CN105671139A - 人体lbm（瘦体重）检测试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人体LBM（瘦体重）基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：（1）针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（2）PCR扩增试剂（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其LBM的遗传因素，从而为受测者获得一个合适的健康方案，了解自身的肌肉含量和质量，在健身运动中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时为专业运动员的选材和训练提供科学依据。

Description

人体LBM（瘦体重）检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及基因检测，具体涉及人体LBM基因检测试剂盒。

背景技术

肥胖是身体成分发生了变化，身体成分是指人的所有组织器官的总成分，它的单位就是体重，分成脂肪和非脂肪两种成分。前者称为脂体重（或称肥体重），后者称为瘦体重（或称去脂体重），亦称“去脂体重”（fat-freebody），为除脂肪以外身体其他成分的重量，肌肉是其中的主要部分。

“瘦体重”由身体细胞重量（BCW）、细胞外水分（ECW）、和去脂的固体部分（FFS）组成。其主要成分是骨骼、肌肉等。正常情况，瘦体重与身体脂肪含量有一定比例。测量瘦体重对促进能量转换和耗氧、调节水盐代谢等具有重要意义。在运动训练中，运动员保持较高的瘦体重，对提高有氧耐力和运动能力是非常有好处的。运动员的运动能力在相当程度上决定于骨骼肌类型和骨骼肌的收缩能力，因此，以骨骼肌为主要成分的瘦体重占总体中的比例，对运动员的运动能力有很大影响。瘦体重发达说明身体强壮体质好，如运动员或一些平时就注重锻炼身体的人，他们肌肉强健，虽然体重高但却不属于肥胖。

瘦体重的计算公式是：

瘦体重=体重（W）-脂肪重量（f）

脂肪重量=体重（W）×体脂率（F%）

瘦体重主要由肌肉组成，而肌肉在体内的最大含量是高度遗传的，基因是决定因素。后天的训练和运动增加的瘦体重只能在基因决定的最高含量以下。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种LBM基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到其体内潜在的LBM含量水平，并计算瘦体重数值，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性。

一种LBM基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：

（1）针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：

针对SNPRS16892496的引物组：

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5’-GTGACTTGTACCCACG-3’

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针对SNPRS7832552的引物组：

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5’-ATCTTTAAAGAATTCTAG-3’

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（2）PCR扩增试剂；

（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。

本发明提供的瘦体重基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其瘦体重的遗传因素，计算体内LBM数值，从而为受测者获得一个合适的健康方案，了解自身的肌肉含量和质量，在健身运动中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时为专业运动员的选材和训练提供科学依据。

附图说明

图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

瘦体重基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：

（1）针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：

针对SNPRS16892496的引物组：

5’-GTTGAAGAGCAAGCCCCCA-3’

5’-GTGACTTGTACCCACG-3’

5’-GAACCAATAATACTCTCCTC-3’

5’-CATTTGGAATGGAAAC-3’

针对SNPRS7832552的引物组：

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5’-GTTTATTAAGAGCATTCA-3’

5’-ATCTTTAAAGAATTCTAG-3’

5’-TGCATTGGATTTTG-3’

（2）PCR扩增试剂；

（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。

下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。

本实施例对测试者采用瘦体重基因检测试剂盒同时检测2个基因的SNP多态位点，并根据基因分型结果，分析得到其瘦体重的遗传因素，计算体内LBM数值，从而为受测者获得一个合适的健康方案，了解自身的肌肉含量和质量，在健身运动中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。

使用到的瘦体重基因检测试剂盒内试剂由以下组成：

（1）针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：

针对SNPRS16892496的引物组：

5’-GTTGAAGAGCAAGCCCCCA-3’

5’-GTGACTTGTACCCACG-3’

5’-GAACCAATAATACTCTCCTC-3’

5’-CATTTGGAATGGAAAC-3’

针对SNPRS7832552的引物组：

5’-GTGATAGTGTGAGGTAC-3’

5’-GTTTATTAAGAGCATTCA-3’

5’-ATCTTTAAAGAATTCTAG-3’

5’-TGCATTGGATTTTG-3’

（2）PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液，该PCR缓冲液为100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2；dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸，各组分浓度为2.5mM；5U/μl热启动Taq酶。

（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1X后使用。

使用上述瘦体重基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：

（1）提取样本基因组DNA。

采集该测试者唾液，向1-2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲溶液溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解液溶剂为50mMTris-HClpH7.4，50mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1％Tritonx-100，1％Sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体积比为1∶1，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5mL70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存。

（2）PCR扩增

本实施例同时检测RS16892496和RS7832552。每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要8条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做5管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。

根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5μl10×PCR缓冲液，2μldNTPs，0.5μl引物组，热启动Taq酶0.15μl，基因组模板80mg，添加超纯水至总体积为25μl。

将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI9700PCR仪中，设置反应条件如下：预变性95℃3min；热循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；延伸72℃3min。反应结束后，取出试管。

由于5管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特异性，要求8条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测

将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：3g琼脂糖，加入100mL去离子水，微波炉加热1min，冷却到60℃时加入5μLGoldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物10μL与6×TBE缓冲液0.8μL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。

检测得到2个基因分型分析结果如下：

SNP	分型结果
		RS16892496	TT
RS7832552	TT

根据以上分型结果，该测试者的基因对瘦体重的贡献值为：2.7+2.55=5.25KG。依据是RS16892496GG>TG/TTGG型的LBM比TT和TG型的多2.7KG，RS7832552TT型比TC和CC型的LBM多2.55KG。这表明该测试者具有较高的肌肉组成，肌肉比重较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

核苷酸序列表

<110>武汉白原科技有限公司

<120>人体LBM（瘦体重）检测试剂盒和方法

<130>1

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gttgaagagcaagccccca19

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtgacttgtacccacg16

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaaccaataatactctcctc20

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

catttggaatggaaac16

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtgatagtgtgaggtac17

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gtttattaagagcattca18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atctttaaagaattctag18

<210>8

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tgcattggattttg14

Claims (9)

1.瘦体重基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试剂包括：

（1）针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：

针对SNPRS16892496的引物组：

5’-GTTGAAGAGCAAGCCCCCA-3’

5’-GTGACTTGTACCCACG-3’

5’-GAACCAATAATACTCTCCTC-3’

5’-CATTTGGAATGGAAAC-3’

针对SNPRS7832552的引物组：

5’-GTGATAGTGTGAGGTAC-3’

5’-GTTTATTAAGAGCATTCA-3’

5’-ATCTTTAAAGAATTCTAG-3’

5’-TGCATTGGATTTTG-3’

（2）PCR扩增试剂；

（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。

2.根据权利要求1所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为0.5-1.0μl。

3.根据权利要求1所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。

4.根据权利要求3所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含：100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl₂。

5.根据权利要求3所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，热启动Taq酶0.1-0.2μl，基因组模板50-100ng。

6.根据权利要求1所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。

7.根据权利要求6所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选BiotiumGelred无毒染料。

8.根据权利要求1所述的瘦体重基因检测试剂盒，其特征在于：LBM相关基因对瘦体重的总贡献值为各基因对瘦体重贡献值之和，其单位是公斤。

9.根据权利要求8所述的计算方法，其特征在于：各基因对体重的贡献值为依分型的具体结果而定。