CN103146823A - 一种设计碱基替换或插入缺失的snp分子标记的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，该方法针对由于平常所用的TaqDNA聚合酶要进行正常扩增，其5′可以不需要与模板完全匹配，而其3′要求完全配对。针对这个特性，可以特异地将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成3′端错配，导致不能正常扩增；同样以野生基因设计的引物与突变型基因的3′端产生错配，也同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次PCR，再通过特定技术检测PCR结果，可以方便地确定该个体SNP位点的基因型。

Description

一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法

技术领域

本发明属于SNP检测技术领域，尤其涉及一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）标记技术，属于新一代的标记技术。常用来表示不同生物个体在同一等位基因处个别碱基的差异，常常出现的单核苷酸多态性有碱基替换、碱基的插入缺失。目前，SNP是所发现的生物中存在最广泛的变异类型，即使在不同生物个体中序列差异不大的基因中也存在一定数量的SNP位点，因此是植物遗传研究中理想的分子标记。作为新兴的分子标记，SNP有如下优点：数量多分布广，SNP比微卫星标记密度更高，是等位基因间序列差异最为普遍的类型；SNP具有二态性特点，其不再以DNA序列长度的不同来检测多态性，能够用不同的方法进行基因的检测；在启动子区的SNP可能对基因的表达造成影响，而在编码序列的SNP可能会影响到所编码蛋白的结构和功能，是目前遗传研究的热点。

目前，检测SNP的方法很多，常用的有如下几种：利用生物信息学的方法在已有的DNA数据库中搜索SNP，这种方法比较直接、快捷；单链构象多态性（SSCP），通过个别碱基的变化影响DNA的构象的原理来检测SNP，操作简单、经济、适用面广。但影响因素较多，如电泳温度、凝胶浓度均可影响其灵敏性，所以稳定性不高；酶切法，基因中个别碱基的变化，可造成原来基因中部分酶切位置的变化，通过特异酶切割所扩增的序列，产生大小不一的切割片段，再利用简单的检测手段来可达到区分该位点的目的。酶切检测法方便、准确，但只能分析酶切位点处的SNP，而不能检测酶切位点以外的SNP，所以有一定局限性；杂交法，如DNA芯片技术，可以大大提高检测速度，但价格较昂贵；测序法，对不同个体等位基因片段进行测序分析，检测序列中的碱基变异。该法直观、准确，但工作量大，价格昂贵；PCR法，利用引物序列3′端的SNP不能与模板有效结合，导致PCR扩增结果的不一，通过特定的手段检测PCR结果来达到确定SNP位点的目的。PCR法方便快捷但受较多其它因子的干扰，重复性较差。利用SNP标记，人们已成功标记了一些抗病、抗逆和优质基因（Buren etal.2000；Brooks et al.2006；Mondini et al.2012）。

从以上方法可以看出，目前常用的方法存在稳定性不高、有一定局限性、价格较昂贵、重复性差等。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，在获得基因序列后，针对该基因的变异开发相应的功能标记，对研究基因的功能并有效利用该基因提供坚实的基础。

本发明实施例是这样实现的，一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，该方法将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；该方法通过两次PCR，再通过技术检测PCR结果，确定出个体SNP位点的基因型。

进一步，该方法引物设计方法为：

两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换，由Allele1特异位点T设计特异引物P1，同样由Allele2特异位点C设计特异引物P2；两对引物在Genotype1中扩增时，P1引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物，确定该基因的基因型为TT；用相同的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC；若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为TC，从而分析出SNP位点。

本发明提供的方法针对由于平常所用的TaqDNA聚合酶要进行正常扩增，其5′可以不需要与模板完全匹配，而其3′要求完全配对。针对这个特性，可以特异地将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成3′端错配，导致不能正常扩增；同样以野生基因设计的引物与突变型基因的3′端产生错配，也同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次PCR，再通过特定技术检测PCR结果，可以方便地知道该个体SNP位点的基因型。

附图说明

图1是本发明实施例提供的等位基因特异PCR技术原理

图2是本发明实施例提供的AS-PCR引物设计；黑体表示加入的错配碱基；

图3是本发明实施例提供的AS-PCR引物组合筛选

图4是本发明实施例提供的部分F₂后代基因分型结果；泳道1-20为F₂代第300-319个单株的基因型结果；

图5是本发明实施例提供的AS-PCR引物在24个品种中的扩增；M：DNA Ladder；1中国春；2兰考大粒；3长武0318；4郑麦366；5烟农192；6西农979；7皖麦38；8济麦22；9郑麦9623；10皖麦50；11小偃22；12周麦18；13四川大粒；14陕麦229；15淮麦20；16西农2611；17西农9871；18兰考185；19郑麦0856；20明贤169；21BYL3；22大地98；23宿7075；24徐麦9074；

图6是本发明实施例提供的5个品种的籽粒图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1表示的是该技术引物设计原理，两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换。这样可以由Allele1特异位点T设计特异引物P1，同样由Allele2特异位点C设计特异引物P2(图1A)。两对引物在Genotype1中扩增时，P1引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物(图1B)，可以确定该基因的基因型为TT；用相同的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC；若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为TC。这样可通过简单的电泳技术来分析该SNP位点(图1C)。

本发明用克隆的小麦粒重基因TaGW2的大小粒品种碱基差异为例，该基因全长cDNA1275bp,大粒品种兰考大粒在977bp处和小粒品种中国春相比有一个“T”碱基的插入，其余部分碱基基本相同，如图2所示，在突变位点处，根据兰考大粒的序列设计了三个引物：F4、F6和R4。其中F4、F6为上游引物分别在其3′端第2位和第3位加入错配碱基G；R4为下游引物在其3′端第2位加入了错配碱基G。由中国春的序列设计一个引物F5，在其3′端第2位引入错配碱基G。此外，还分别在突变位点两侧200bp处设计一对内参引物F3和R3，扩增片段长度约540bp。通过特异引物F4、F5、F6和R4分别与内参引物F3和R3组合，便形成了4套引物组合（TaGW2-AS-P1、TaGW2-AS-P2、TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4），用于扩增兰考大粒和中国春的特异序列。以兰考大粒特异引物组合（TaGW2-AS-P1、TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4）结合中国春特异引物组合（TaGW2-AS-P2）可鉴定基因型。引物序列列于表1中，由大连宝生物生物工程有限公司合成。

表1 AS-PCR引物设计；黑体表示加入的错配碱基

.3本发明技术方案带来的有益效果

3.1基因组DNA的提取

取田间兰考大粒/中国春F₂代327单株及另外22个小麦品种幼苗叶片，采用微量CTAB法提取基因组DNA。

3.2SNP标记的筛选

首先以中国春和兰考大粒的基因组DNA为模板，用AS-PCR引物进行扩增，并对PCR条件进行优化，筛选多态性比较好的引物标记。

PCR程序有所不同，以中国春和兰考大粒的cDNA为模板，4套引物组合进行扩增。以TaGW2-AS-P1引物组合为例，冰浴状态下向PCR管中加入反应体系如下：2.5μL PCR缓冲液(10x)、2μL dNTPs(10mmo1·L^-1)、0.4μL F3(10μmo1·L^-1)、0.6μL F4(10μmo1·L^-1)、1μL R3(10μmo1·L^-1)、0.125μL TaqDNA聚合酶(4U·L^-1)、1μL DNA模板及17.375μL无菌双蒸水，总反应体系为25μL。

PCR扩增程序如下，94℃预变性5min；94℃30s，56-58℃优化退火30s，72℃延伸1min，39个循环；72℃温育10min。

1%的琼脂糖凝胶电泳检测,Marker为DL2000。

以中国春（CS）和兰考大粒（LK）基因组DNA为模板，四个引物组合进行PCR扩增，并对引物所需的最适温度（56、57和58℃）进行了优化。结果显示，四个引物组合中，除了TaGW2-AS-P1，其它三个组合都得到了预期特异的扩增产物，并表现出良好的多态性。其中TaGW2-AS-P2只在中国春的基因组中得到了特异性扩增产物，片段大小在320bp左右；TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4都只在兰考大粒中获得了特异扩增产物，其中TaGW2-AS-P3特异片段在320bp左右,TaGW2-AS-P4特异片段大小在260bp左右。除此之外，每一套引物组合都扩增到了540bp左右大小的内参片段。

对每一套引物都进行了三个温度的筛选，其都在57℃的温度下获得了最佳扩增片段（图3）。

F2群体基因型检测

以兰考大粒特异引物组合TaGW2-AS-P4结合中国春特异引物组合TaGW2-AS-P2，在两亲本组成的F₂群体327个单株的基因组DNA中进行扩增以确定各单株的基因型。其中仅用TaGW2-AS-P4引物组合能扩增出条带与兰考大粒带型一样的就记为纯和基因型（TT），仅用TaGW2-AS-P2引物组合能扩增出条带与中国春带型一样的就记为纯和基因型（tt）,用两引物都能扩增出条带的记为杂合基因型（Tt）。

两套引物在F₂群体中显示出良好的多态性（图4），其基因分型结果显示327个单株中,共有75个TT基因型个体，184个杂合基因性Tt个体，68个tt基因型个体。该比例符合单基因分离的1:2:1的比例(χ²=5.44,P＞0.05)。这样F_2:3群体根据基因型就相应地分成三组。

3.3关联分析

分别收获各地F_2:3群体的小麦籽粒，并进行粒宽（KW）、粒长（KL）和千粒重（TKW）的测量。后用SPSS数据分析软件分别对各地区收获的各基因型群体的籽粒进行统计分析。

通过对各地区每个基因型群体数据统计结果显示，三个环境下都检测到TT基因型群体的粒宽、粒长和千粒重都与tt基因型各性状的差异都达到了极显著的水平，Tt基因型群体的各性状与tt基因型性状的差异都达到了极显著的水平，可见T碱基的插入突变显著提高了籽粒的粒重相关性状；对三个环境数据总和及杨凌地区的分析显示TT基因型的粒宽与Tt基因型的粒宽的差异达到了显著水平，而粒长和千粒重的差异却不显著，表明该突变位点对粒宽的影响更大，并且对粒宽的效应可能受环境的影响也较大；数据分析发现，TT和Tt基因型的粒宽比tt基因型分别增加0.18和0.13mm,其千粒重比tt基因型分别增加3.94和2.92g。

4.SNP标记在其它品种中的应用

是否TaGW2基因中的T插入突变是仅仅发生在兰考大粒中而被筛选出来，还是在其它品种中也广泛存在？带着这个疑问，又选取了22个籽粒大小各不同的小麦品种，用所开发的AS-PCR标记进行筛选。除了用TaGW2-AS-P4和TaGW2-AS-P2引物组合，也用TaGW2-AS-P3引物组合进行了筛选。

结果显示，利用TaGW2-AS-P4引物组合，在22个品种中又筛选出两个品种，四川大粒与皖麦38，它们与兰考大粒有相同的PCR扩增产物，而用TaGW2-AS-P2引物组合没有特异扩增，说明这两个品种的基因型也为TT与兰考大粒基因型相同。用TaGW2-AS-P3引物组合也得到了相同的结果，说明标记的稳定性比较好（图5）。对四川大粒与皖麦38的籽粒的测量数据显示，四川大粒的粒长(8.44±0.10mm)和粒宽（3.80±0.03mm）比兰考大粒更长更宽，其千粒重(66.71±1.54g)也更大。而皖麦38的籽粒不长(6.89±0.02mm)但粒宽却较大(3.45±0.04mm)。其它品种与中国春带型一样，为tt基因型，它们的籽粒都小于四川大粒（表2）。结果表明TaGW2基因的T碱基插入突变也存在于其它品种中，但数量较少，推测该突变是最近引入小麦基因库中的，已经被人们在选择育种中利用。

表2 22个品种的表型与基因型数据

5.对SNP标记的验证

为进一步检验标记扩增的准确性，利用扩增片段包含突变位点的引物TaGW2-P3及四川大粒、皖麦38及明贤169的基因组DNA为模板，对TaGW2基因第8外显子的部分片段进行克隆测序。

结果表明，利用TaGW2-P3引物，在四川大粒和皖麦38中的测序结果中有539bp的序列，而明贤169中的序列为538bp。比对兰考大粒、四川大粒、皖麦38、中国春和明贤169的序列，发现在同样的位置，四川大粒和皖麦38中都有与兰考大粒一致的T碱基插入(见序列表)。而明贤169是个小粒品种(图6)，千粒重仅有27.25±0.75g,其序列与中国春一致，没有T碱基的插入。该结果说明所设计的SNP标记不仅稳定性好，而且准确可靠，可用于分子标记辅助育种。

以下是本发明实施例提供的5个品种第8外显子部分序列比对.SC四川大粒,WM皖麦38,LK兰考大粒,MX明贤169,CS中国春*指示T碱基插入突变位点；

SC  1    GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA

WM  1    GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA

LK  1    GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA

MX  1    GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA

CS  1    GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA

SC  61   GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT

WM  61   GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT

LK  61   GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT

MX  61   GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT

CS  61   GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCCGCTATGGCT

SC  121  GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCGGTC

WM  121  GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC

LK  121  GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC

MX  121  GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC

CS  121  GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC

SC  181  TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT

WM  181  TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT

LK  181  TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT

MX  181  TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT

CS  181  TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGTAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT

         *

SC  241  TTCACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA

WM  241  TTCACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCTGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA

LK  241  TTCACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA

MX  241  T-CACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA

CS  241  T-CACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA

SC  301  GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC

WM  301  GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC

LK  301  GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC

MX  300  GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC

CS  300  GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC

SC  361  CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA

WM  361  CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA

LK  361  CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA

MX  360  CGGCTCGGACATCGTGGTGGATGCGGGGACAATGCCACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA

CS  360  CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA

SC  421  CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT

WM  421  CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT

LK  421  CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT

MX  420  CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT

CS  420  CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT

SC  481  GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT

WM  481  GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT

LK  481  GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT

MX  480  GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT

CS  480  GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，其特征在于，该方法以已知功能基因SNP突变位点为参照，将此位点设计在特异引物的3′位置；通过分别设计Allele1和Allele2特异位点两对引物，通过两次PCR，再通过技术检测PCR结果，确定出个体SNP位点的基因型，通过标记功能验证及稳定性检测，将该分子标记用于辅助选择育种。

2.如权利要求1所述的设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，其特征在于，该方法引物设计方法为：

两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换，由Allele1特异位点T设计特异引物P1，同样由Allele2特异位点C设计特异引物P2；两对引物在Genotype1中扩增时，P1引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物，确定该基因的基因型为TT；用相同的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC；若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为TC，从而分析出SNP位点。

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