CN102776279A - 一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法。该快速分型检测方法包括以下几个重要的环节：基于AS-PCR的方法，对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17等位基因位点进行识别与扩增。利用扩增片段标记的生物素和纳米金磁微粒表面链亲和素相互作用，结合侧向流技术，实现基因分型快速检测。利用金磁微粒作为杂交载体，无需对目的片段进行纯化、浓缩而导致的高成本、费时、费力的问题。

Description

一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法

技术领域

本发明涉及一种个体化用药检测技术，具体涉及针对心血管抗凝药基因个体化用药之快速分型检测方法。

背景技术

《中国心血管病报告2010》显示，我国每年300万人死于心血管疾病，居死因之首，其用药安全和有效性备受关注。氯吡格雷已成为临床抗血栓治疗的一线用药。然而，约30％患者服用该药后疗效不佳，甚至产生严重不良反应。研究表明，氯吡格雷抵抗与ABCB1基因多态性、细胞色素P450酶代谢活性、ADP受体多态性均相关。其中CYP2C19基因多态性（关于细胞色素P450酶代谢活性）是增加心肌梗死、中风和支架内血栓的主要影响因素，其多态性会导致药物代谢酶的多态性，使酶活性呈现高、低或无活性状态。因此，代谢类型被分为了以下四种：超强代谢UM（纯合超强代谢CYP2C19*17/*17，杂合超强代谢CYP2C19*1/*17）、强代谢组EM（纯合强代谢CYP2C19*1/*1）、中间代谢组IM（杂合型中间代谢CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3）及弱代谢组PM（杂合型弱代谢CYP2C19*2/*3，纯合型弱代谢CYP2C19*2/*2）。以基因分型为基础的个体化用药治疗会成为降低不良反应和增加药效的一种有效手段。研究表明CYP2C19*2和CYP2C19*3两种突变可解释>99％的东方人弱代谢者以及约88％的白种人弱代谢者的表型。其中*2突变是PM产生的主要原因。中国人群CYP2C19*2和*3等位基因占30％及8％，CYP2C19*2和*3基因被证实为亚洲人对该药抵抗的危险因素。

荧光定量PCR、质谱法、基因芯片或传统的酶切方法相比，均已被用来检测SNP，但这些方法存在操作复杂、检测时间长，或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制，因此并不适合于大多数临床医院在常规的临床检验中推广使用，所以研究并开发用于个体化用药相关新型检测关键技术和相关检测产品有重大意义。

发明目的

本发明的目的是提供一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法，以解决背景技术的方法操作复杂、检测时间长等问题、或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制。

为实现上述发明目的，本发明提出了以下基本技术方案：

一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法，包括以下步骤：

(1)针对待检测样本基因组DNA的CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（-806C>T）这三个SNP位点，对每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；

(2)针对一个SNP位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应条件相同并同时置于PCR仪中反应；这样，对于（1）步骤中所述的三个SNP位点，共做六管PCR反应；Taq聚合酶的特异性决定了PCR反应能否顺利进行；

(3)利用链亲和素金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以生物素和链亲和素作用，对步骤(2)得到的扩增产物中SNP基因型完成分型检测；

其中，层析技术采用的试纸条满足：

a、试剂条的免疫层析膜（硝酸纤维素膜）上的质控线处包被有质控用生物素；

b、检测线处包被有捕获用抗地高辛抗体；

c、结合垫上喷涂有链亲和素金磁微粒；

经步骤(2)取出的两管PCR产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，质控线显色表明此次实验有效，即步骤(2)的该管PCR反应顺利，即得到的产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至上样垫，一端的生物素与链亲和素磁粒特异性结合之后，通过层析作用上移至检测线处，另一端上的地高辛与检测线上的抗地高辛抗体特异性结合显色，由此判断出其基因型：

滴加含有野生型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。

上述步骤(1)中设计的引物序列如下：

CYP2C19*2（681G>A）引物序列：

引物名称

序列

CYP2C19*2F：	5′Biotin-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT-3′
		CYP2C19*2R(M)：	5′Dig-GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3′
CYP2C19*2R(Wt)：	5′Dig-TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3′

CYP2C19*3(636G＞A)引物序列：

引物名称	序列
		CYP2C19*3F：	5′Biotin-TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-3′
CYP2C19*3R(M)：	5′Dig-AAAAAACTTGGCCTTACCTGGAAT-3′
		CYP2C19*3R(Wt)：	5′ Dig-AAAAACTTGGCCTTACCTGGAAC-3′

CYP2C19*17(-806C＞T)引物序列：

引物名称	序列
		CYP2C19*17F(M)：	5′Dig-ATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAATT-3′
CYP2C19*17F(Wt)：	5′Dig-ATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAACC-3′
		CYP2C19*17R：	5′Biotin-CTGGGATTTGAGCTGAGGTCTT-3′

按照上述方法，设计的最佳的PCR反应过程如下：PCR反应过程依次为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，进行31个循环，72℃终延伸10min。

上述链亲和素金磁微粒的主体纳米金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米磁性粒子，核表面是金的壳层，利用表面金的性质，无需共价偶联试剂，能够将链亲和素偶联在其表面形成链亲和素金磁微粒。

本发明具有以下优点：

本发明基于AS-PCR对等位基因位点进行识别与扩增。利用扩增片段标记的生物素和纳米金磁微粒表面链亲和素相互作用，结合侧向流技术，实现基因分型快速检测。是一种操作简便、应用广泛和灵敏度高的快速检测系统，在完成片段扩增后，只需几分钟即可完成分型检测，不需要任何昂贵检测仪器和复杂的操作过程。

附图说明

图1为免疫层析检测原理图；

图2为本发明分型检测方法的原理图；

图3为实施例1的检测结果。根据基因型检测结果显示此人为杂合型弱代谢。

具体实施方式

本发明的快速分型检测方法包括以下几个重要的环节：基于AS-PCR的方法，对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17等位基因位点进行识别，完成靶片段扩增。利用扩增片段标记的生物素和纳米金磁微粒表面链亲和素相互作用，结合侧向流技术，实现基因分型快速检测。利用金磁微粒作为杂交载体，无需对目的片段进行纯化、浓缩而导致的高成本、费时、费力的问题。

如图1所示，在试纸条的支撑板上依次贴有样品垫、结合垫、免疫层析膜和吸水垫，免疫层析膜位于于支撑板上底衬中部，样品垫与吸水垫分别位于支撑板上两端，结合垫设于样品垫与免疫层析膜之间，免疫层析膜的另一端接吸水垫，以保证样品从样品垫到吸水垫方向的移动。

以下两个实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。

实施例1：

1、提取人外周血的基因组DNA，测其浓度；

1.1、针对CYP2C19*2（681G>A），在A、B两支离心管中分别加入以下物质：

1.2反应程序：

1.3A/B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果可直观显示基因型。

2、提取人外周血的基因组DNA，测其浓度；

2.1、针对CYP2C19*3（636G>A），在C、D两支离心管中分别加入以下物质：

2.2反应程序：

2.3C/D两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果可直观显示基因型。

3、提取人外周血的基因组DNA，测其浓度；

3.1、针对CYP2C19*17（-806C>T），在E、F两支离心管中分别加入以下物质：

3.2反应程序：

3.3E/F两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果可直观显示基因型。

Claims (4)

1.一种针对疾病个体化用药的基因分型快速试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对待检测样本基因组DNA的CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（-806C>T）这三个SNP位点，对每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；

(2)针对一个SNP位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应条件相同并同时置于PCR仪中反应；这样，对于（1）步骤中所述的三个SNP位点，共做六管PCR反应；Taq聚合酶的特异性决定了PCR反应能否顺利进行；

(3)利用链亲和素金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以生物素和链亲和素作用，对步骤(2)得到的扩增产物中SNP基因型完成分型检测；

其中，层析技术采用的试纸条满足：

a、试剂条的免疫层析膜上的质控线处包被有质控用生物素；

b、检测线处包被有捕获用抗地高辛抗体；

c、结合垫上喷涂有链亲和素金磁微粒；

经步骤(2)取出的两管PCR产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，质控线显色表明此次实验有效，即步骤(2)的该管PCR反应顺利，即得到的产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至上样垫，一端的生物素与链亲和素磁粒特异性结合之后，通过层析作用上移至检测线处，另一端上的地高辛与检测线上的抗地高辛抗体特异性结合显色，由此判断出其基因型：

滴加含有野生型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中设计的引物序列如下：

CYP2C19*2（681G>A）引物序列：

  引物名称   序列   CYP2C19*2F：   5′Biotin-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT-3′   CYP2C19*2R(M)：   5′Dig-GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3′   CYP2C19*2R(Wt)：   5′Dig-TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3′

CYP2C19*3（636G>A）引物序列：

  引物名称   序列   CYP2C19*3F：   5′Biotin-TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-3′   CYP2C19*3R(M)：   5′Dig-AAAAAACTTGGCCTTACCTGGAAT-3′   CYP2C19*3R(Wt)：   5′Dig-AAAAACTTGGCCTTACCTGGAAC-3′

CYP2C19*17（-806C>T）引物序列：

  引物名称   序列   CYP2C19*17F(M)：   5’Dig-ATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAATT-3’   CYP2C19*17F(Wt)：   5’Dig-ATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAACC-3’   CYP2C19*17R：   5’Biotin-CTGGGATTTGAGCTGAGGTCTT-3’

3.根据权利要求2所述的检测方法：PCR反应过程依次为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，进行31个循环，72℃终延伸10min。

4.根据权利要求1至3任一所述的检测方法，其特征在于：所述链亲和素金磁微粒的主体纳米金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米磁性粒子，核表面是金的壳层，利用表面金的性质，无需共价偶联试剂，能够将链亲和素偶联在其表面形成链亲和素金磁微粒。

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