CN110257526A - 一种检测gp5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法，包括GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液和侧向流核酸检测试纸。基于PCR方法对GP5基因5’端甲基化进行识别与扩增，对扩增产物进行标记后，结合侧向流技术，对GP5基因5’端甲基化进行检测。本发明的有益效果是，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测GP5基因5’端甲基化，适合推广应用和产业化。

Description

一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法。

背景技术

乳腺癌(BC)是女性中最常见的恶性肿瘤，每年导致超过50万人死亡。目前，随着医学的进步，特别是在I期和II期乳腺癌中，5年生存率相当可观。但由于许多乳腺癌患者相对年轻。乳腺癌的高复发和转移仍然是患者治愈路上的主要障碍。

近年来，很多研究表明，某些基因的DNA甲基化与乳腺癌的发展密切相关。基因组中异常的DNA甲基化可能通过沉默多种肿瘤抑制基因而促成恶性转化。这种表观遗传改变被认为发生在肿瘤发展的早期，可能先于遗传改变。其中，由伦敦大学学院于2018年领导的一项研究发现，乳腺癌样本中名为EFC#93的DNA区域显示异常的DNA甲基化模式。EFC#93区域位于GP5基因N端临近信号肽的部分，即LRRNT区域，该区域异常的甲基化与转移性乳腺癌有关。

该研究显示，GP5基因5’端甲基化和CTC均为阳性的BC患者，其5年内复发率高于70％。因此，该研究认为血清中，GP5基因5’端甲基化异常可以作为转移性乳腺癌患者的检测指标，特异性可高达88％，最多可将诊断时间提前1年。

从血清中检测游离DNA的甲基化异常，要求检测方法具有极高的灵敏度和特异性。目前常见的方法有MSP、Methylight和Heavymethyl。其中MSP是最常见的方法，但容易出现假阳性。而Methylight和Heavymethyl均是基于荧光PCR，需要昂贵的仪器和复杂的操作、分析流程。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提出一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒及其检测方法，可用于体外定性检测转移性乳腺癌患者血清、血浆中GP5基因5’端的甲基化，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测GP5基因5’端甲基化，适合推广应用和产业化。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，包括人GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液和侧向流核酸检测试纸；所述GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液包括甲基化DNA处理组分、GP5基因5’端甲基化特异性引物组、热稳定性DNA聚合酶、UNG酶和反应缓冲液，所述侧向流核酸检测试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

所述甲基化DNA处理组分为亚硫酸盐溶液或甲基化依赖性的限制内切酶；所述亚硫酸盐溶液包括3-5M亚硫酸氢钠、5％-10％乙二醇二甲醚和5-10mM氢醌；所述甲基化依赖性的限制内切酶为MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一种或几种。

所述GP5基因5’端甲基化特异性引物组包括上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物，所述上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物序列为：GCACATCCTGCTCTT，且序列5’端连有接头引物，3’端有修饰基团，所述上游通用扩增引物序列为：TTCCAAGCCTTCGCCACCTCCATC，所述下游基因特异性引物序列为：GCCGCGGCCCATTCCG。

所述上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物5’端接头引物为一“发卡结构”接头，所述接头序列为GTCGTATCCAGTGCTTCCAAGCCTTCGCCACCTCCATCGCACTGGATACGAC，所述3’端修饰为LNA、磷酸化修饰、ddC或C3Spacer中的任意一种。

所述上游通用扩增引物的5′端标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5中的任意一种，所述下游基因特异性引物的5′端标记生物素。

所述结合垫喷涂有修饰的纳米彩色乳胶微球，所述修饰为链酶亲和素。

所述硝酸纤维素膜检测区包括一条C线和两条T线。

所述C线包被的是生物素-BSA，所述T线包被的是地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体、Cy5抗体的任意一种。

第二方面，本发明提供一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:针对待检测样本基因组DNA设计上下游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物和上下游通用扩增引物，在上游通用引物的5′端标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5，下游通用引物的5′端标记生物素，同时针对待检测样本基因组DNA的Actb基因设计内参引物，上游引物5′端分别标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5，下游引物的5′端标记生物素；

S2:对待检测样本基因组DNA进行亚硫酸盐处理或酶切处理，如果采用酶切处理，则可与PCR反应同管进行；

S3:对处理后的DNA进行PCR反应，首先特异性识别引物只与甲基化的DNA结合并延伸，形成具有“发卡结构”的产物，随后通用引物与“发卡结构”的环状部分结合，进行PCR扩增；

S4:取出PCR产物滴至核酸检测层析试纸的样品垫上进行检测，通过层析作用上移至T线和C线处，当C线和用于内参检测的T线显色，说明实验结果有效，此时，若用于甲基化检测的T线显色则说明人GP5基因5’端甲基化阳性。

本发明的有益效果是：

1、首次采用基于纳米彩色乳胶微球的侧向流核酸检测试纸来检测GP5基因5’端甲基化。此步设计的优势在于：利用纳米彩色乳胶微球作为核酸甲基化检测的载体，在保证较高的灵敏度的同时，避免时使用昂贵的仪器，使得结果分析简便、直观、清晰。

2、首次引入了接头引物和通用引物来检测GP5基因5’端甲基化；此步设计的优势在于：(1)如果采用亚硫酸盐溶液来处理DNA，未被甲基化的C碱基会变成U碱基，因此引物GC含量会比较低，引物与模板结合的效率和特异性更会变差，因此采用接头引物和通用引物后，只有在PCR反应的第一个循环会用GC含量低的引物去识别，在随后的PCR反应则由通用引物完成，因此反应的灵敏度和特异性更好；(2)如果采用甲基化依赖性的限制内切酶来处理DNA，则甲基化的DNA会在识别位点处发生断裂而非甲基化的DNA不断裂，采用接头引物则可以与断裂后的甲基化DNA互补并发生反向延伸，而与非甲基化的DNA则不会发生延伸，因此可以通过通用引物对DNA甲基化的状态进行检测；(3)与“线性接头”引物相比，“发卡结构”接头引物产生的片段会发生自身互补，从而阻止了接头引物与通用引物在模板结合时的竞争抑制，增强了反应的灵敏性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本发明所述侧向流核酸检测试纸侧面剖开结构示意图；

图1B是本发明所述侧向流核酸检测试纸平面结构示意图；

图2是本发明所述检测GP5基因5’端甲基化检测方法结果图。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行具体描述。

实施例1：侧向流核酸检测试纸的制备

参见附图1A，其中，SP:样品垫CP:结合垫NM:硝酸纤维素膜检测区AP:吸水垫。

(1)硝酸纤维素膜检测区的制备：

将硝酸纤维素检测膜切成长条，置于喷点仪平台上，分别将地高辛单抗、FITC单抗和生物素-BSA喷点于检测膜上，形成T1、T2和C线。42℃干燥30min或室温自然干燥。

(2)结合垫的制备：

将玻璃棉切成长条，置于喷点仪平台，取纳米颗粒标记物，加入一定体积预处理液，喷点于玻璃棉，50℃干燥30min。

(3)样品垫的制备：

将玻璃棉切成长条，用一定体积预处理液浸泡，50℃干燥30min。

(4)试纸条的组装：

在试纸条的支撑板上依次贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

实施例2：亚硫酸盐溶液处理DNA

(1)使用商品化DNA提取试剂盒或其它适宜的方法提取人基因组DNA；

(2)取10μL DNA溶液(100ng-2μg)和90μL亚硫酸盐溶液，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应；

(3)反应条件如下：

第一阶段：95℃5min，1个循环,；

第二阶段：95℃30S，70℃10min，15个循环；

(4)使用商品化DNA纯化试剂盒或其它适宜的方法纯化DNA。

实施例3：甲基化依赖性的限制内切酶处理DNA

(1)使用商品化DNA提取试剂盒或其它适宜的方法提取人基因组DNA；

(2)取10μL DNA溶液(100ng-2μg)、5μL 10x反应缓冲液，2U甲基化依赖性的限制内切酶和35μL去离子水，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应；

(3)反应条件如下：

第一阶段：30℃1hr，1个循环,；

第二阶段：70℃15min，1个循环。

实施例4：GP5基因5’端甲基化PCR反应

(1)根据GP5基因启动子甲基化岛设计上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物如下：

(2)按照如下体系配制成PCR反应液，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应：

(3)反应条件如下：

第一阶段：50℃5min，95℃，1个循环；

第二阶段：95℃15S，65℃40S，40个循环。

实施例5：GP5基因5’端甲基化PCR结果分析

(1)将扩增产物全部滴加至是纸条上，静置10-15min；

(2)若PCR为阳性，则生成的产物同时携带地高辛和生物素修饰，目标DNA的生物素与结合垫上的链酶亲和素标记的纳米颗粒结合，在吸水纸的毛细管作用下，样本液体不断向上层析，层析到T1线时，预先包被在T1线的地高辛抗体可捕获地高辛，构成“纳米颗粒-链霉亲和素-生物素-DNA-地高辛-地高辛抗体”复合结构，并在T1线富集，如图2所示,图2中A图显示结果为GP5基因5’端甲基化阳性，B图显示结果为GP5基因5’端甲基化阴性。

以上对本发明进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，包括人GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液和侧向流核酸检测试纸；所述GP5基因5’端甲基化特异性扩增反应液包括甲基化DNA处理组分、GP5基因5’端甲基化特异性引物组、热稳定性DNA聚合酶、UNG酶和反应缓冲液，所述侧向流核酸检测试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

2.根据权利要求1所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述甲基化DNA处理组分为亚硫酸盐溶液或甲基化依赖性的限制内切酶；所述亚硫酸盐溶液包括3-5M亚硫酸氢钠、5%-10%乙二醇二甲醚和5-10mM氢醌；所述甲基化依赖性的限制内切酶为MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述GP5基因5’端甲基化特异性引物组包括上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物，所述上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物序列为：GCACATCCTGCTCTT，且序列5’端连有接头引物，3’端有修饰基团，所述上游通用扩增引物序列为：TTCCAAGCCTTCGCCACCTCCATC，所述下游基因特异性引物序列为：GCCGCGGCCCATTCCG。

4.根据权利要求3所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述上游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物5’端接头引物为一“发卡结构”接头，所述接头序列为GTCGTATCCAGTGCTTCCAAGCCTTCGCCACCTCCATCGCACTGGATACGAC，所述3’端修饰为LNA、磷酸化修饰、ddC或C3 Spacer中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述上游通用扩增引物的5′端标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5中的任意一种，所述下游基因特异性引物的5′端标记生物素。

6.根据权利要求1所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述结合垫喷涂有修饰的纳米彩色乳胶微球，所述修饰为链酶亲和素。

7.根据权利要求1所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜检测区包括一条C线和两条T线。

8.根据权利要求7所述的检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒，其特征在于，所述C线包被的是生物素-BSA，所述T线包被的是地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体、Cy5抗体的任意一种。

9.一种检测GP5基因5’端甲基化的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:针对待检测样本基因组DNA设计上下游GP5基因5’端甲基化特异性识别引物和上下游通用扩增引物，在上游通用引物的5′端标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5，下游通用引物的5′端标记生物素，同时针对待检测样本基因组DNA的Actb基因设计内参引物，上游引物5′端分别标记地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5中的任意一种，下游引物的5′端标记生物素；

S2:对待检测样本基因组DNA进行亚硫酸盐处理或酶切处理，如果采用酶切处理，则可与PCR反应同管进行；

S3:对处理后的DNA进行PCR反应，首先特异性识别引物只与甲基化的DNA结合并延伸，形成具有“发卡结构”的产物，随后通用引物与“发卡结构”的环状部分结合，进行PCR扩增；

S4:取出PCR产物滴至核酸检测层析试纸的样品垫上进行检测，通过层析作用上移至T线和C线处，当C线和用于内参检测的T线显色，说明实验结果有效，此时，若用于甲基化检测的T线显色则说明人GP5基因5’端甲基化阳性。