CN110283891A - 一种检测特定基因甲基化的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测特定基因甲基化的检测方法，包括甲基化特异性PCR扩增反应和侧向流核酸检测。基于PCR方法对特定基因甲基化进行识别与扩增，对扩增产物进行标记后，结合侧向流技术，对甲基化进行检测。本发明的有益效果是，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测特定基因甲基化，适合推广应用和产业化。

Description

一种检测特定基因甲基化的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种检测特定基因甲基化的检测方法。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)是严重威胁人类健康的疾病之一，恶性肿瘤死亡约占我国居民全部死因的四分之一，且呈持续上升态势。其中的一条原因是，在中国60％-80％的癌症初次确诊已是中晚期，患者五年生存率相对较低。因此，在早期对癌症进行筛查对癌症的诊断和治疗具有重要意义。目前，癌症的常规筛查方法主要为肿瘤标志物检测和影像学检查，但这些方法或灵敏性不够而导致漏检，或特异性不足而导致误诊、或对患者造成不适或性价比低，从而导致患者的依从性差。

近年来，很多研究表明，某些基因的DNA甲基化与癌症的发展密切相关。基因组中异常的DNA甲基化可能通过沉默多种肿瘤抑制基因而促成恶性转化。这种表观遗传改变被认为发生在肿瘤发展的早期，可能先于遗传改变。比如，SEPT9基因甲基化已被认为是结直肠癌早期的特异性生物标志物。Epigenomics AG公司最早在2008年便报道了从游离DNA中检测SEPT9甲基化作为结直肠癌生物标志物。随后，该公司先后推出了第一代和第二代的Epi proColon实时PCR试剂盒，并获得欧洲CE和美国FDA认证。Epi proColon试剂盒基于荧光PCR方法，用于定性检测来自患者血浆中SEPT9DNA甲基化水平。但是，这类方法需要较为昂贵的荧光PCR设备，而且操作过程较为繁琐，工作流程执行的测试周期大约需要8小时，对操作人员专业要求较高，因此并不能很好的满足实际的筛查需求。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提出一种检测特定基因甲基化的检测方法，可用于体外定性检测癌症患者血清、血浆、粪便以及石蜡包埋病理组织中某种特定基因的甲基化，采用简单高效的DNA甲基化处理技术和PCR扩增技术，利用纳米彩色乳胶微球作为核酸检测的可视化信号，代替荧光探针等光学信号，无需复杂的操作和昂贵的仪器，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济地检测特定基因的甲基化，适合推广应用和产业化。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

一种检测特定基因甲基化的检测方法，包括甲基化特异性PCR扩增反应和侧向流核酸检测；所述甲基化特异性PCR扩增反应的使用组分包括甲基化DNA处理组分、特定基因甲基化特异性引物组、热稳定性DNA聚合酶、UNG酶和反应缓冲液；所述侧向流核酸检测的检测形式为侧向流核酸检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

所述甲基化DNA处理组分为亚硫酸盐溶液或甲基化依赖性的限制内切酶；所述亚硫酸盐溶液包括3-5M亚硫酸氢钠、5％-10％乙二醇二甲醚和5-10mM氢醌；所述甲基化依赖性的限制内切酶为只能识别含有甲基化的DNA序列并进行特异型切割。

优选地，所述甲基化依赖性的限制内切酶为MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一种或几种。

所述特定基因甲基化特异性引物组包括上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物。所述上游甲基化特异性识别引物的5’端连有接头引物，3’端有修饰基团。

所述上游甲基化特异性识别引物5’端接头引物为“线性结构”或“发卡结构”接头，所述3’端修饰为核酸类似物或延伸阻断修饰。

优选地，所述核酸类似物为LNA、PNA中一种；所述延伸阻断修饰为磷酸化修饰、ddC或C3Spacer中的任意一种。

优选地，所述上游通用扩增引物和下游基因特异性引物的5′端标记生物素、地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5中的任意一种，且上下游引物标记不同。

所述结合垫喷涂有修饰的纳米彩色乳胶微球，所述修饰为亲和素、链酶亲和素、地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体或Cy5抗体的任意一种。

所述硝酸纤维素膜检测区包括一条C线和两条T线。

优选地，所述T线包被的是亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体、Cy5抗体的任意一种。

所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，包括以下步骤：

S1：针对待检测样本基因组DNA特定的甲基化位点设计上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物；

S2：对待检测样本基因组DNA进行亚硫酸盐处理或酶切处理，如果采用酶切处理，则可与PCR反应同管进行；

S3：对处理后的DNA进行PCR反应，首先特异性识别引物只与甲基化的DNA结合并延伸，随后通用引物与接头序列结合，进行PCR扩增；

S4：取出PCR产物滴至核酸检测层析试纸的样品垫上进行检测，通过层析作用上移至T线和C线处，当C线和用于内参检测的T线显色，说明实验结果有效，此时，若用于甲基化检测的T线显色则说明该基因为甲基化阳性。

本发明的有益效果是：

1、首次采用基于纳米彩色乳胶微球的侧向流核酸检测试纸来检测特定基因甲基化。此步设计的优势在于：利用纳米彩色乳胶微球作为核酸甲基化检测的载体，在保证较高的灵敏度的同时，避免时使用昂贵的仪器，使得结果分析简便、直观、清晰。

2、首次引入了接头引物和通用引物来检测特定基因甲基化；此步设计的优势在于：(1)如果采用亚硫酸盐溶液来处理DNA，未被甲基化的C碱基会变成U碱基，因此引物GC含量会比较低，引物与模板结合的效率和特异性更会变差，因此采用接头引物和通用引物后，只有在PCR反应的第一个循环会用GC含量低的引物去识别，在随后的PCR反应则由通用引物完成，因此反应的灵敏度和特异性更好；(2)如果采用甲基化依赖性的限制内切酶来处理DNA，则甲基化的DNA会在识别位点处发生断裂而非甲基化的DNA不断裂，采用接头引物则可以与断裂后的甲基化DNA互补并发生反向延伸，而与非甲基化的DNA则不会发生延伸，因此可以通过通用引物对DNA甲基化的状态进行检测；(3)与“线性接头”引物相比，“发卡结构”接头引物产生的片段会发生自身互补，从而阻止了接头引物与通用引物在模板结合时的竞争抑制，增强了反应的灵敏性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本发明所述侧向流核酸检测试纸侧面剖开结构示意图；

图1B是本发明所述侧向流核酸检测试纸平面结构示意图；

图2是本发明所述检测方法甲基化PCR结果分析结果图。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行具体描述。

实施例1：侧向流核酸检测试纸的制备

参见附图1A，其中，SP:样品垫CP:结合垫NM:硝酸纤维素膜检测区AP:吸水垫。

(1)硝酸纤维素膜检测区的制备：

将硝酸纤维素检测膜切成长条，置于喷点仪平台上，分别将地高辛单抗、FITC单抗和生物素-BSA喷点于检测膜上，形成T1、T2和C线。42℃干燥30min或室温自然干燥。

(2)结合垫的制备：

将玻璃棉切成长条，置于喷点仪平台，取纳米颗粒标记物，加入一定体积预处理液，喷点于玻璃棉，50℃干燥30min。

(3)样品垫的制备：

将玻璃棉切成长条，用一定体积预处理液浸泡，50℃干燥30min。

(4)试纸条的组装：

参见附图1，在试纸条的支撑板上依次贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

实施例2：亚硫酸盐溶液处理DNA

(1)使用商品化DNA提取试剂盒或其它适宜的方法提取人基因组DNA；

(2)取10μL DNA溶液(100ng-2μg)和90μL亚硫酸盐溶液，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应；

(3)反应条件如下：

第一阶段：95℃5min，1个循环,；

第二阶段：95℃30S，70℃10min，15个循环；

(4)使用商品化DNA纯化试剂盒或其它适宜的方法纯化DNA。

实施例3：甲基化依赖性的限制内切酶处理DNA

(1)使用商品化DNA提取试剂盒或其它适宜的方法提取人基因组DNA；

(2)取10μL DNA溶液(100ng-2μg)、5μL 10x反应缓冲液，2U甲基化依赖性的限制内切酶和35μL去离子水，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应；

(3)反应条件如下：

第一阶段：30℃1hr，1个循环,；

第二阶段：70℃15min，1个循环。

实施例4：人SEPT9基因甲基化PCR反应

(1)根据SEPT9基因启动子甲基化岛设计上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物如下：

(2)按照如下体系配制成PCR反应液，混匀后短暂离心，置于PCR仪中反应：

(3)反应条件如下：

第一阶段：50℃5min，95℃，1个循环；

第二阶段：95℃15S，65℃40S，40个循环。

实施例5：人SEPT9基因甲基化PCR结果分析

(1)将扩增产物全部滴加至是纸条上，静置10-15min；

(2)若SEPT基因甲基化为阳性，则生成的产物同时携带地高辛和生物素修饰，目标DNA的生物素与结合垫上的链酶亲和素标记的纳米颗粒结合，在吸水纸的毛细管作用下，样本液体不断向上层析，层析到T1线时，预先包被在T1线的地高辛抗体可捕获地高辛，构成“纳米颗粒-链霉亲和素-生物素-DNA-地高辛-地高辛抗体”复合结构，并在T1线富集，如图2所示,图2中A图显示结果为SEPT9基因甲基化阳性，B图显示结果为SEPT9基因甲基化阴性。

以上对本发明进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括甲基化特异性PCR扩增反应和侧向流核酸检测；所述甲基化特异性PCR扩增反应的使用组分包括甲基化DNA处理组分、特定基因甲基化特异性引物组、热稳定性DNA聚合酶、UNG酶和反应缓冲液；所述侧向流核酸检测的检测形式为侧向流核酸检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫。

2.根据权利要求1所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述甲基化DNA处理组分为亚硫酸盐溶液或甲基化依赖性的限制内切酶；所述亚硫酸盐溶液包括3-5M亚硫酸氢钠、5%-10%乙二醇二甲醚和5-10mM氢醌；所述甲基化依赖性的限制内切酶为只能识别含有甲基化的DNA序列并进行特异型切割。

3.根据权利要求1所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述特定基因甲基化特异性引物组包括上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物。

4.根据权利要求3所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述上游甲基化特异性识别引物的5’端连有接头引物，3’端有修饰基团。

5.根据权利要求4所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述上游甲基化特异性识别引物5’端接头引物为“线性结构”或“发卡结构”接头，所述3’端修饰为核酸类似物或延伸阻断修饰。

6.根据权利要求5所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述上游通用扩增引物和下游基因特异性引物的5′端标记生物素、地高辛、FITC、HEX、FAM或Cy5中的任意一种，且上下游引物标记不同。

7.根据权利要求1所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述结合垫喷涂有修饰的纳米彩色乳胶微球，所述修饰为亲和素、链酶亲和素、地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体或Cy5抗体的任意一种。

8.根据权利要求1所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜检测区包括一条C线和两条T线。

9.根据权利要求8所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述T线包被的是亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、FITC抗体、HEX抗体、FAM抗体、Cy5抗体的任意一种。

10.根据权利要求1-9任一项所述的一种检测特定基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：针对待检测样本基因组DNA特定的甲基化位点设计上游甲基化特异性识别引物、上游通用扩增引物和下游基因特异性引物；

S2：对待检测样本基因组DNA进行亚硫酸盐处理或酶切处理，如果采用酶切处理，则可与PCR反应同管进行；

S3：对处理后的DNA进行PCR反应，首先特异性识别引物只与甲基化的DNA结合并延伸，随后通用引物与接头序列结合，进行PCR扩增；

S4：取出PCR产物滴至核酸检测层析试纸的样品垫上进行检测，通过层析作用上移至T线和C线处，当C线和用于内参检测的T线显色，说明实验结果有效，此时，若用于甲基化检测的T线显色则说明该基因为甲基化阳性。