CN109750116A - 用于肺炎支原体检测的pcr-内控核酸试纸条检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于PCR‑内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物，针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；提取待测样本的DNA、以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物进行PCR扩增得到待测样本DNA扩增产物，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。将待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。本发明基于PCR‑内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

Description

用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法

技术领域

本发明属于分子生物检测技术领域，涉及一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是引起呼吸道感染最常见的病原微生物之一，其目前发病率呈现出上升的趋势且可引起多系统病变。肺炎支原体缺乏细胞壁，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性，临床上应选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物来治疗，如大环内醋类、喳诺酮类、氨基糖普类、四环素类等。由于大部分药物对儿童正常生长发育有不良反应，目前大环内酯类是首选药物。随着大环内酷类抗生素的广泛应用，肺炎支原体对该抗生素耐药性呈现出逐年升高趋势。肺炎支原体感染临床表现不具有特征性，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且常与其它病原菌发生混合感染，因此临床需要一种灵敏、快速、特异的检测方法来早期确诊肺炎支原体肺炎，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。

目前肺炎支原体检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。但是肺炎支原体分离培养进行检测时需要耗费较长的时间，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义不大；而目前进行血清科学抗体检测主要有两大类：一类是血清肺炎支原体抗体IgM或IgG检测，一类是肺炎支原体核酸(MP-DNA)检测。血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低，

荧光定量PCR是MP-DNA检测中最常用的方法，但该方法操作复杂，且存在荧光探针、仪器价格昂贵等问题，许多基层临床单位尚不能开展。所以研究并开发用于MP检测关键技术和相关检测产品具有重大临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，操作简单，能够快速检测肺炎支原体。

本发明采用的技术方案是，基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；

针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；

提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，以MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，将扩增产物使用肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。

本发明的特点还在于：

MP特异性引物为：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；

β珠蛋白基因引物为：

β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；

β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。

步骤2中PCR扩增程序为：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taq buffer、8％的d NTP(A:U:C:G)、1％的HotMaster Taq DNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的dd H₂O。

肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条包括PVC胶板，PVC胶板上表面上呈线性依次固接有上样垫、结合垫、层析膜和吸水纸；上样垫与结合垫部分贴合，结合垫与层析膜部分贴合，层析膜与吸水纸部分贴合；结合垫上喷涂有地高辛抗体包被的金磁纳米微粒，层析膜上嵌有检测线T、内控线IC和质控线C，检测线T上包被有链霉亲和素，内控线IC上包被有Cy3抗体，质控线C上包被有羊抗鼠IgG，检测线T靠近免疫金磁微粒标记的结合垫端，内控线IC位于检测线T和质控线C之间。

上样垫和结合垫的材质均为亲水性的聚酯纤维，层析膜为硝酸纤维素薄膜。

步骤3中具体按照下述方法进行：

步骤3.1，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物滴加至上样垫上；

步骤3.2，观察肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条上的检测线T、内控线IC和质控线C，若质控线C、内控线IC和检测线T均发生显色反应，则检测结果为阳性，说明待测样本中含有肺炎支原体靶片段；

若质控线C、内控线IC显色而检测线T不显色，则说明待测样本中不含肺炎支原体靶片段；

若仅质控线C显色而内控线IC、检测线T均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信，重新进行检测；

若质控线不显色，则重新取肺炎支原体检测金磁免疫层析试纸条进行检测。

本发明的有益效果是：

本发明一种用于肺炎支原体检测的PCR-内控核酸试纸条检测方法，利用PCR对MP特异性靶基因进行识别和扩增，利用扩增片段标记的地高辛和生物素分别和金磁微粒表面的地高辛抗体和试纸条检测线上的链霉亲相互作用，结合侧向流技术，实现对MP目的基因的识别，并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。在完成靶基因扩增后,直接将扩增产物点于上样垫，几分钟后即可用肉眼判，不需要任何昂贵检测仪器和复杂的操作过程。

附图说明

图1是肺炎支原体检测内控核酸试纸条结构示意图；

图2是本发明基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法实施例1中检测结果图；

图3是本发明基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法实施例2的检测结果图。

图中，1.PVC胶板，2.上样垫，3.结合垫，4.层析膜，5.吸水纸，6.检测线T,7.内控线IC，8.质控线C。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；

针对人β珠蛋白基因的核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物：

β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；

β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。

提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，具体按照下述方法进行：

步骤2.1，向PCR管加入10％的10×Taq buffer、8％的d NTP(A:U:C:G)、1％的HotMaster Taq DNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的dd H₂O；

步骤2.2，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min；

步骤3，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测：

其中，如图1所示，内控核酸试纸条包括PVC胶板1，PVC胶板1上表面上呈线性依次固接有材质为亲水性的聚酯纤维的上样垫2、材质为亲水性的聚酯纤维的免疫金磁微粒标记的结合垫3、材质为硝酸纤维素薄膜的层析膜4和吸水纸5；上样垫2与免疫金磁微粒标记的结合垫3部分贴合，免疫金磁微粒标记的结合垫3与层析膜4部分贴合，层析膜4与吸水纸5部分贴合；免疫金磁微粒标记的结合垫3上喷涂有地高辛抗体包被的金磁纳米微粒，层析膜4上嵌有检测线T6、内控线IC7和质控线C8，检测线T6上包被有链霉亲和素，内控线IC7上包被有Cy3抗体，质控线C8上包被有羊抗鼠IgG，检测线T6靠近免疫金磁微粒标记的结合垫端，内控线IC7位于检测线T6和质控线C8之间。

使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条检测靶片段扩增产物，具体按照下述方法进行：

步骤3.1，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物滴加至上样垫2上；

步骤3.2，观察肺炎支原体检测内控核酸试纸条上的检测线6、内控线7和质控线8；

质控线8用于确保内控核酸试纸系统的有效性，若质控线显色反应，则说明层析系统完好；而质控线没有发生变色反应，则说明内控核酸试纸层析系统故障，结果无效，需要重新检测。

内控线7用于监控检测过程中PCR是否存在假阴性结果，防止由于采集过程中力度不够而未采集到上皮细胞，或检测过程存在问题，若内控线显色反应，则说明检测过程无误；其中内控线没有发生显色反应，说明采集过程中力度不够而未采集到上皮细胞，或检测中存在问题，需要重新取样检测。

检测线6用于检测待测样本中是否含有肺炎支原体靶基因，若检测线6显色反应，则说明待测样本有肺炎支原体感染，结果呈阳性；若检测线6不显色，则说明待测样本没有肺炎支原体感染，结果呈阴性；

若质控线8和内控线7均发生显色反应，说明试纸条层析系统和临床取样均无问题，检测结果有效。若质控线8和内控线7中任意一条没有发生显色反应，检测结果无效；其中质控线8没有发生显色反应，说明层析系统故障，需更换试纸条重新检测；其中内控线7没有发生显色反应，说明采集过程中力度不够而未采集到上皮细胞，或检测中存在问题，需要重新取样检测。

在本发明基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法中，将靶片段进行扩增时，分别针对人β珠蛋白基因和肺炎支原体的16SrRNA基因的核酸序列设计特异性引物，引物能够使待测样本中对应的靶片段进行PCR扩增。如果待测样本中采集成功，样本中含有呼吸道上皮细胞，则能够得到修饰有地高辛和荧光素Cy3的待测样本的人β珠蛋白DNA扩增产物；如果待测样本中存在肺炎支原体，则能够得到修饰有地高辛和生物素的待测样本的肺炎支原体DNA扩增产物；

而待测样本的PCR扩增产物滴到用肺炎支原体检测内控核酸试纸条的结合垫3上进行检测，若采样成功且其中含有肺炎支原体DNA，肺炎支原体扩增产物与人β珠蛋白扩增产物同时存在时,由于两种片段均修饰有地高辛,它们都会与层析膜4上的修饰有地高辛抗体(Anti-Digoxin antibody)的金磁纳米微粒结合形成复合物。液相通过层析流动到达检测线T处时，检测线处固定的链霉亲和素(streptavidin，SA)将一端标记有Biotin的肺炎支原体核酸捕获，使一部分金磁纳米复合微粒(Biotin-DNA-Digoxin-Anti-Digoxinantibody-纳米金磁微粒)停留在检测线处，产生红色的条带。

液相继续流动，到达内控线处，层析膜4上的内控线IC上的Cy3抗体将一端标记有Cy3的人β珠蛋白核酸捕获，使一部分金磁纳米复合微粒(Cy3-DNA-Digoxin-Anti-Digoxinantibody-纳米金磁微粒)聚集在内控线处，产生红色的条带。

液相继续流动，到质控线处，层析膜4上的质控线C上的IgG能够将多余的纳米金磁微粒捕获，从而使得质控线C显示红色条带，从而对试纸条进行质控。

若待测样本中由于采集过程中力度不够等原因，未采集到上皮细胞，待测样本中不存在人β珠蛋白基因，或PCR扩增中存在问题，无法得到对应扩增产物，纳米金磁微粒无法停留在内控线上，内控线无显色。若待测样本中不存在肺炎支原体，无法扩增等到对应的肺炎支原体靶片段，检测线不发生显色反应。

如果试纸条上质控线、内控线及检测线均显色，则检测结果为阳性，表明待测样本中含有肺炎支原体核酸；如果质控线、内控线显色而检测线不显色，则检测结果为阴性，表明待测样本中不含肺炎支原体核酸；如果仅质控线显色而内控线、检测线均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信；如果质控线不显色，表明试纸条自身存在质量问题，检测结果亦不可信。

本发明中采用纳米金磁微粒作为标记材料，其是以金和磁性材料复合而成的纳米复合材料，内核为超顺磁性材料，表面包覆材料为金。其结合了胶体金能高效偶联生物分子和磁性纳米粒子超顺磁性的双重优势，无需共价偶联试剂，利用静电吸附将抗地高辛抗体偶联至其表面形成抗地高辛抗体免疫金磁微粒。

本发明建立了基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，结合PCR扩增技术和纳米免疫探针识别技术，实现MP的核酸快速检测。利用地高辛抗体包被金磁纳米探针特有的可目视化特性，“生物素-链霉亲和素”、“地高辛-地高辛抗体”以及“Cy3-Cy3抗体”的相互作用，对PCR扩增产物完成目视化监测。并加入UNG酶防污染技术和内控分别用于避免假阳性和假阴性结果。在完成临床样本的PCR扩增后，无需纯化，将扩增产物滴于层析试纸条上样垫，无需5-10分钟即可完成检测，不需要任何昂贵检测仪器和复杂的操作过程。并开展初步的临床应用研究，为肺炎支原体的流行病学调查及基层医院体检奠定一定的基础，为临床医生合理用药提供指导。

实施例1

1.样本范围适用于疑似肺炎支原体感染的患者痰液样本。视痰液标本溶解难易程度加入1～3倍痰液体积的胰蛋白酶，取消化后的痰液2000～4000rpm离心2min，再取上清1ml 10000～15000rpm离心5min，弃上清在沉淀中加入500μl DNA裂解液(蛋白酶K浓度为200ng/ml的0.5％NP-40溶液)震荡混匀后放56℃水浴l h，煮沸10min，10000-13000rpm离心5min，取上清作为扩增检测的模板液备用。

2.取PCR离心管，按照下表加入各试剂

3.将PCR管放入PCR扩增仪，按照如下程序进行扩增：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

4.将PCR管的扩增产物滴加到试纸条的上样垫上，结果如图2所示。根据图2中质控线、内控线和检测线显色判读，该样本为肺炎支原体阳性。

实施例2

1.样本范围适用于疑似肺炎支原体感染的患者咽拭子样本。使用1ml生理盐水浸泡咽拭子棉签，经反复挤压后弃掉棉签，振荡30-60s,10000～15000rpm离心5min，弃上清在沉淀中加入50-200μl DNA裂解液(蛋白酶K浓度为200ng/ml的0.5％NP-40溶液)，煮沸10min，10000-13000rpm离心5min，取上清作为扩增检测的模板液备用。

2.取PCR离心管，按照下表加入各试剂

3.将PCR管放入PCR扩增仪，按照如下程序进行扩增：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

4将PCR管的扩增产物滴加到试纸条的上样垫上，结果如图3所示。根据图2中质控线、内控线显色而检测线不发生显色判读，该样本为肺炎支原体阴性，说明本样本中没有肺炎支原体。

将实施例1和实施例2中全部DNA标本以及空白对照进行MP种特异的16S rRNA基因PCR扩增进行电泳或基因测序进行确认，皆与本发明的PCR-内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法结果一致。

Claims (7)

1.基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：

步骤1，针对肺炎支原体的16S rRNA核酸序列设计修饰有地高辛和生物素的MP特异性引物；

针对人β珠蛋白核酸序列设计修饰有地高辛和荧光素Cy3的β珠蛋白基因引物；

提取待测样本的DNA；

步骤2，以待测样本的DNA为模板，以所述MP特异性引物和β珠蛋白基因引物为引物同时进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，将所述扩增产物使用肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。

2.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述MP特异性引物为：

MP-F：5’-Digoxin–AAGGACCTGCAAGGGTTGT-3’；

MP-R：5’-Biotin-CTCTAGCCATTACCTGCTAA-3’；

所述β珠蛋白基因引物为：

β-Globin-F：5’-Digoxin-ACAGAACTGTGTTCACTAGC-3’；

β-Globin-R：5’-Cy3-CATCAGGAGTGGACAGATCC-3’。

3.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序为：

UNG酶50℃2min；95℃预变性5min；94℃变性30s,54℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃完全延伸1min。

4.根据权利要求3所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，进行PCR扩增时，按照体积分数，向PCR管加入10％的10×Taq buffer、8％的d NTP(A:U:C:G)、1％的HotMaster Taq DNA酶、1％的UNG酶、2％～5％的MP特异性引物、2％～5％的β珠蛋白基因引物、2％～10％的模板和60％～74％的dd H₂O。

5.根据权利要求1所述的基于PCR-内控核酸试纸条的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述肺炎支原体检测内控核酸试纸条包括PVC胶板(1)，所述PVC胶板(1)上表面上呈线性依次固接有上样垫(2)、结合垫(3)、层析膜(4)和吸水纸(5)；所述上样垫(2)与结合垫(3)部分贴合，所述结合垫(3)与层析膜(4)部分贴合，所述层析膜(4)与吸水纸(5)部分贴合；所述结合垫(3)上喷涂有地高辛抗体包被的金磁纳米微粒，所述层析膜(4)上嵌有检测线T(6)、内控线IC(7)和质控线C(8)，所述检测线T(6)上包被有链霉亲和素，所述内控线IC(7)上包被有Cy3抗体，所述质控线C(8)上包被有羊抗鼠IgG，所述检测线T靠近免疫金磁微粒标记的结合垫(3)端，内控线IC(7)位于检测线T(6)和质控线C(8)之间。

6.跟权利要求5所述的基于PCR-内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述上样垫(2)和结合垫(3)的材质均为亲水性的聚酯纤维，所述层析膜(4)为硝酸纤维素薄膜。

7.根据权利要求5所述的基于PCR-内控核酸试纸的肺炎支原体检测方法，其特征在于，所述步骤3中具体按照下述方法进行：

步骤3.1，将步骤2得到的待测样本DNA扩增产物滴加至上样垫(2)上；

步骤3.2，观察肺炎支原体检测内控核酸试纸条上的检测线T(6)、内控线IC(7)和质控线C(8)，若质控线C(8)、内控线IC(7)和检测线T(6)均发生显色反应，则检测结果为阳性，说明待测样本中含有肺炎支原体靶片段；

若质控线C(8)、内控线IC(7)显色而检测线T(6)不显色，则说明待测样本中不含肺炎支原体靶片段；

若仅质控线C(8)显色而内控线IC(7)、检测线T(6)均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信，重新进行检测；

若质控线C(8)不显色，则更换肺炎支原体检测内控核酸试纸条进行检测。