은 상기 결합 수준을 증가시키거나 또는 감소시키는 것일 수 있다. 상기 수준의 변화는 결합 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
개체의 뇌졸중을 진단하기 위한 진단용 조성물 및 키트, 및 뇌졸중을 진단하기 위한 방법에 따르면 뇌졸중을 시료 내 유전적 변화를 이용하여 효율적으로 진단할 수 있다.
또한 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법에 따르면 상기 질환을 치료하기 위한 후보물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
도 1a는 뇌졸중 환자 및 대조군의 miRNA 마이크로어레이에서 그 발현이 FD≥2인 miRNA의 히트맵을 나타낸다(비수정 p 값<0.05).
도 1b는 TaqMan 분석으로 찾아낸 뇌졸중 환자 및 대조군의 말초 혈액 내에서 그 수준이 변화하는 8개 miRNA를 나타낸다.
도 2a는 단백질 및 miRNA 쌍을 이용하여 이중 루시퍼라제 리포터 분석을 실시하고, ARG1의 3'UTR 구조체의 루시퍼라제 활성이 miR-340-5p 모방체의 형질주입 이후 유의하게 감소하는 것을 나타낸다.
도 2b는 ARG1 3'UTR 선행 영역의 돌연변이 구조체(ARG1_3'UTR_mut1), 및 후행 영역의 돌연변이 구조체(ARG1_3'UTR_mut2)의 유전자 서열을 나타낸다.
도 2c는 ARG1_3'UTR_mut1, ARG1_3'UTR_mut2, 및 ARG1_3'UTR_mut1&2와 miR-340-5p를 이용하여 이중 루시퍼라제 리포터 분석을 실시하고, ARG1_3'UTR_mut1의 경우에만 루시퍼라제 활성이 감소하는 것을 나타낸다.
도 3a는 뇌졸중 환자에서 ARG1 mRNA가 유의하게 증가하는 것을 나타낸다.
도 3b는 miR-340-5p를 형질 주입한 세포 내에서 miR-340-5p의 수준이 약 1100배 증가하여 형질주입이 제대로 수행되었음을 나타낸다.
도 3c는 miR-340-5p를 형질 주입한 U937 세포 내에서 ARG1 mRNA가 대조군에 비해 거의 변화하지 않았음을 실시간 PCR로 확인한 것을 나타낸다.
도 3d는 miR-340-5p를 형질 주입한 U937 세포 내에서 ARG1 단백질의 양이 유의하게 줄었음을 웨스턴 블롯으로 측정한 것을 나타낸다.
도 4는 miR-340-5p를 형질 주입한 Raw 264.7 세포로부터 분비되는 일산화질소(NO)의 양이 증가함을 NO 어세이로 측정한 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. miR -340-5p의 ARG1 억제 및 이의 메커니즘 확인
1. 실험 방법
(1) 피험자
최초의 급성 허혈성 뇌졸중을 겪고 24시간 내에 센터로 방문한 환자들로부터 10개의 시료를 채취하였다. 나이 및 성별이 맞는 대조군(n=11) 또한 miRNA 마이크로어레이 분석에 이용되었다. 피험자들의 임상적 특성은 하기 표 1과 같다.
miRNA 마이크로어레이 실험에 참여한 허혈성 뇌졸중 환자 및 대조군의 임상적 특성
뇌졸중 (n=10) 대조군 (n=11) p
나이 (세) 73 (61-72) 73 (60-77) 0.34
남성 (%) 4 5 0.84
고혈압 (%) 7 5 0.49
당뇨병 (%) 1 0 0.96
고지혈증 (%) 0 1 0.96
흡연 (%) 4 1 0.25
뇌졸중의 병인
LAA
CE
5
5
-
-
-
-
시료 채취 시간 (hrs) 13.5 (10.0-18.0) - -
연속적 변수들은 중앙값 및 사분위 범위(괄호)로 나타냄.
약기: LAA; 큰 동맥 죽상경화증(large-artery atherosclerosis), CE: 심장색전증(cardioembolism)
뇌졸중 그룹에서, 허혈성 뇌졸중은 뇌졸중과 관련한 급성 신경학적 결손을 기반으로 진단하였고, 자기 공명 촬영한 뇌 확산-강조 영상에서의 급성 뇌경색이 존재하는 것으로 확정하였다. 모든 피험자의 혈관위험인자(vascular risk factor)(예를 들면, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 흡연) 과거 병력에 대하여 동일한 신경학자가 조사하였다. 혈관위험인자의 빈도는 두 그룹 사이에 유사하였다(표 1). 모든 피험자들로부터 동의서를 얻었으며, CHA 분당 메디컬 센터(IRB no.: BD2011-121D)의 임상 시험 심사위원회로부터 임상 시험 계획서를 승인 받았다.
(2) RNA 분리
증상 발현 후 24시간 내에 전주 정맥(antecubital vein)으로부터 총 5 mL의 전혈을 채취하였다(채취 시간 중앙값: 13.5h, 사분 범위(IQR): 뇌졸중 증상 발현 후 10.0 - 18.0h). 혈액 시료는 PaxGene 혈액 RNA 튜브(Qiagen, CA, USA)에 저장하였다. 총 RNA는 Trizol(Invitrogen Life Technologies, CA, USA)을 이용하여 추출하였고 RNeasy 칼럼(Qiagen, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. DNase 소화 및 정리 절차가 완료된 후, RNA 시료를 정량화하고 분취하여 -80℃에서 사용할 때까지 저장하였다. RNA 순도 및 무결성(integrity)은 변성 겔 전기영동으로 평가하였고, 260 및 280 nm에서의 광학 밀도 비(OD260/280)는 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여 측정하였다(Agilent Technologies, CA, USA). 모든 시료의 OD260/280 비는 1.8 내지 2.2 범위 안이었다. 음성 대조군, 백그라운드(background), 및 노이즈 신호는 모든 어레이에서 낮았던(<200) 반면, 하우스키핑(housekeeping)(>15,000) 및 비오틴(biotin)(>30,000) 신호는 높았다.
(3) miRNA 마이크로어레이
miRNA 마이크로어레이는 Illumina Human Micro RNA Expression Profiling Assay V2(Illumina, CA, USA)를 이용하여 수행하였고, 이는 1,146 개의 인간 miRNA를 표적으로 한다. 비오틴화(biotinylated) cDNA는 제조사의 프로토콜(Illumina, CA, USA)에 따라 고-효율 유전자 발현 프로파일링(cDNA-매개 어닐링, 선별, 연장 및 결찰 분석: DASL)을 이용하여 0.2 - 1 μg 총 RNA로부터 제조하였다. 혼성화를 위해, 형광 라벨된 cDNA PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina Sentrix Beadchip U1536-16과 혼성화하였다. 그 어레이는 BeadArray Reader 상에서 스캔하였고, 자동 이미지 등록 및 강도 추출 소프트웨어를 각각의 miRNA에 대해 상응하는 비드 유형별 강도 데이터를 도출하기 위해 사용하였다.
(4) 마이크로어레이 시험의 데이터 처리
혼성화의 질 및 전반적인 어레이의 성과는 내부 질 관리 검사(internal quality control check) 및 최초(raw) 스캔된 데이터 모두를 육안으로 검사하여 모니터링하였다. 최초 데이터는 제조사로부터 제공된 소프트웨어(Illumina BeadStudio v3.1.3; Gene Expression Module v3.3.8)를 이용하여 추출하였다. 선별된 유전자 신호 값은 분위 방법(quantile method)을 이용하여 대수적으로(logarithmically) 전환 및 정규화(normailized)하였다. Student's t-test를 수행하고 배수차(FD)를 계산하였다. 통계적 유의성은 다중 비교 가설에 대한 오류 발견율(false discovery rate: FDR) 수정을 이용하여 조정하였다.
허혈성 뇌졸중 특이 miRNA는 어레이 분석 결과에서 정상 대조군에 비해 발현 차이가 2배 이상으로 유의한 통계적 수준(p<0.05)을 보이는 miRNA로 정의하였다.
완전 연결법(complete linkage) 및 유사도의 척도로서 유클리드 거리(Euclidean distance)를 이용하여 계층적 군집 분석(Hierarchical cluster analysis)을 수행하였다. 다르게 발현되는 유전자들의 모든 데이터 분석 및 영상화는 ArrayAssist(Stratagene, CA, USA) 및 R statistical language v. 2.4.1을 이용하여 수행하였다.
(5) TaqMan miRNA 분석
마이크로어레이 데이터로부터 얻은 선별된 miRNA들의 발현은 마이크로어레이 데이터의 검증을 위해 TaqMan miRNA 분석(Applied Biosystems, CA, USA)을 이용하여 정량화하였다. 그 중 miRNA 마이크로어레이에서 발현차를 보인 특이 miRNA들 중 miR-186-5p, miR-19a-3p, miR-32-5p, miR-340-5p, miR-579-3p, let-7e, miR-362-3p, 및 miR-1238-5p를 대상으로 TaqMan 분석을 시행하여 다시 한번 발현차를 확인하였다. 이용된 프라이머들은 하기 표 2와 같다.
miRNA 분석에 이용된 프라이머
프라이머 서열
miR-186-5p 5'-CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU-3' (서열번호 1)
miR-19a-3p 5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3' (서열번호 2)
miR-32-5p 5'-UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA-3' (서열번호 3)
miR-340-5p 5'-UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU-3' (서열번호 4)
miR-579-3p 5'-UUCAUUUGGUAUAAACCGCGAUU-3' (서열번호 5)
let-7e 5'- UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3' (서열번호 6)
miR-362-3p 5'-AACACACCUAUUCAAGGAUUCA-3' (서열번호 7)
miR-1238-5p 5'-GUGAGUGGGAGCCCCAGUGUGUG-3' (서열번호 8)
miRNA 발현 분석을 위해서, 10 ng의 총 RNA를 miRNA-특이적 프라이머와 함께 TaqMan miRNA 분석에 이용하였다. 맞춤형 역전사 프라이머들을 성숙 miRNA 서열에 상보적으로 합성하였다. 상보적인 DNA 주형은 RNA6에 표준화하였고 제조사의 지시에 따라 40 PCR 사이클을 수행하였다. 데이터는 CFX Manager 소프트웨어(Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 얻었다. 각 실험은 각각의 miRNA에 대해서 3회 수행하였고, 통계적 분석에는 그 평균 값을 이용하였다. FD는 상대적 임계 사이클 방법(comparative threshold (CT) cycle method)을 이용하여 계산한 2- ddCt 값으로 나타냈다. 유효성(validation)은 비모수적 Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 검증하였고, 유의성(significance)은 p<0.05인 것으로 간주하였다.
(6) 선별된 miRNA들의 표적 유전자 예측
마이크로어레이 데이터로부터 31 miRNA들(FD≥2, 수정 p<0.05)의 추정되는 표적들을 선별하기 위해 먼저 miRBase(miRBase Release ver. 20., http://www.mirbase.org/), TargetScan(TargetScan Human ver. 6.2, http://www.targetscan.org/), 또는 MicroCosm Target (MicroCosm Targets ver. 5., http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v5)와 같은 표적 예측 소프트웨어에서 적어도 7 mer의 시드 매치(seed match)가 있는 표적 후보군을 탐색하였다. 문헌 등을 통해 급성 뇌졸중의 병태 생리와 연관이 있다고 알려진 후보군 유전자들을 탐색하였고, 특히 이전의 마이크로어레이 연구에서 말초 혈액 내에서 발현이 달라지는 유전자들에 초점을 두었다.
(7) 이중(dual) 루시퍼라제 리포터 분석
XbaI가 부착된 ARG1의 3'UTR 서열 또는 인터류킨-18 리셉터1(IL18R1) mRNA를 HiPiTM Plus Taq(ELPIS biotech, Korea)를 이용하여 증폭시키고 pmirGLO 벡터(Promega, WI, USA)로 클로닝 하였다. miRNA 모방체(mimic)(모의품(mock), 음성 대조군[N.C.], miR-186-5p, miR-340-5p, miR-19a-3p)들은 Genolution Pharmaceuticals, Inc.(Genolution, Korea)로부터 구매하였다. 형질주입 24시간 전에 HeLa 세포(ATCC, VA, USA) 500만개를 24웰 배양 디시에 플레이팅하였다. pmirGLO-3'UTR 벡터 80 ng(ARG1 및 IL18R1에 대한) 및 상응하는 miRNA 모방체 80 nM을 리포펙타민 3000(Invitrogen, Ca, USA)을 이용하여 세포에 형질주입하였다. miR-340-5p는 ARG1의 3'UTR(ARG1 mRNA의 3'UTR의 396-402 nt(선행 영역) 및 409-416 nt(후행 영역))에 대한 두 개의 결합 부위를 가지고 있는 것으로 추정되었고, 본 발명자들은 ARG1 3'UTR의 돌연변이 구조체의 형질 주입 후 ARG1의 루시퍼라제 활성을 측정하였다. pmirGLO-ARG1 돌연변이는 하기 표 3의 프라이머와 Muta-direct site-directed Mutagenesis kit(Intron biotechnology, korea)를 이용하여 만들었다.
ARG1 돌연변이를 제조하기 위한 프라이머
프라이머 서열
ARG1 3'UTR_mut 1
(선행 영역)
정방향 GTCATTCAAAAAATGTGATTTCCCGCGATAAACTCTTTATAAC (서열번호 9)
역방향 GTTATAAAGAGTTTATCGCGGGAAATCACATTTTTTGAATGAC (서열번호 10)
ARG1 3'UTR_mut 2
(후행 영역)
정방향 TTTTTTATAATAAACTGCCCGCGACAATCTAGAGTCGACCTGC (서열번호 11)
역방향 GCAGGTCGACTCTAGATTGTCGCGGGCAGTTTATTATAAAAAA (서열번호 12)
ARG1_3' UTR_mut 1&2
(두 영역 모두)
정방향 CCCGCGATAAACTGCCCGCGACAATCTAGAGTCG (서열번호 13)
역방향 CGACTCTAGATTGTCGCGGGCAGTTTATCGCGGG (서열번호 14)
형질 주입 24시간 후, 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 이중-루시퍼라제 분석 시스템(Promega, WI, USA)를 이용하여 측정하였고, 발광(luminescence)을 VICTOR 분석기(PerkinElmer, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이들 시험은 다른 날에 3번 독립적으로 수행하였다.
(8) 실시간 PCR 분석
5백만 U937 세포(ATCC, VA, USA)를 24웰 배양 디시에 플레이팅하고, 단핵구를 대식세포로 분화시키기 위해 PMA(5 μg)를 처리하였다. PMA 처리 48시간 후, hU937 세포는 대식 세포의 마커인 CD11b mRNA가 11배 증가하여 대식 세포의 전형적인 형태를 나타냈다. 대식 세포 분화 후 miR-340-5p 모방체(100 μg)를 리포펙타민 3000을 이용하여 U937 세포에 형질주입하였다. 형질 주입 24시간 후, 총 RNA를 SuperScript® II First-Strand Synthesis System(Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 상보적 DNA 가닥으로 역전사하였다. ARG1 mRNA의 발현은 CFXTM 실시간 시스템(Bio-Rad, CA, USA) 및 Quantitect® SYBR Green PCR kit(Qiagen, CA, USA)를 이용하여 정량화하였다. ARG1 mRNA의 RT 프라이머는 하기 표 4와 같다.
ARG1 mRNA RT 프라이머
프라이머 서열
ARG1 mRNA RT 프라이머
정방향 TCTGTGGGAAAAGCAAGCGA (서열번호 15)
역방향 TTGCCAAACTGTGGTCTCCG (서열번호 16)
데이터는 GAPDH에 대해 정규화하였고 사이클 임계(2- ddct) 방법을 이용하여 계산하였다. 각각의 실험은 다른 날에 3번 수행하였다.
(9) 웨스턴 블롯 분석
miR-340-5p 모방체 형질 주입 48시간 후, 단백질 용해 버퍼(PRO-PREP™, Intron Biotechnology, Korea)로 U937 세포를 용해시켰고, 제조사의 프로토콜에 따라 면역 블롯 분석을 수행하였다. 모든 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고 ARG1의 1차 항체(Abcam, Cambridge, UK) 및 내부 대조군(internal control)으로서 GAPDH를 이용하여 면역 블롯하였다. 밴드의 정량화는 NIH 이미지 J 프로그램을 이용하여 수행하였다. 각각의 실험은 다른 날에 3번 수행하였다.
(10) 일산화질소(NO) 분석
miR-340-5p 또는 miR-340-5p의 안티 센스를 마우스 대식 세포에 24시간 형질 주입한 후, NO 분석을 수행하였다. 형질 주입 후, 세포를 지질다당류(LPS) 200 ng/ml를 포함하는 새로운 배양액으로 더 처리한 후, 각각 0, 6, 24 및 24시간 동안 배양하였다. 각 시간에서 총 3 mL의 배양액을 채취하였다. 채취한 배양액은 Griess 분석 키트(Promega, WI, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 존재하는 NO의 양을 측정하였다. 요약하면, 50 μL의 배지를 50 μL의 Griess 시약 Ⅰ(설파닐아미드)를 포함하는 96 웰 플레이트로 이동시켰다. 그 혼합물을 혼합하고 10분간 배양하였다. 상기 배양 이후, 50 μL의 Griess 시약 Ⅱ(N-1-나프틸에틸렌디아민 디히드로클로리드)를 더 추가하고 상온에서 10분간 반응하게 두었다. 그 혼합물의 540 nm에서의 흡광도를 플레이트 리더기를 이용하여 판독하였다. 표준 곡선은 0.1 M 아질산 나트륨(sodium nitrite)의 2배 희석도로 작성하였다.
(11) 통계적 분석
정량적 실시간 PCR 데이터 및 웨스턴 블롯에서 얻은 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타냈다. Mann-Whitney U 검사로 실험 결과 및 대조군 값을 비교하였다. 0.05 미만의 p 값(p<0.05)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계적 분석은 MedCalc 통계 소프트웨어(MedCalc software, ver. 11.6., Mariakerke, Belgium)를 이용하여 검사하였다.
2. 급성 뇌졸중 환자의 말초 혈액 내 miRNA들의 발현 변화 확인
miRNA 마이크로어레이에서 1,146 중 810 miRNA가 말초 혈액에서 탐지되었다. 도 1a는 대조군 및 뇌졸중군 사이에서 그 발현이 FD≥2인 miRNA의 히트맵을 나타낸다(비수정 p 값<0.05). FDR 수정 후, 하기 표 5와 같이 총 30 miRNA가 급성 허혈성 뇌졸중 환자 및 대조군의 말초 혈액에서 이들의 발현이 유의하게 다른 것으로 나타났다.
뇌졸중 환자 및 대조군의 miRNA 마이크로어레이에서 유의한 수준의 변화를 나타낸 miRNA
miRNA FDa p*
hsa-miR-579-3p -4.43 0.021
hsa-miR-140-5p -3.00 0.033
hsa-miR-186-5p -2.80 0.005
hsa-miR-301a-3p -2.57 0.042
hsa-miR-18b-5p -2.56 0.015
hsa-miR-19a-3p -2.49 0.012
hsa-miR-362-3p -2.43 0.026
hsa-miR-32-5p -2.43 0.014
hsa-miR-340-5p -2.27 0.036
hsa-miR-142-3p -2.24 0.026
hsa-miR-144-3p -2.24 0.047
hsa-miR-660-5p -2.10 0.033
hsa-miR-335-5p -2.08 0.026
hsa-miR-517b-3p -2.01 0.018
hsa-miR-664a-5p 2.04 0.045
hsa-miR-1301-3p 2.08 0.021
solexa-7534-111 2.09 0.025
hsa-miR-1270 2.11 0.026
hsa-miR-628-5p 2.11 0.009
HS_22.1 2.15 0.039
HS_10 2.20 0.017
hsa-miR-1294 2.25 0.017
hsa-miR-1229-3p 2.34 0.026
hsa-let-7e 2.44 0.004
hsa-miR-877-5p 2.51 0.021
hsa-miR-505-5p 2.54 0.034
HS_108.1 2.78 0.017
hsa-miR-1238-5p 3.08 0.016
solexa-3464-254 3.40 0.013
hsa-miR-544a 3.40 0.032
a 상기 대조군은 기준(reference)으로 간주된다The control group is regarded as a reference
b 오류발견율 수정 후 통계적으로 유의(FDR-p < 0.05)
약기: FD: 배수 차이
이들 중, 16개 miRNA(miR-544a, solexa-3464-254, miR-1238-5p, HS_108.1, miR-505-5p, miR-877-5p, let-7e, miR-1229-3p, miR-1294, HS_10, HS_22.1, miR-628-5p, miR-1270, solexa-7534-111, miR-1301-3p, 및 miR-664a-5p)가 뇌졸중 환자에서 높은 발현을 보였고, 14개 miRNA(miR-579-3p, miR-140-5p, miR-186-5p, miR-301a-3p, miR-18b-5p, miR-19a-3p, miR-362-3p, miR-32-5p, miR-340-5p, miR-142-3p, miR-144-3p, miR-660-5p, miR-335-5p, 및 miR-517b-3p)가 뇌졸중 환자에서 낮은 발현을 나타냈다.
마이크로어레이 데이터의 발현 패턴을 확인하기 위해 8개 miRNA(miR-186-5p, miR-19a-3p, miR-32-5p, miR-340-5p, miR-579-3p, let-7e, miR-362-3p, 및 miR-1238-5p)에 대한 TaqMan 분석을 수행하였다. 도 1b와 같이 miR-186-5p(뇌졸중 vs. 대조군: 1.83 vs. 2.89, p=0.024), miR-32-5p(뇌졸중 vs. 대조군: 2.04 vs. 3.10, p=0.024), miR-340-5p(뇌졸중 vs. 대조군: 2.38 vs. 3.39, p=0.049), 및 miR-579-3p(뇌졸중 vs. 대조군: 2.67 vs. 3.52, p=0.029)의 발현이 뇌졸중 그룹에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 반면, let-7e(뇌졸중 vs. 대조군: 2.34 vs. 1.63, p=0.012)의 발현은 뇌졸중 그룹에서 대조군에 비해 높았다.
miR-19a-3p, miR-362-3p, 및 miR-1238-5p은 급성 허혈성 뇌졸중 및 대조군 사이에서 발현의 차이를 보이지 않았다.
3. miRNA 및 이들의 표적 유전자 선별
표적 유전자 예측 프로그램을 이용하여 유의하게 변화하는 miRNA들의 추정되는 표적들을 선별하여, 하기 표 6과 같이 4개의 miRNA 및 이들의 추정되는 표적 유전자들을 선별하였다.
miRNA 및 표적 유전자 예측 프로그램을 이용하여 추정되는 miRNA의 표적
miRNA 유전자 결합 부위
(3'UTR 내)		 시드 매치a
mirSVR 점수b
이름 이름
miR-340-5pc ARG1 409-416 8 mer -1.2384
396-402 7 mer-1A -0.3382
miR-186-5p ARG1 93-99 7 mer-1A -0.0758
miR-19a-5p IL18R1 1246-1253 8 mer -0.2746
miR-186-5p IL18R1 229-235 7 mer-8 mer -0.3496
a TargetScanHuman software (http://www.targetscan.org)를 이용하여 얻음
b microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)로부터 얻음
c two binding sites present in ARG1의 3' UTR 영역 내 존재하는 두 결합 부위
약기: ARG1: arginase-1, IL18R1: interleukin-18 receptor 1
표적 유전자들은 그에 상응하는 miRNA와 적어도 7 mer의 시드 매치 부위를 갖는 것으로 예측되었다. 상기 기재한 바와 같이, ARG1의 3'UTR에 miR-340-5p가 결합할 수 있는 두 개의 부위가 있고, ARG1의 후행 영역은 선행 영역보다 miR-340-5p와의 결합력이 더 강할 것으로 예측되었다. 또한, ARG1의 후행 영역은 포유류에서 진화적으로 보존된 영역으로 예측되었다.
ARG1은 대식 세포에 의해 생성되며, 항-염증 활성을 나타낸다. ARG1 mRNA는 마이크로어레이 연구를 통해 말초 혈액 내에서 지속적으로 상향 조절되는 것으로 보고되었다. IL18R1은 IL-1 상과(superfamily)에 속하는 인터류킨-18(IL-18)에 대한 수용체이다. IL-18은 염증 촉진성 사이토카인의 하나로서 염증 및 죽상경화증(atherosclerosis)을 유도한다. 혈청의 IL-18 및 IL18R1은 뇌졸중 환자에서 증가한다. 이러한 발견은 뇌졸중으로 유도되는 말초 염증 반응에서의 ARG1 및 IL18R1의 주요한 역할을 암시한다.
4. miR -340-5p의 표적 유전자가 ARG1임을 확인
선별된 miRNA들의 표적을 확인하기 위하여 4개의 후보군 쌍(ARG1 및 miR-340-5p, ARG1 및 miR-186-5p, IL18R1 및 miR-19-3p, ARG1 및 miR-186-5p)에 대한 이중 루시퍼라제 리포터 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2a와 같이 ARG1의 3'UTR 구조체의 루시퍼라제 활성은 miR-340-5p 모방체의 형질주입 이후 유의하게 감소하였다.
ARG1 mRNA의 3'UTR은 두 개의 결합 부위를 가지는 것으로 예측되었기 때문에, 도 2b와 같은 ARG1 3'UTR 선행 영역의 돌연변이 구조체(ARG1_3'UTR_mut1), 후행 영역의 돌연변이 구조체(ARG1_3'UTR_mut2) 및 선행 영역 및 후행 영역 모두의 돌연변이 구조체(ARG1_3'UTR_mut1&2)로 상기와 동일하게 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과 도 2c와 같이 ARG1_3'UTR_mut1의 형질 주입이후에만 루시퍼라제 활성이 감소하였다. 대조적으로 ARG1_3'UTR_mut2 및 ARG1_3'UTR_mut1&2의 형질주입 후에는 루시퍼라제의 활성이 변하지 않았다. 이로서 miR-340-5p은 ARG1 mRNA의 3'UTR의 후행 영역(409-416)에 결합함을 확인하였다.
5. miR -340-5p가 ARG1의 발현을 번역 억제(translational repression)로 조절함을 확인
뇌졸중 환자의 혈액 내의 miR-340-5p 및 ARG1 유전자의 발현 패턴을 실시간 PCR로 측정하였다. 상기 기재된 바와 같이, miR-340-5p은 뇌졸중 환자의 말초 혈액에서 유의미하게 하향 조절된다. 반면, 도 3a와 같이 ARG1 유전자의 발현은 뇌졸중 환자의 말초 혈액에서 유의미하게 증가된다(뇌졸중 군 vs. 정상대조군: 1.79 vs. 0.67, p=0.024).
miR-340-5p이 ARG1의 발현을 mRNA 분해 또는 번역 억제 중 어떠한 방법으로 조절하는지 알아보기 위해, miR-340-5p 모방체를 U937 세포에 형질주입한 후 ARG1 mRNA와 ARG1 단백질의 양의 변화를 측정하였다. 먼저 형질주입 24시간 후, 도 3b와 같이 miR-340-5p의 양은 음성 대조군에 비해 약 1100배 증가하는 것을 확인하여(p<0.05), 형질주입이 제대로 수행되었음을 확인하였다. 동시에 도 3c와 같이 실시간 PCR로 ARG1 mRNA의 양이 대조군에 비해 거의 변화하지 않았음을 확인하였다. 반면 도 3d와 같이 ARG1 단백질의 양을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과 유의하게 감소하였음을 확인하였다. 따라서 miR-340-5p은 ARG1 유전자의 발현을 번역 후 수준에서 번역 억제 메커니즘으로 조절함을 확인하였다.
6. miR -340-5p가 대식세포로부터의 NO 및 염증성 사이토카인의 방출을 조절함을 확인
miR-340-5p가 염증 세포에서 ARG1-매개 염증 반응을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 LPS 처리 대식세포에서의 NO 생성 및 염증성 사이토카인에 대한 miR-340-5p의 효과를 조사하였다.
NO 분석에서는, 도 4에서와 같이 LPS 처리 48시간 후 대식세포(Raw 264.7)에서 NO의 방출이 확실히 증가함을 확인하였다. LPS 처리 전 miR-340-5p으로 형질주입한 경우에는 LPS 처리 48시간 후 대조군보다 더 높은 NO 수준을 나타냈다. 그러나 LPS 처리 전 항-miR-340-5p을 형질주입한 경우에는 대조군과 비교하여 NO 수준에 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 대식세포에서의 miR-340-5p의 과발현이 NO 생성을 증가시킴을 나타내고, 또한 miR-340-5p를 녹다운 시키면 NO 생성 증가 효과가 사라졌다.
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> composition for diagnosing stroke and method for diagnosing stroke <130> PN113026 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-186-5p primer <400> 1 caaagaauuc uccuuuuggg cu 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-19a-3p primer <400> 2 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-32-5p primer <400> 3 uauugcacau uacuaaguug ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-340-5p primer <400> 4 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-579-3p primer <400> 5 uucauuuggu auaaaccgcg auu 23 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7e primer <400> 6 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-362-3p primer <400> 7 aacacaccua uucaaggauu ca 22 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1238-5p primer <400> 8 gugaguggga gccccagugu gug 23 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 1 forward primer <400> 9 gtcattcaaa aaatgtgatt tcccgcgata aactctttat aac 43 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 1 reverse primer <400> 10 gttataaaga gtttatcgcg ggaaatcaca ttttttgaat gac 43 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 2 forward primer <400> 11 ttttttataa taaactgccc gcgacaatct agagtcgacc tgc 43 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 2 reverse primer <400> 12 gcaggtcgac tctagattgt cgcgggcagt ttattataaa aaa 43 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 1&2 forward primer <400> 13 cccgcgataa actgcccgcg acaatctaga gtcg 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 3'UTR_mut 1&2 reverse primer <400> 14 cgactctaga ttgtcgcggg cagtttatcg cggg 34 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 mRNA RT forward primer <400> 15 tctgtgggaa aagcaagcga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARG1 mRNA RT reverse primer <400> 16 ttgccaaact gtggtctccg 20 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 17 uucauuuggu auaaaccgcg auu 23 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 18 cagugguuuu acccuauggu ag 22 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 19 caaagaauuc uccuuuuggg cu 22 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 20 cagugcaaua guauugucaa agc 23 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 21 uaaggugcau cuagugcagu uag 23 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 22 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 23 aacacaccua uucaaggauu ca 22 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 24 uauugcacau uacuaaguug ca 22 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 25 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 26 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 27 <211> 20 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 27 uacaguauag augauguacu 20 <210> 28 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 28 uacccauugc auaucggagu ug 22 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 29 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 30 aucgugcauc ccuuuagagu gu 22 <210> 31 <211> 24 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 31 acuggcuagg gaaaaugauu ggau 24 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 32 uugugaagaa agaaauucuu ac 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> solexa-7534-111 <400> 33 uugugaagaa agaaauucuu ac 22 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 34 cuggagauau ggaagagcug ugu 23 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 35 augcugacau auuuacuaga gg 22 <210> 36 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS_22.1 <400> 36 ccaaggaagg cagcaggc 18 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS_10 <400> 37 acuggagaua uggaagagcu g 21 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 38 ugugagguug gcauuguugu cu 22 <210> 39 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 39 cucucaccac ugcccuccca cag 23 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 40 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 41 guagaggaga uggcgcaggg 20 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 42 gggagccagg aaguauugau gu 22 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS_108.1 <400> 43 ugagguagua gguggugug 19 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 44 gugaguggga gccccagugu gug 23 <210> 45 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> solexa-3464-254 <400> 45 uagcugguug uccaaga 17 <210> 46 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 46 auucugcauu uuuagcaagu uc 22

Claims (10)

  1. 개체로부터 분리된 시료 중 hsa-miR-340-5p miRNA의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 뇌졸중 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 수준을 측정하기 위한 제제를 더 포함하는 것인 개체의 뇌졸중 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 miRNA 서열 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 그 조합인 것인 개체의 뇌졸중 진단용 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물을 포함하는, 개체의 뇌졸중 진단용 키트.
  5. 개체로부터 분리된 시료 중의 hsa-miR-340-5p 의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 hsa-miR-340-5p의 수준을 대조군에서 측정된 hsa-miR-340-5p의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 개체의 뇌졸중을 진단하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 방법은 hsa-miR-579-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-664a-5p, hsa-miR-1301-3p, solexa-7534-111, hsa-miR-1270, hsa-miR-628-5p, HS_22.1, HS_10, hsa-miR-1294, hsa-miR-1229-3p, hsa-let-7e, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-505-5p, HS_108.1, hsa-miR-1238-5p, solexa-3464-254 및 hsa-miR-544a로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 miRNA의 수준을 대조군에서 측정된 동일한 miRNA의 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것인 개체의 뇌졸중을 진단하는 방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 시료 중에 측정된 miRNA의 수준이 정상 대조군의 동일한 miRNA 수준보다 낮은 경우, 상기 개체는 뇌졸중에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 개체로부터 분리된 시료 중의 ARG1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
    상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 ARG1 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 개체의 뇌졸중을 진단하는 방법.
  9. miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 피검 물질과 접촉한 시료에서 miR-340-5p 및 ARG1 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 또는 ARG1 mRNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드의 결합 수준을 측정하는 단계;
    상기 측정된 결합 수준을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조군의 결합 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 대조군의 결합 수준과 비교하여 상기 피검 물질이 처리된 시료의 결합 수준을 변화시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 질환은 뇌졸중인 것인 방법.
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CN111733250A (zh) * 2020-07-30 2020-10-02 上海思路迪医学检验所有限公司 一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂及应用
KR20210035715A (ko) * 2019-09-24 2021-04-01 건국대학교 글로컬산학협력단 근육질환 및 혈관질환 진단용 마커로서의 miR-5739의 용도

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102140581B1 (ko) * 2019-08-13 2020-08-03 중앙대학교 산학협력단 뇌경색 아형 진단용 바이오마커 조성물
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