CN109082467A - 用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒及其应用，试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种。本发明通过联合检测生物标志物基因或相应片段的甲基化水平，使得乳腺癌前病变及乳腺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性，为乳腺癌的预测、诊断和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

Description

用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，女性一生中患乳腺癌的概率为10％，全世界每年约有乳腺癌病人130万人，约有40万人死于该病，并且以每年2％～3％的速度递增。在美国，乳腺癌的发病率占据女性恶性肿瘤第一位，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位。在我国，乳腺癌发病率也已跃居女性恶性肿瘤的首位，并且发病年龄呈年轻化趋势。乳腺癌已然成为全球范围内危害女性身体健康的头号杀手。乳腺癌病人的生存期和病理分期密切相关，病理分期越早治愈率越高，早期诊断对乳腺癌患者尤为重要。多项研究表明，大规模乳腺癌筛查可发现更多的早期病例，在患病率不断上升的背景下可逐步降低死亡率。

目前对乳腺癌筛查主要依靠影像学手段，例如乳房X线摄影术、超声成像和磁共振成像等，然而，早期乳腺癌往往缺乏典型的症状和体征，这使得影像学技术在乳腺癌早期筛查中并不能显示出良好的效果。随着人们对乳腺癌发生的分子机制的逐步探究，乳腺癌早期诊断分子标志物的开发被高度关注，遗憾的是迄今为止没有发现一个敏感性和特异性较高的分子标志物。近年来乳腺癌表观遗传学研究进展较快，特别是DNA甲基化，研究发现在乳腺癌发生的早期就存在很多特有的肿瘤相关基因出现不同程度的甲基化状态改变，为乳腺癌早期诊断标志物的探索提供了新的契机。

基因组的DNA甲基化异常与肿瘤的发生一直是医学界研究的热点之一，细胞周期、DNA 修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。DNA高甲基化最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)，正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常，研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排。由于抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。癌症相关基因甲基化也是乳腺癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态成为早期乳腺癌风险预测有效指标。尽管如此，目前仍缺乏对这些癌症相关基因的甲基化状态进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒，试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行 PCR扩增反应；生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种。需要说明的是，从生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。

生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、 RASSF1A和SOX17中的2种或2种以上；优选地，生物标志物基因选自APC、BRCA1、 CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的5种或5种以上；优选地，乳腺癌状态为乳腺癌I期或II期，生物标志物基因为APC和/或RASSF1A；优选地，乳腺癌状态为非浸润性癌，生物标志物基因为RARB和/或RASSF1A；优选地，乳腺癌状态为浸润性导管癌，生物标志物基因为APC、CCND2和/或RASSF1A；优选地，乳腺癌状态为浸润性小叶癌，生物标志物基因为CCND2和/或RASSF1A；优选地，乳腺癌状态为其它浸润性癌，生物标志物基因为CCND2和/或RARB；优选地，癌前病变状态为非典型性增生，生物标志物基因为BRCA1和/或RARB。

引物对包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组、第十三引物组、第十四引物组、第十五引物组、第十六引物组、第十七引物组、第十八引物组、第十九引物组、第二十引物组、第二十一引物组、第二十二引物组、第二十四引物组、第二十五引物组、第二十六引物组、第二十七引物组和第二十八引物组中的一组或多组；每个引物组都包括上游引物、下游引物、封闭引物和探针；其中，第一引物组包括序列表中序列12-15所示的DNA组成的引物；第二引物组包括序列表中序列16-19所示的DNA组成的引物；第三引物组包括序列表中序列20-23所示的DNA组成的引物；第四引物组包括序列表中序列24-27所示的DNA组成的引物；第五引物组包括序列表中序列28-31所示的DNA 组成的引物；第六引物组包括序列表中序列32-35所示的DNA组成的引物；第七引物组包括序列表中序列36-39所示的DNA组成的引物；第八引物组包括序列表中序列40-43所示的DNA组成的引物；第九引物组包括序列表中序列44-47所示的DNA组成的引物；第十引物组包括序列表中序列48-51所示的DNA组成的引物；第十一引物组包括序列表中序列 52-55所示的DNA组成的引物；第十二引物组包括序列表中序列56-59所示的DNA组成的引物；第十三引物组包括序列表中序列60-63所示的DNA组成的引物；第十四引物组包括序列表中序列64-67所示的DNA组成的引物；第十五引物组包括序列表中序列68-71所示的DNA组成的引物；第十六引物组包括序列表中序列72-75所示的DNA组成的引物；第十七引物组包括序列表中序列76-79所示的DNA组成的引物；第十八引物组包括序列表中序列80-83所示的DNA组成的引物；第十九引物组包括序列表中序列84-87所示的DNA组成的引物；第二十引物组包括序列表中序列88-91所示的DNA组成的引物；第二十一引物组包括序列表中序列92-95所示的DNA组成的引物；第二十二引物组包括序列表中序列96-99 所示的DNA组成的引物；第二十三引物组包括序列表中序列100-103所示的DNA组成的引物；第二十四引物组包括序列表中序列104-107所示的DNA组成的引物；第二十五引物组包括序列表中序列108-111所示的DNA组成的引物；第二十六引物组包括序列表中序列 112-115所示的DNA组成的引物；第二十七引物组包括序列表中序列116-119所示的DNA 组成的引物；第二十八引物组包括序列表中序列120-123所示的DNA组成的引物。

需要说明的是，第一引物组和第二引物组用于检测APC基因的甲基化，第三引物组、第四引物组和第五引物组用于检测BRCA1基因的甲基化，第六引物组、第七引物组和第八引物组用于检测CCND2基因的甲基化，第九引物组和第十引物组用于检测CST6基因的甲基化，第十一引物组、第十二引物组和第十三引物组用于检测GP5基因的甲基化，第十四引物组和第十五引物组用于检测GSTP1基因的甲基化，第十七引物组、第十七引物组、第十八引物组和第十九引物组用于检测PITX2基因的甲基化，第二十引物组、第二十一引物组和第二十二引物组用于检测RARB基因的甲基化，第二十三引物组、第二十四引物组和第二十五引物组用于检测RASSF1A基因的甲基化，第二十六引物组、第二十七引物组和第二十八引物组用于检测SOX17基因的甲基化。

不同引物组分别检测对应基因靶区域核酸序列中至少一段核酸序列的甲基化；其中，靶区域分别选自序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示、序列表的序列5所示、序列表的序列6所示、序列表的序列7、序列表的序列 8、序列表的序列9、序列表的序列10所示、序列表的序列11所示的DNA序列中的连续的至少15个碱基长度的片段；核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。试剂盒中，每种引物组均可以单独包装。

试剂盒还包括内参基因ACTB(NCBI基因库序列号：NM_001101.3)引物组，内参基因ACTB引物组用于以生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；内参基因ACTB引物组包括序列表中序列124-126所示的DNA组成的引物。

优选地，试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂，亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠；

优选地，试剂盒还包括阐述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

本发明还保护试剂盒在制备鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变产品中的应用。

优选地，乳腺癌状态或乳腺癌前病变包括乳腺癌易感性，乳腺癌的存在、进展、亚型和 /或分期。

本发明还保护一种检测APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种基因及其片段的甲基化的方法，包括步骤：S1：采集受试者的生物样品；S2：采用试剂盒检测生物样品中生物标志物基因的甲基化水平；其中，生物标志物基因包括APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A 和SOX17中的一种或多种；S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较。

优选地，还包括在受试者接受医疗处理后，重复步骤S1和S2，然后将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定受试者中乳腺癌状态或乳腺癌前病变的变化情况。

优选地，S1中，生物样品选自受试者的血液、血清、血浆、乳腺导管液、淋巴、脑脊液、尿和组织活检中的一种或多种。

优选地，S2中，包括检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平的步骤，靶区域分别为生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。

需要说明的是，本发明还保护一种鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的方法，包括步骤： S1：采集受试者的生物样品；S2：采用试剂盒检测生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中生物标志物基因选自基因APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种；S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，根据生物标志物基因的甲基化水平基于逻辑回归来判断受试者中的乳腺癌状态或乳腺癌前病变。

本发明提供的技术方案，通过联合利用检测APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因中一个或更多个基因或其片段的甲基化水平，使得乳腺癌状态或乳腺癌前病变检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，通过检测样本中的生物标志物基因甲基化DNA的方法，能方便地实现针对APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17 基因这10个生物标记物的检测，利用逻辑回归方程分析，快速、便捷地判断样本是否呈阳性及风险值，提供了一种快速的检测癌症的试剂盒。本发明所提供的方法和试剂盒为乳腺癌状态或乳腺癌前病变的预测、诊断和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例4中10种生物标志物基因甲基化水平的受试者工作特征(ROC)曲线图；

图2为发明实施例4中6种生物标志物基因APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5和 GSTP的甲基化在不同乳腺癌分期以及癌前病变中的水平分布图；

图3为发明实施例4中4种生物标志物基因PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17的甲基化在不同乳腺癌分期以及癌前病变中的水平分布图；

图4为发明实施例4中6种标志物基因APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5和GSTP 的甲基化在不同乳腺癌亚型以及癌前病变中的水平分布图；

图5为发明实施例4中4种标志物基因PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17的甲基化在不同乳腺癌亚型以及癌前病变中的水平分布图；

图6为发明实施例4中采用10种标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征 (ROC)曲线图；

图7为发明实施例4中采用5种最有特征性标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明采用的生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：APC(adenomatosispolypo sis coli)、BRCA1(Breast Cancer 1protein)、CCND2(cyclin D2)、CST6(cystatinE/M)、G P5(glycoprotein V platelet)、GSTP1(glutathione S-transferase pi 1)、PITX2(paired like h omeodomain 2)、RARB(retinoic acid receptor beta)、RASSF1A(Ras association domain f amily member 1)和SOX17(SRY-box 17)。

本发明所用的术语“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人)，或者，在预测易感性时“受试者”也可包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。

本发明所用的术语“群体”一般指健康人群。在提及特定疾病(如乳腺癌)时，“群体”可以包括不患有该特定疾病但可能患有其它疾病的人体。另外，还可以根据年龄、性别、健康状况、是否绝经等特征仅选择部分个体来作为“群体”。“群体中正常甲基化水平”可以通过对足够多的个体进行检测而得到，或者可以在已有的临床文献中找到。在一些情况下，该正常水平指无甲基化。

本发明所用的术语“乳腺癌状态”包括受试者对乳腺癌的易感性以及乳腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。在一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物基因的甲基化水平来预测该受试者对乳腺癌的易感性。在另一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物基因的甲基化水平来鉴定该受试者中是否存在乳腺癌；并且如果存在乳腺癌的话，鉴定其亚型和/或分期。乳腺癌亚型可包括非浸润性癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌以及其它浸润性癌。乳腺癌分期可以包括I期(IA、IB或IC)、II期、III期和IV期。在一些实施方案中，所述乳腺癌是I期乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是II期乳腺癌。在一些实施方案中，所述乳腺癌是III期乳腺癌。在另一些实施方案中，所述乳腺癌是IV期乳腺癌。

本发明所用的术语“癌前病变”是指继续发展下去具有癌变可能的某些乳腺病变，特指非典型性增生。在一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物基因的甲基化水平来鉴定该受试者中是否存在非典型性增生。

在本发明的方法中，还可以基于所述乳腺癌的分期来安排对受试者的治疗，例如，包括对受试者进行更多的测试、进行外科手术、进行药物治疗以及不采取进一步的行动。在另一些实施方案中，本发明的方法还包括在受试者经治疗后，再次测量受试者中APC、BRCA1、 CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因中的一种或更多种生物标志物基因或其片段的甲基化水平；并且使所述测量结果与乳腺癌状态相关联，以鉴定所述治疗是否导致受试者中乳腺癌状态的改变。在一些实施方案中，所述关联通过软件分类算法来进行。

本发明中对甲基化水平的检测包括从生物样品中提取DNA，并以亚硫酸氢盐处理，随后使用甲基化特异的引物对进行PCR扩增反应。其中亚硫酸氢盐处理造成DNA双链分子中未甲基化的胞嘧啶残基脱氨基，成为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。这样，在随后的PCR扩增反应中，模板上甲基化的胞嘧啶残基位点作为胞嘧啶残基与引物中的鸟嘌呤残基配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点作为尿嘧啶残基与引物中的腺嘌呤残基配对。本发明针对每种生物标志物基因设计了多个引物对，以检测每种生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，其中所述靶区域分别选自序列表中序列1-11所示的DNA(分别对应APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17)连续的至少15个碱基长度的片段；而所述引物对的核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。本发明提供的引物对利用该甲基化差异来检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平。当所述生物标志物基因的靶区域未甲基化时，所用的引物对不能在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，不能(或极少)生成扩增产物；而当所述生物标志物基因的靶基因被甲基化时，所用的引物对能够在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，从而生成扩增产物。这种扩增反应的差异可以在扩增反应进行过程中实时监测，或者可以通过检测扩增产物来判断。本发明经过多次试验，筛选出了针对所述生物标志物基因的多个引物对，它们单独或者联合使用，可帮助鉴定所述受试者中的乳腺癌状态及癌前病变。

本发明在提及检测甲基化水平时经常会使用术语“生物标志物基因或其片段”，是由于在PCR扩增反应中，所用的引物对在模板的选择上并不会区分是整个基因还是其片段，只要模板的长度不小于待扩增区域的长度即可(事实上，在提取DNA以及随后的亚硫酸氢盐处理过程中，通常会导致基因断裂成不同大小的片段)。

在一些优选实施方案中，本发明使用HeavyMethyl方法测量标志物基因甲基化，所以除了设计普通Taqman引物外，还设计了封闭引物。封闭引物在核苷酸序列上设计为与相应引物对所扩增区域内的一段模板序列配对结合。另外，封闭引物在3’-OH引入化学修饰，导致 DNA聚合酶无法扩增，该化学修饰例如为C3间臂(C3Spacer)、C6间臂(C6Spacer)、反转3’末端(inverted 3’end)、3’磷酸(3’P)等。在本发明方法的实施方案中，将封闭引物的核苷酸序列设计为与未甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合，而不与甲基化的模板(经亚硫酸盐处理) 结合。因而，在封闭引物所对应的区域内没有发生甲基化时，其可阻止相应扩增反应进行，从而提高本发明检测方法的特异性。

在本发明方法的更优选实施方案中，还包括利用荧光探针来实时监测和/或定量PCR扩增反应。所用探针5’端报告荧光基团可以为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、或Cy5；3’端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、或MGB。

本发明方法中对所述生物标志物基因的甲基化水平的检测包括检测所述生物标志物基因中是否存在甲基化、以及对该甲基化进行定量和定性检测。

生物样品选自提取自受试者的流体或组织，包括血液、血清、血浆、乳腺导管液、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检等，优选血浆、血清和乳腺导管液。

在本发明的方法中，还可以考虑受试者的年龄，用来预测所述受试者中的乳腺癌状态及癌前病变。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括提供乳腺癌预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，所述报告包括关于受试者中乳腺癌存在与否或其可能性或者关于受试者乳腺癌的等级化风险的预测。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括为医师建立生物标志物基因甲基化相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含生物标志物基因甲基化水平的报告的数据流。

在一些实施方案中，采用统计方法构建基于生物标志物基因的甲基化水平的诊断模型，所述统计方法选自以下方法：多元线性回归，查找表、决策树、支持向量机、Probit回归、逻辑回归、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。

在另一些实施方案中，提供了基于生物标志物基因甲基化水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式，用于评价生物标志物基因的相对甲基化水平。

利用本发明的方法可得到新的且重要的额外信息，其协助医师对患者患乳腺癌的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本发明提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的乳腺癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。

本发明的方法可用于评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其它类型癌症治疗手段的治疗效力。例如，可以在受试者治疗前后或者在治疗期间从所述受试者取得生物样品，并且按上文所述进行生物标志物基因甲基化水平的检测，通过检测结果鉴定所述受试者中癌症状态的变化，从而确定所述治疗效力。

本发明的方法还可用于鉴定受试者是否潜在地正在发生癌症。在随时间取自受试者的生物样品中检测生物标志物基因甲基化相对水平，从而将指向癌症特征的生物标志物甲基化水平改变解释为朝发生癌症方向进展。

所述生物标志物基因的组合提供了用于在乳腺癌进展不同分期中预测乳腺癌存在或检测乳腺癌的敏感、特异且准确的手段。对所述生物样品中甲基化水平的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，所公开的方法可用于预测或检测样品中乳腺癌的存在、乳腺癌的阶段、乳腺癌的亚型、乳腺癌的良性或恶性、乳腺癌的转移可能性、与乳腺癌有关的赘生物的组织学类型、癌症的无痛性或攻击性，以及与预防、诊断、表征和治疗患者乳腺癌有关的其它乳腺癌特征。

本发明的方法还可用于评估候选药物抑制乳腺癌的效力，评估乳腺癌疗法的效力，监测乳腺癌的进展，选择抑制乳腺癌的药剂或疗法，监测乳腺癌患者的治疗，监测患者中乳腺癌的抑制状况，以及通过检测测试化合物暴露后测试动物内生物标志物基因的甲基化水平，来评估测试化合物的致癌潜力。

本发明还提供了用于检测乳腺癌状态及癌前病变的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。DNA提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A 和清洗缓冲液B：清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种；pH 缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自EDTA、 EGTA和DEPC中的一种或多种。亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。其中，亚硫酸氢盐选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或多种；保护缓冲液由氧自由基清除剂组成，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或几种。

本发明的试剂盒包括用于APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因中一种或多种进行甲基化特异性PCR扩增反应的引物对。这些引物对分别检测对应基因靶区域核苷酸序列中至少一段核苷酸序列的甲基化。

本发明的试剂盒还可包括与上述引物对联合使用的封闭引物和探针(上文和下文有对这些封闭引物和探针的说明)。

在某些实施方案中，所述试剂盒还可包括使用试剂盒提取生物样品DNA和以亚硫酸氢盐试剂处理DNA的说明书。在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用试剂盒内试剂测量受试者中生物标志物水平的说明书。在又一些实施方案中，所述试剂盒包含使用该试剂盒以确定受试者中乳腺癌状态及癌前病变的说明书。

本发明还保护利用所述试剂盒检测生物标志物基因或其片段的甲基化水平的方法，包括如下步骤：采用DNA提取试剂提取生物样品内的DNA，将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；以及以处理后的DNA为模板，利用所提供的引物对来检测生物标志物基因甲基化水平。

生物标志物基因甲基化水平测量方法可选自以下方法中一种或多种：实时荧光PCR、数字PCR、重亚硫酸盐测序、甲基化特异性PCR、限制性内切酶分析法、高分辨溶解曲线技术、基因芯片技术和飞行时间质谱。

下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。

实施例1：DNA提取

DNA提取试剂由裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成。裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。其中蛋白变性剂为：盐酸胍；去垢剂为：Tween20；pH缓冲剂为：Tris-HCl；核酸酶抑制剂为：EDTA。

本实施例以乳腺癌患者血浆样品为例，提取血浆DNA。提取方法包括如下步骤：

(1)取1ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和Carrier RNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/ml，震荡混匀，55℃温育30min；

(2)加入100μl磁珠(购自Life technologies公司，货号：37002D)，振荡孵育1小时；

(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(4)加入1ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(6)加入1ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；

(10)加入100μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；

(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

实施例2：亚硫酸氢盐处理DNA

亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠和水的混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚和水的混合液体。

本实施例以实施例1提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体步骤包括：

(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液：称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液；

(2)配制保护缓冲液：称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液；

(3)将100μl DNA溶液、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀；

(4)热循环：95℃5min，80℃60min，4℃10min；

(5)将1ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震荡孵育1h；

(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(7)加入0.5ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(9)加入0.5ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min；

(13)加入50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

实施例3：实时荧光PCR检测DNA甲基化及引物组验证

本实施例以实时荧光PCR为例测量生物标志物基因的甲基化水平。检测基因为APC、B RCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因，内参基因为ACTB。本实施例采用实施例2经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行实时荧光 PCR扩增。待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测。

对于APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和S OX17基因，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行验证。

因此，本发明针对APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、R ASSF1A和SOX17基因设计了多种引物和探针，其分别等同于、互补于或杂交于序列表的序列1-11所示的序列的至少15个核苷酸及其互补序列；再用甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证引物和探针的有效性。本发明通过实时荧光PCR扩增结果筛选出以下最佳的引物组和内参基因ACTB的引物组：

第一引物组(APC引物组1)

引物1：SEQ ID NO 12:5’-TCGCGAGGGTATATTTTCGAGG-3’

引物2：SEQ ID NO 13:5’-ATCCGCATCCAACGAATTACAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 14:5’-TTGAGGGGTATGGGGTTAGGGTTAGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 15:5’-HEX-ACACAAAACCCCGCCCAACCG-BHQ1-3’

第二引物组(APC引物组2)

引物1：SEQ ID NO 16:5’-GGCGTTTTTTATTTTCGTCGGG-3’

引物2：SEQ ID NO 17:5’-TACCCCATTTCCGAATCCGAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 18:5’-GTTTTTTATTTTTGTTGGGAGTTTGTTGATTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 19:5’-HEX-TACGCCCACACCCAACCAATCG-BHQ1-3’

第三引物组(BRCA1引物组1)

引物1：SEQ ID NO 20:5’-TACGTTATTCGGGGGTAGATTGG-3’

引物2：SEQ ID NO 21:5’-CGCGCTTTTCCGTTACCAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 22:5’-TGTTATTTGGGGGTAGATTGGGTGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 23:5’-TexasRed-AAACCAAACGTCTCTCGAAACTCTAAATTAAC- BHQ2-3’

第四引物组(BRCA1引物组2)

引物1：SEQ ID NO 24:5’-ACGTCGGTTGGTTATGAGGTTAG-3’

引物2：SEQ ID NO 25:5’-CGAATTCTAACGATTCTCCTACCTC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 26:5’-TGTTGGTTGGTTATGAGGTTAGGAGTTTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 27:5’-TexasRed-AAACGAAATTTCACCACGTTAATCAAACT-BHQ2 -3’

第五引物组(BRCA1引物组3)

引物1：SEQ ID NO 285’-GCGTGGGAGAGTGGATTTTCG-3’

引物2：SEQ ID NO 29:5’-TCCTCAACGCTTCCCTCGC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 30:5’-TGTGGGAGAGTGGATTTTTGAAGTTGATAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 31:5’-TexasRed-AAATTCCGCCCCTACCCCCCG-BHQ2-3’

第六引物组(CCND2引物组1)

引物1：SEQ ID NO 325’-TACGGTTTATTTAGTTCGCGTTTTAT-3’

引物2：SEQ ID NO 33:5’-CCAACGCCCTAATATACTAACCAAACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 34:5’-TTTAGTTTGTGTTTTATTTTGTTTTGTTGGTTTTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 35:5’-TexasRed-AAACCCGAACAAAAACGCGAAAAAC-BHQ2-3’

第七引物组(CCND2引物组2)

引物1：SEQ ID NO 36:5’-TGCGTTAGAGTACGTGTTAGGGTC-3’

引物2：SEQ ID NO 37:5’-CGAATAAAAAATTAAATCCGACTCC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 38:5’-GAGTATGTGTTAGGGTTGATTGTGTTGGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 39:5’-TexasRed-AACCGACTACGATAAAATCGCCGCC-BHQ2-3’

第八引物组(CCND2引物组3)

引物1：SEQ ID NO 40:5’-GTTGTATCGGTGTGGTTACGTTTAGC-3’

引物2：SEQ ID NO 41:5’-TCTAAAAACTCTTCGAACGCCGT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 42:5’-ATTGGTGTGGTTATGTTTAGTGTAGATATTTTGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 43:5’-TexasRed-TCGCCCCTACATCTACTAACAAACCGC-BHQ2-3’

第九引物组(CST6引物组1)

引物1：SEQ ID NO 44：5’-GAAGCGTTTTGGTACGCGG-3’

引物2：SEQ ID NO 45：5’-ATACGCCCCCGCGACCT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 46：5’-TGTTTTGGTATGTGGGTGTGTGTTGTTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 47：5’-FAM-TACGAAATTCAAAAAACCCAAAAAACCG-BHQ1-3’

第十引物组(CST6引物组2)

引物1：SEQ ID NO 48：5’-TTTTTCGTTGGCGTTGGGT-3’

引物2：SEQ ID NO 49：5’-ACACCTACGAATCGTCGAACGAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 50：5’-TGTTGGTGTTGGGTTTGGTTTTGGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 51：5’-FAM-TCGCGTAACAACGCCAAAAAACAAAAT-BHQ1-3’

第十一引物组(GP5引物组1)

引物1：SEQ ID NO 52:5’-TCGAAGAGTATTTTCGGGAGTTTTG-3’

引物2：SEQ ID NO 53:5’-TTAACGCTTTCGAAAAACCACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 54:5’-TTTTGGGAGTTTTGTTAGTGGGTTTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 55:5’-TexasRed-TACGCTCTTTCTTCATTCGCACAATCTAAC-BHQ2 -3’

第十二引物组(GP5引物组2)

引物1：SEQ ID NO 56:5’-TAGCGTATTTGGAAGATGCGTGAT-3’

引物2：SEQ ID NO 57:5’-TAACCGTCCTACAACGCCTCATAAT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 58:5’-GATGTGTGATTTTGTTGTGTGATAGTTTTAGGGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 59:5’-TexasRed-TACCCCCGACACCTTCAATAACCTAATAAAAC-B HQ2-3’

第十三引物组(GP5引物组3)

引物1：SEQ ID NO 60:5’-TTGGCGGATAGGGGAAGGGT-3’

引物2：SEQ ID NO 61:5’-ACGCGAACGCTCCTATATATTAACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 62:5’-TGGATAGGGGAAGGGTTGGGTGTGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 63:5’-TexasRed-TCTACTATACGCGATACTCGAACTTCTACGCG-B HQ2-3’

第十四引物组(GSTP1引物组1)

引物1：SEQ ID NO 64:5’-TTTCGGTTAGTTGCGCGG-3’

引物2：SEQ ID NO 65:5’-CTAAAAAATCCCGCGAACTCC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 66:5’-TTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 67:5’-JOE-ACCGCAAAAAAACGCCCTAAAATC-BHQ1-3’

第十五引物组(GSTP1引物组2)

引物1：SEQ ID NO 68:5’-TCGTTGGAGTTTCGTCGTCGT-3’

引物2：SEQ ID NO 69:5’-AACCCCCGTCCCGAATCT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 705’-GGAGTTTTGTTGTTGTAGTTTTTGTTATTAGTGAG-C3- 3’

探针：SEQ ID NO 71:5’-JOE-ACGCGAACCGCGCGTACTCACT-BHQ1-3’

第十六引物组(PITX2引物组1)

引物1：SEQ ID NO 72:5’-TTCGTGTGGGGAGTGACGTGAC-3’

引物2：SEQ ID NO 73:5’-TCGTTTCTCGTCGCCCCTACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 745’-GTGGGGAGTGATGTGATGTTAGTAGAGATTTTATT-C3- 3’

探针：SEQ ID NO 75:5’-HEX-ACCGCCCGCGCGCCACTATAC-BHQ1-3’

第十七引物组(PITX2引物组2)

引物1：SEQ ID NO 76：5’-CGGAGTCGGGAGAGCGAAAG-3’

引物2：SEQ ID NO 77：5’-TAAAACTACCGAATTAACGCAAATTACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 78：5’-TTGGGAGAGTGAAAGGAGAGGGGATT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 79：5’-HEX-TCCTCGATTAACTCCTAAATACCCCGCC-BHQ1-3’

第十八引物组(PITX2引物组3)

引物1：SEQ ID NO 80：5’-TGAGGAGACGGTCGATAGTTTGG-3’

引物2：SEQ ID NO 81：5’-ACGAACAACGACGACTACGAAAACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 82：5’-GAGATGGTTGATAGTTTGGTTTTTGTTGTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 83：5’-HEX-TAAAAAACCCGCTTCACTTAAAACACCG-BHQ1-3’

第十九引物组(PITX2引物组4)

引物1：SEQ ID NO 84：5’-GAGACGGAAAGTTAGCGGGTAAAC-3’

引物2：SEQ ID NO 85：5’-CAAAACGCGATCGACGTTAACT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 86：5’-ATGGAAAGTTAGTGGGTAAATGAAGATATGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 87：5’-HEX-TACTCCCTAAAAACGCTCTAAATAATACCCTTCT-B HQ1-3’

第二十引物组(RARB引物组1)

引物1：SEQ ID NO 88：5’-GCGTATAGAGGAATTTAAAGTGTGG-3’

引物2：SEQ ID NO 89：5’-ACGCCTTTTTATTTACGACGACTTAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 90：5’-TTATTTACAACAACTTAACTTAAAAAACAATATTCC ACC-C3-3’

探针：SEQ ID NO 91：5’-FAM-TATTCCGCCTACGCCCGCTCG-BHQ1-3’

第二十一引物组(RARB引物组2)

引物1：SEQ ID NO 92：5’-GAATTTTTTTATGCGAGTTGTTTGAGG-3’

引物2：SEQ ID NO 93：5’-TTCCGAATACGTTCCGAATCCTACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 94：5’-TTATGTGAGTTGTTTGAGGATTGGGATGTTGAG-C3- 3’

探针：SEQ ID NO 95：5’-FAM-AACAAACCCTACTCGAATCGCTCGCG-BHQ1-3’

第二十二引物组(RARB引物组3)

引物1：SEQ ID NO 96：5’-TGGGAATTTTTCGTTTCGGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 97：5’-ACACGTAAACTATTAATCTTTTTCCCAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 98：5’-CATAAACTATTAATCTTTTTCCCAACCCCAAATC-C3- 3’

探针：SEQ ID NO 99：5’-FAM-TCATTTACCATTTTCCAAACTTACTCGACC-BHQ1-3’

第二十三引物组(RASSF1A引物组1)

引物1：SEQ ID NO 100:5’-AAGGAAGGGTAAGGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 101:5’-CGAACGAAACCACAAAAC-3

封闭引物：SEQ ID NO 102:5’-GTGGGGGGGGTTTTGTGAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 103:5’-FAM-AACCCCGACTTCAACGCCTC-BHQ1-3’

第二十四引物组(RASSF1A引物组2)

引物1：SEQ ID NO 104:5’-TTGTTAGCGTTTAAAGTTAGC-3’

引物2：SEQ ID NO 105:5’-TAAAATTACACGCGATACCC-3

封闭引物：SEQ ID NO 106:5’-AGTGTTTAAAGTTAGTGAAGTATGGGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 107:5’-FAM-ACACGCTCCAACCGAATACGACC-BHQ1-3’

第二十五引物组(RASSF1A引物组3)

引物1：SEQ ID NO 108:5’-TCGTTTTTAGTTCGCGG-3’

引物2：SEQ ID NO 109:5’-TTAACTACCCCTTCCGCT-3

封闭引物：SEQ ID NO 110:5’-TAGTTTGTGGGGTTTGTTATGTATATGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 111:5’-FAM-ACAAACCTTTACGCACGACGCCC-BHQ1-3’

第二十六引物组(SOX17引物组1)

引物1：SEQ ID NO 112:5’TTCGGTCGTTTGGGTTTGC-3’

引物2：SEQ ID NO 113:5’-CAAAAACGAATCCCGTATCCG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 114:5’-TTGTTTGGGTTTGTGATTTGGATTTATTTAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 115:5’-HEX-TCCAAACCTACACAACGCCGAATTAAAC-BHQ1-3’

第二十七引物组(SOX17引物组2)

引物1：SEQ ID NO 116:5’-TTAGTTCGGTTATTATCGCGGGT-3’

引物2：SEQ ID NO 117:5’-CGCGCAACCCTCGAAACAT-3’

封闭引物：SEQ ID NO 118:5’-TGGTTATTATTGTGGGTAGTGTGTTTTGGGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 119:5’-HEX-TACGCCAATAACGACCAAAACCAAACC-BHQ1-3’

第二十八引物组(SOX17引物组3)

引物1：SEQ ID NO 120:5’-TCGCGGTTTGGTTTATAGCGT-3’

引物2：SEQ ID NO 121:5’-TAAAACTCGAACCACGACCTAAACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 122:5’-TGGTTTGGTTTATAGTGTATTTAGGGTTTTTAGTTG- C3-3’

探针：SEQ ID NO 123:5’-HEX-CGCCCGCAATATCACTAAACCGACT-BHQ1-3’

内参基因ACTB引物组

引物1：SEQ ID NO 124:5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’

引物2：SEQ ID NO 125:5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’

探针：SEQ ID NO 126:5’-Cy5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ3- 3’

多组引物和探针均能区分甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测APC、BRCA1、C CND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因甲基化的引物和探针。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于APC、BR CA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因的甲基化检测。下表1、表2和表3显示了采用各个引物和探针组合对上述基因的甲基化和非甲基化模板(经亚硫酸氢盐处理)的检测结果。显然，所设计的各个引物和探针组合是对于甲基化模板是高度特异性的。

表1所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果之一(Ct，均值)

表2所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果之二(Ct，均值)

表3所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果之三(Ct，均值)

此外，本发明采用不同癌症患者和健康人DNA作为模板进一步验证引物和探针组合的有效性。将5例乳腺癌、3例肝癌和5例健康人的血浆样本采用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板。利用上述多个引物和探针组合，进行实时荧光PCR实验。分别测得癌症样本和健康人样本的各种标志物基因 Ct值，结果见下表4、表5和表6，其中表4显示的为APC、BRCA1、CCND2以及CST6 引物组检测结果，表5显示的为GP5、GSTP1、PITX2以及RARB引物组检测结果，表6 显示的为RARB、RASSF1A以及SOX17引物组检测结果。

表4各引物组对已知乳腺癌状态个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果之一

缩写：BC：乳腺癌；HeCa：肝癌；Con：健康

表5各引物组对已知乳腺癌状态个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果之二

	GP5-1	GP5-2	GP5-3	GSTP1-1	GSTP1-2	PITX2-1	PITX2-2	PITX2-3	PITX2-4	RARB-1
											BC 1	33.44	35.1	34.39	37.59	34.94	31.98	35.21	33.85	34.73	31.01
BC 2	34.62	34.61	35.51	36.81	38.07	33.36	33.86	33.7	34.12	30.86
											BC 3	33.93	35.12	34.45	37.16	38.34	31.99	34.74	33.26	35.44	34.05
BC 4	34.78	35.26	35.78	38.26	36.63	32.5	35.39	34.42	34.14	31.55
											BC 5	34.3	34.22	35.52	37.47	34.74	34.17	33.41	34.37	34.66	32.46
HeCa 1	42.28	No Ct	41.98	No Ct	No Ct	No Ct	43.56	No Ct	No Ct	41.86
											HeCa 2	No Ct	44.29	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	41.28	43.56	42.49	No Ct
HeCa 3	41.75	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	42.39	No Ct	42.49	No Ct	No Ct
											Con 1	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct
Con 2	42.87	No Ct	No Ct	No Ct	43.98	No Ct	No Ct	No Ct	42.19	No Ct
											Con 3	No Ct	No Ct	No Ct	42.85	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct
Con 4	No Ct	43.58	No Ct	No Ct	No Ct	44.32	No Ct	43.75	No Ct	No Ct
											Con 5	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	41.28	43.26	No Ct

缩写：BC：乳腺癌；HeCa：肝癌；Con：健康

表6各引物组对已知乳腺癌状态个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果之三

	RARB-2	RARB-3	RASSF1A-1	RASSF1A-2	RASSF1A-3	SOX17-1	SOX17-2	SOX17-3
									BC 1	34.08	33.8	32.27	33.16	32.98	34.69	31.86	32.71
BC 2	33.88	33.27	33.44	33.87	33.73	33.59	32.35	33.66
									BC 3	34.92	33.76	33.16	34.35	35.64	32.52	32.34	31.65
BC 4	33.01	34.99	32.54	34.74	33.87	34.47	31.01	34.39
									BC 5	33.03	34.86	34.7	35.48	33.86	33.05	34.71	35.05
HeCa 1	No Ct	No Ct	No Ct	41.87	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct
									HeCa 2	42.36	No Ct	42.82	42.62	No Ct	No Ct	40.87	No Ct
HeCa 3	43.98	41.46	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	41.36
									Con 1	No Ct	No Ct	41.28	No Ct	No Ct	No Ct	42.18	No Ct
Con 2	No Ct	41.62	No Ct	41.29	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct
									Con 3	42.34	No Ct	No Ct	42.71	No Ct	43.29	43.29	No Ct
Con 4	No Ct	44.39	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	41.21
									Con 5	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct

缩写：BC：乳腺癌；HeCa：肝癌；Con：健康

从以上癌症患者和健康人样本的APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因甲基化检测的Ct值可以看出，以上各个引物和探针组合对乳腺癌甲基化DNA有高度特异性扩增，其它癌症和健康人无扩增或者扩增Ct值大于40。虽然不同组的引物和探针组合对乳腺癌样本的扩增Ct值有些差异，但都明显区别于其它癌症和健康人样本，因此以上各个引物组合均适用于乳腺癌检测。

实施例4：试剂盒检测乳腺癌前病变及乳腺癌患者、良性病症患者血浆的灵敏度和特异性

使用来自病理学上确定乳腺癌的患者的246个样品和来自病理学上确定为非典型性增生的患者68个样品，以及来自病理学上确定为良性病症的患者的258个样品(见表7)，所有样本都收集自中国人民解放军海军总医院。乳腺癌样品包括疾病的所有分期和常见亚型。乳腺癌患者都是通过影像学及病理学诊断确诊的，样本分期基于国际TNM分期标准，样本亚型依据组织活检及免疫组化方法确定。良性样品包括在整个研究群体中看到的良性病症的常见类型。在外科手术后得到完整临床病理学报告，包括患者年龄、月经、人种、分期、亚型并且对每个样品编码收集地点。

表7所采集样品对象的乳腺癌分期以及其它特征

用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法用亚硫酸氢盐处理DNA模板，再利用实施例3中提供的引物和探针组合(针对每个生物标志物基因都采用引物组1)进行实时荧光PCR实验，检测APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17基因和内参基因ACTB，最后得出健康人和乳腺癌前病变及乳腺癌患者样本各个基因的Ct值。如上文实施例3所描述的，可以通过该Ct值反映各基因的甲基化水平。

使用可商购软件包(IBM SPSS Statistics 24和MedCalc11.4.2.0，分别购自IBM和MedCalc) 进行血浆生物标志物水平的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线和图形展示。使用非参数Kruskal-Wallis检验(ANOVA)，然后使用Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，P值<0.05视为统计学显著。

使用实时荧光PCR测定，在来自病理学确定乳腺癌的246名患者和具有癌前病变的68 名患者，以及具有良性乳腺疾病的258名个体的血浆中，检测了上述10种标志物基因的甲基化水平。为了有助于确定这些生物标志物基因区分症状相似的癌症与良性乳腺疾病的能力，所有样品从相同的临床群体中得到。在任何介入之前和己知疾病状态之前就收集所有的样品。随后通过离体组织的病理学检查来确定疾病状态。使用单一的样品收集方案来收集血浆，监测顺从性。这确保了样品质量并且消除了样品集合中的任何收集、加工和生物偏倚的可能性。在该研究中没有使用正常的健康样品，原因是它们通常比良性病症更容易被区分。这些样本显示，患乳腺癌的个体中的平均患者年龄(60岁)比患良性病症(50岁)的那些个体高，并且都随疾病表现的分期进展而增加(表7)。总体上，乳腺癌亚型的分布与人群中所有乳腺癌病例所见分布相类似，其中浸润性癌的比例(80％)比其它乳腺癌高)。研究中的良性对照代表常见良性乳腺疾病，包括乳腺炎以及乳腺囊肿等。

对于每种生物标志物的甲基化水平检测数据，使用MedCalc11.4.2.0软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线并且计算其曲线下面积(AUC)值。相对于良性乳腺疾病，乳腺癌前病变及乳腺癌样品中10种生物标志物基因甲基化水平AUC均大于0.75(P值＜0.05)，AUC在0.75-0.86之间(见图1和表8)。

表810种标志物基因受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)

为了确定某些生物标志物基因是否对癌症的不同分期(特别是早期)以及癌前病变具有更大的区分度，比较10种生物标志物基因(图2和图3)在I期和II期(标志物检测最重要时期) 样品中的区分度。对于I期样品，APC和RASSF1A二者具有很高的区分度(P值＜0.001)，然后以降序排列为CCND2，RARB、BRCA1和GSTP1(P值0.001至0.01)，然后是CST6和SOX17(P值0.01至0.05)。对于GP5和PITX2，在I期癌症与良性病症之间没有显著性差异 (P值＞0.05)。对于II期样品，APC和RASSF1A二者再次具有很高的区分度(P值＜0.001)，然后是CCND2、RARB、BRCA1和CST6(P值0.001至0.01)，然后是GSTP1和SOX17(P值 0.01至0.05)。GP5和PITX2没有显著性差异(P值＞0.05)。对于非典型性增生样品，BRCA1 和RARB具有很高的区分度(P值0.001至0.01)，然后以降序排列为CCND2，APC、CST6、RASSF1A、GSTP1和SOX17(P值0.01至0.05)，GP5和PITX2没有显著性差异(P值>0.05)。

还评价了上述生物标志物基因的甲基化水平在来自良性病症与各种亚型乳腺癌前病变及乳腺癌的样品之间是否有统计显著性差异(图4和图5)。对于非浸润性癌，RARB和RASSF1A具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为CCND2、APC、BRCA1、CST6、GSTP1和SOX17(P值0.001至0.05)。对于浸润性导管癌，APC、CCND2和RASSF1A具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为RARB、BRCA1、GSTP1、PITX2、CST6、 GP5和SOX17(P值0.001至0.05)。对于浸润性小叶癌，CCND2和RASSF1A具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为APC、RARB、BRCA1、GSTP1、CST6、SOX17、GP5 和PITX2(P值0.001至0.05)。对于其它浸润性癌，CCND2和RARB具有很高的区分度(P 值<0.001)，然后以降序排列为BRCA1、APC、RASSF1A、GSTP1、CST6、SOX17、GP5 和PITX2(P值0.001至0.05)。对于非典型性增生，BRCA1和RARB具有很高的区分度(P 值0.001至0.01)，然后以降序排列为CCND2，APC、CST6、RASSF1A、GSTP1和SOX17(P 值0.01至0.05)，GP5和PITX2没有显著性差异(P值>0.05)。

就操作简单和降低成本而言，检测单个生物标志物基因的甲基化水平优于检测多种生物标志物基因的甲基化水平。然而，清楚的是，单个生物标志物基因的甲基化水平可能无法提供复杂疾病的固有多样性信息，所以经常还需要构建采用多标志物的诊断模型。多标志物诊断模型需要使用统计分析方法进行，以下以逻辑回归模型为例构建甲基化基因标志物诊断模型来检测乳腺癌前病变及乳腺癌。

逻辑回归模型的训练通过如下方式进行：将样本分成病例和对照，然后使用IBMSPSS Statistics 24软件来优化回归系数。对于每种标志物都有一个回归系数，加上一个偏差参数，使得逻辑回归模型用于训练数据的似然性最大化。

训练后，回归系数集合就限定了逻辑回归模型。通过将生物标志物的甲基化水平放入逻辑回归方程中，本领域技术人员可容易地使用这种类型的诊断模型来预测任何新样品鉴定为病例或对照的可能性。

上述10种标志物基因甲基化水平AUC均大于0.75，接下来本发明使用逻辑回归组合了 10种标志物基因，产生的AUC为0.966(标准误差：0.010；95％CI：0.931-0.987；P值：<0.0001) (图6)。为了让监测分析方法更简单，再将AUC值较大的5种标志物基因组合并建立逻辑回归模型。得到的AUC值为0.922(标准误差：0.017；95％CI：0.875-0.955；P值：<0.0001)(图 7)。通过在固定特异性值下确定模型的灵敏度和在固定灵敏度值下确定模型的特异性来进一步比较两种模型(表9和表10)。例如可以选择当方法的灵敏度高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约155％；或者当方法的特异性高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约 160％。一般来说，10种标志物比5种标志物的逻辑回归模型的灵敏度和特异性稍好些，基于操作分析程序和成本考虑，5种标志物组合也是比较好的选择。

表9 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要特异性阈值时的灵敏度

表10 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要灵敏度阈值时的特异性

需要指出的是，本实施例提供的甲基化水平检测结果是采用针对各个生物标志物基因的引物组1得到的(例如，对于APC基因，采用APC引物组1；对于BRCA1基因，采用BRCA1引物组1，以此类推)，但采用本发明提供的另外引物组，得到类似的检测结果(数据未示出)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明说明书的范围中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司

<120> 用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒及其应用

<130> 3

<160> 126

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 483

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gagatgtaat ttattactct ccctcccacc tccggcatct tgtgctaatc cttctgccct 60

gcggacctcc cccgactctt tactatgcgt gtcaactgcc atcaacttcc ttgcttgctg 120

gggactgggg ccgcgagggc atacccccga ggggtacggg gctagggcta ggcaggctgt 180

gcggttgggc ggggccctgt gccccactgc ggagtgcggg tcgggaagcg gagagagaag 240

cagctgtgta atccgctgga tgcggaccag ggcgctcccc attcccgtcg ggagcccgcc 300

gattggctgg gtgtgggcgc acgtgaccga catgtggctg tattggtgca gcccgccagg 360

gtgtcactgg agacagaatg gaggtgctgc cggactcgga aatggggtag gtgctggagc 420

caccatggcc aggcttgctg cggggggagg ggggaaggtg gttttccctc gcactgtctt 480

aaa 483

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

cctcttccgt ctctttcctt ttacgtcatc cgggggcaga ctgggtggcc aatccagagc 60

cccgagagac gcttggctct ttctgtccct cccatcctct gattgtacct tgatttcgta 120

ttctgagagg ctgctgctta gcggtagccc cttggtttcc gtggcaacgg aaaagcgcgg 180

gaattacaga taaattaaaa ctgcgactgc gcggcgtgag ctcgctgaga cttcctggac 240

gggggacagg ctgtggggtt tctcagataa ctgggcccct gcgctcagga ggccttcacc 300

ctctgctctg ggtaaaggta gtagagtccc gggaaaggga cagggggccc aagtgatgct 360

ctggggtact ggcgtgggag agtggatttc cgaagctgac agatgggtat tctttgacgg 420

ggggtagggg cggaacctga gaggcgtaag gcgttgtgaa ccctggggag gggggcagtt 480

tgtaggtcgc gagggaagcg ctgaggatca ggaagggggc actgagtgtc cgtgggggaa 540

tcctcgtgat aggaactgga atatgccttg agggggacac tatgtcttta aaaacgtcgg 600

ctggtcatga ggtcaggagt tccagaccag cctgaccaac gtggtgaaac tccgtctcta 660

ctaaaaatac aaaaattagc cgggcgtggt gccgctccag ctactcagga ggctgaggca 720

ggagaatcgc tagaacccgg gaggcggagg ttgcagtgag ccgagatcgc gccattgcac 780

tccagcctgg gcgacagagc gagactgtct caaaacaaaa caaaacaa 828

<210> 3

<211> 897

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

aagaggctgg ctccggggcc tgagttaatc gcttgcacct ctagtttatt cgctcccctc 60

ctccgccttg cagggaacct agtgtacggc tcacccagcc cgcgccccac cccgccttgc 120

tggctctccg cgcccctgcc cgggccccct ctctcggtga gggaggcact cagtcggcct 180

cggtgtgccc agagagctcg agccacgcca tgcccgctgc acgtgccagc ttggccagca 240

catcagggcg ctggtctctc cccttcctcc tggagtgaaa tacaccaaag ggcgcggtgg 300

gggtgggggg tgacgggagg aaggaggtga agaaacgcca ccagatcgta tctcctgtaa 360

agacagcctt gactcaagca tgcgttagag cacgtgtcag ggccgaccgt gctggcggcg 420

acttcaccgc agtcggctcc cagggagaaa gcctggcgag tgaggcgcga aaccggaggg 480

gtcggcgagg atgcgggcga aggaccgagc gtggaggcct catgcctccg gggaaaggaa 540

ggggtggtgg tgtttgcgca gggggagcga gggggagccg gacctaatcc ctcactcgcc 600

ccctccccct cccgggccat ttcctagaaa gctgcatcgg tgtggccacg ctcagcgcag 660

acacctcggg cggcttgtca gcagatgcag gggcgaggaa gcgggttttt cctgcgtggc 720

cgctggccgc gggggaaccg ctgggagccc tgcccccggc ctgcggcggc cctagacgct 780

gcaccgcgtc gccccacggc gcccgaagag cccccagaaa cacgatggtt tctgctcgag 840

gatcacattc tatccctcca gagaagcacc ccccttcctt cctaataccc acctctc 897

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

gtaagagccc acgaagagct gcggttggta gttcattctg gacagccctc ccgtgaaccg 60

tccctgtact ggcacttgtt gctggggact gtcgctgtcc tctccctccc cgggccaggt 120

gtgtcctgga gggcagggaa gcgtcttggc acgcgggtgc gcgccgcccc ctcggcctcc 180

tgggctccct gaacctcgca ggaccccggc aacttcgagc cccgccccag ctccaggccg 240

cgggggcgca tcgcgggcgt cgggcggggc ggcccagcgg gtaaaagctg cgcggccgca 300

agctcggcac tcacggctct gagggctccg acggcactga cggccatggc gcgttcgaac 360

ctcccgctgg cgctgggcct ggccctggtc gcattctgcc tcctggcgct gccacgcgac 420

gcccgggccc ggccgcagga gcgcatggtc ggagaactcc gggacctgtc gcccgacgac 480

ccgcaggtgc agaaggcggc gcaggcggcc gtggccagct acaacatggg cagcaacagc 540

atctactact tccgagacac gcacatcatc aaggcgcaga gccaggtgcg gcgggcgggg 600

tgctgggagg ggacacccgg c 621

<210> 5

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

ccgcgggctc agagtcaccc ctaagtaccg caggcggctc aggttgcgga aggcggcggc 60

gggcagggtg cgcagctggg tgcggttcag ccacagctcc tgcaggcccc ccatctcccc 120

gaagagcacc cccgggagct ctgccagcgg gttctcgaac agagtcaaca gagtcagatt 180

gtgcgaatga agaaagagcg cagaggggag aaacgcaagg tggtttctcg aaagcgtcaa 240

agaactgagg tttgggagcc ggtcgaaggc cccgggtgcg atggaacgga tgtgatttcg 300

gtggaactgc agctccgtca gggcgcccag gctgttcaac agccccgaat ccagagacac 360

aaggcggttc gagtggagca gaagtctctc gagcttagcc tgtgctccaa gcaacccctt 420

gggcaggtgg gtcaggttgt ttcccgataa atccaacaac ttcaggttct ccagattcgt 480

gaagagactg gcaggaagga aatcgagctg attctggttc agagcgagct cctgcaggtt 540

aaccagtttc tgaaacatgt tttggtcaat gccccttagc gcattgtggt ccaaaaacaa 600

ctgctccagg agcaccatct tatccagcag cgcacctgga agatgcgtga ttttgttgcg 660

cgacagcctc agggttttca gttttatcag gtcactgaag gtgccggggg caacggcgga 720

aatgtggctg tcggagatca tgaggcgctg caggacggtc atgccgctga agctctggct 780

ctgcaggacg ccgcggccca ttccgaagag caggatgtgc gtgaggttgg tgggcaggcc 840

tagcgcggag atgcgcgcca cgtcgccccc cgagcactgc gcggcgtccc ggaagacaca 900

cttgcaagct ggcggacagg ggaagggctg ggcgcgcaga agcccgagca ccgcgcacag 960

tagagtcccc ctcagcatgt ctgaaaaagc aaccgtggga gtgtggtcaa cacacaggag 1020

cgttcgcgcc tgtactgaac cctgggatcc 1050

<210> 6

<211> 730

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

tgaagcgggt gtgcaagctc cgggatcgca gcggtcttag ggaatttccc cccgcgatgt 60

cccggcgcgc cagttcgctg cgcacacttc gctgcggtcc tcttcctgct gtctgtttac 120

tccctaggcc ccgctgggga cctgggaaag agggaaaggc ttccccggcc agctgcgcgg 180

cgactccggg gactccaggg cgcccctctg cggccgacgc ccggggtgca gcggccgccg 240

gggctggggc cggcgggagt ccgcgggacc ctccagaaga gcggccggcg ccgtgactca 300

gcactggggc ggagcggggc gggaccaccc ttataaggct cggaggccgc gaggccttcg 360

ctggagtttc gccgccgcag tcttcgccac cagtgagtac gcgcggcccg cgtccccggg 420

gatggggctc agagctccca gcatggggcc aacccgcagc atcaggcccg ggctcccggc 480

agggctcctc gcccacctcg agacccggga cgggggccta ggggacccag gacgtcccca 540

gtgccgttag cggctttcag ggggcccgga gcgcctcggg gagggatggg accccggggg 600

cggggagggg gggcagactg cgctcaccgc gccttggcat cctcccccgg gctccagcaa 660

acttttcttt gttcgctgca gtgccgccct acaccgtggt ctatttccca gttcgaggta 720

ggagcatgtg 730

<210> 7

<211> 550

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

actccgtgtg gggagtgacg tgacgtcagc agagattcca ccaaactcca ctgcacagtg 60

gcgcgcgggc ggccggccga gcccggctgc gcggctggcg atccaggagc gagcacagcg 120

cccgggcgag cgccgggggg agcgagcagg ggcgacgaga aacgaggcag gggagggaag 180

cagatgccag cgggccgaag agtcgggagc cggagccggg agagcgaaag gagaggggac 240

ctggcggggc acttaggagc caaccgagga gcaggagcac ggactcccac tgtggaaagg 300

aggaccagaa gggaggatgg gatggaagag aagaaaaagc aatctgcgcc aacccggcag 360

ccctaataaa tcaaaggggg agcgccaggg cagcggggag acagaaacgt acttttgggg 420

agcaaatcag gacgggctgg gaggaagcga cagggaaagt ggcccaagag acggaacaaa 480

ggacaatgtt catggggttg tttgggacga ggcgtgtgga gtgtgggtgt gagcgtgcgt 540

gtgtgacctt 550

<210> 8

<211> 552

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

tggaggagtc cagcgaccgg ggctgaccgg gagccagaac cgaagccatg gctaacggct 60

ggggatggtg acaggaagat gaggagacgg ccgacagctt ggtccccgct gctcggtgct 120

ccaagtgaag cgggcctttc atgcagttca tggacgaggg agcgcgacgc tctactagtc 180

cttggctact gccccgccga gcccccgtag ccgccgctgc ccgctccggg tcgcgctcta 240

ggcgcggagt ttccccgctg cggggagagc caggggacgc aacccccgcc gagttctcaa 300

gccaagctgc ccccgtctcc tccggaaggc tcaagcgaaa aagtccggag acggaaagtc 360

agcgggcaaa cgaagacatg ggatgtgggc agaagggcac cactcagagc gtctttaggg 420

agcaggcttc caagctccaa agcgaaacaa gagtgggcaa agaccccctt cttctctccc 480

tccctccccc aagaacccct ccaataagga aagctaacgc cgaccgcgct ctgcccgccc 540

cccccccacg cg 552

<210> 9

<211> 828

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

acagacagaa aggcgcacag aggaatttaa agtgtgggct ggggggcgag gcggtgggcg 60

ggaggcgagc gggcgcaggc ggaacaccgt tttccaagct aagccgccgc aaataaaaag 120

gcgtaaaggg agagaagttg gtgctcaacg tgagccagga gcagcgtccc ggctcctccc 180

ctgctcattt taaaagcact tcttgtattg tttttaaggt gagaaatagg aaagaaaacg 240

ccggcttgtg cgctcgctgc ctgcctctct ggctgtctgc ttttgcaggg ctgctgggag 300

tttttaagct ctgtgagaat cctgggagtt ggtgatgtca gactagttgg gtcatttgaa 360

ggttagcagc ccgggtaggg ttcaccgaaa gttcactcgc atatattagg caattcaatc 420

tttcattctg tgtgacagaa gtagtaggaa gtgagctgtt cagaggcagg agggtctatt 480

ctttgccaaa ggggggacca gaattccccc atgcgagctg tttgaggact gggatgccga 540

gaacgcgagc gatccgagca gggtttgtct gggcaccgtc ggggtaggat ccggaacgca 600

ttcggaaggc tttttgcaag catttacttg gaaggagaac ttgggatctt tctgggaacc 660

ccccgccccg gctggattgg ccgagcaagc ctggaaaatg gtaaatgatc atttggatca 720

attacaggct tttagctggc ttgtctgtca taattcatga ttcggggctg ggaaaaagac 780

caacagccta cgtgccaaaa aaggggcaga gtttgatgga gttgggtg 828

<210> 10

<211> 684

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

atctccgcgt ggtgctttgc ggtcgccgtc gttgtggccg tccggggtgg ggtgtgagga 60

ggggacgaag gagggaagga agggcaaggc ggggggggct ctgcgagagc gcgcccagcc 120

ccgccttcgg gccccacagt ccctgcaccc aggtttccat tgcgcggctc tcctcagctc 180

cttcccgccg cccagtctgg atcctggggg aggcgctgaa gtcggggccc gccctgtggc 240

cccgcccggc ccgcgcttgc tagcgcccaa agccagcgaa gcacgggccc aaccgggcca 300

tgtcggggga gcctgagctc attgagctgc gggagctggc acccgctggg cgcgctggga 360

agggccgcac ccggctggag cgtgccaacg cgctgcgcat cgcgcggggc accgcgtgca 420

accccacacg gcagctggtc cctggccgtg gccaccgctt ccagcccgcg gggcccgcca 480

cgcacacgtg gtgcgacctc tgtggcgact tcatctgggg cgtcgtgcgc aaaggcctgc 540

agtgcgcgcg tgagtagtgg ccccgcgcgc ctacgagagc ggaaggggca gccaaggggc 600

agcgcagtcg ccgcgggtca agtcgcggca gagggggtcg gcggggacag ctcccgagga 660

ctaggtccgt tactttcgcc ccat 684

<210> 11

<211> 896

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

ggcgtcaggc tcgcaaagaa cagtttgggg tttaagaaat cggcctagcg attcgcgcca 60

gcgcgcccgg ccgcctgggt ctgcgactcg gactcaccca gcatcttgct caactcggcg 120

ttgtgcaggt ctggattctg ctgcgccagc cgcttgcgct cgtccttagc ccacaccatg 180

aaagcgttca tcggccgccg gatacgggac tcgcccttgg ctcggcccgc ggccccggcc 240

ggtgctccgc tgttcgccgg cgcctcgccc ttcaccttca tgtccccgat ggggctcagc 300

gactcggccc aggggcaggg gcccagcccg gccatcaccg cgggcagcgc gctctgggtc 360

tggctctggt cgtcactggc gtatcccgca tccgggctgc tcatggcgct ccaggcctgc 420

cccgctcccc tcaaccctcc gccggacgcg ccgcctcccc cgacccgggg gagggggtgg 480

ggagtgaggc actgagatgc cccgagggct gcgcgggtct cccggcccga agccgccgcc 540

cgtgttctgg cctgtcgcgg tctggtctac agcgtaccca gggcccccag ccggcctagt 600

gacactgcgg gcgcccctgg gccgcggggc cttttctgca cagatgtggc caatggagcg 660

gcgagggcgg gccggtcccg cgtcgttagg cccacgccca ggccgtggtc cgagtcccac 720

gtcccagtcc aaccccacgc ccgccccttg cccctccccc ggccccgcgc ccaaggctac 780

acctgccccc gggaaaacta gccggagctg ggctctggcg ccgcgtcctc tcccaccggg 840

gttagggaga ctcgaaaagc cgtctgggag ggctgattgt accttggaat cgacgt 896

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgcgagggt atattttcga gg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atccgcatcc aacgaattac ac 22

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttgaggggta tggggttagg gttagg 26

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acacaaaacc ccgcccaacc g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggcgtttttt attttcgtcg gg 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taccccattt ccgaatccga c 21

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gttttttatt tttgttggga gtttgttgat tg 32

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tacgcccaca cccaaccaat cg 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tacgttattc gggggtagat tgg 23

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgcgcttttc cgttaccac 19

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgttatttgg gggtagattg ggtgg 25

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aaaccaaacg tctctcgaaa ctctaaatta ac 32

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgtcggttg gttatgaggt tag 23

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgaattctaa cgattctcct acctc 25

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgttggttgg ttatgaggtt aggagtttt 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aaacgaaatt tcaccacgtt aatcaaact 29

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gcgtgggaga gtggattttc g 21

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcctcaacgc ttccctcgc 19

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tgtgggagag tggatttttg aagttgatag 30

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aaattccgcc cctacccccc g 21

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tacggtttat ttagttcgcg ttttat 26

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ccaacgccct aatatactaa ccaaact 27

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tttagtttgt gttttatttt gttttgttgg ttttt 35

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaacccgaac aaaaacgcga aaaac 25

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgcgttagag tacgtgttag ggtc 24

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cgaataaaaa attaaatccg actcc 25

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagtatgtgt tagggttgat tgtgttggt 29

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aaccgactac gataaaatcg ccgcc 25

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gttgtatcgg tgtggttacg tttagc 26

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tctaaaaact cttcgaacgc cgt 23

<210> 42

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

attggtgtgg ttatgtttag tgtagatatt ttgg 34

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tcgcccctac atctactaac aaaccgc 27

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gaagcgtttt ggtacgcgg 19

<210> 45

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

atacgccccc gcgacct 17

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tgttttggta tgtgggtgtg tgttgttt 28

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tacgaaattc aaaaaaccca aaaaaccg 28

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tttttcgttg gcgttgggt 19

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

acacctacga atcgtcgaac gac 23

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tgttggtgtt gggtttggtt ttggt 25

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcgcgtaaca acgccaaaaa acaaaat 27

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tcgaagagta ttttcgggag ttttg 25

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ttaacgcttt cgaaaaacca cc 22

<210> 54

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttttgggagt tttgttagtg ggtttttg 28

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tacgctcttt cttcattcgc acaatctaac 30

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tagcgtattt ggaagatgcg tgat 24

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

taaccgtcct acaacgcctc ataat 25

<210> 58

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gatgtgtgat tttgttgtgt gatagtttta gggt 34

<210> 59

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tacccccgac accttcaata acctaataaa ac 32

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ttggcggata ggggaagggt 20

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

acgcgaacgc tcctatatat taacc 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

tggatagggg aagggttggg tgtgt 25

<210> 63

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

tctactatac gcgatactcg aacttctacg cg 32

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tttcggttag ttgcgcgg 18

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ctaaaaaatc ccgcgaactc c 21

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

ttgtgtggtg attttgggga ttttag 26

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

accgcaaaaa aacgccctaa aatc 24

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

tcgttggagt ttcgtcgtcg t 21

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

aacccccgtc ccgaatct 18

<210> 70

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ggagttttgt tgttgtagtt tttgttatta gtgag 35

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

acgcgaaccg cgcgtactca ct 22

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ttcgtgtggg gagtgacgtg ac 22

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tcgtttctcg tcgcccctac t 21

<210> 74

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gtggggagtg atgtgatgtt agtagagatt ttatt 35

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

accgcccgcg cgccactata c 21

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

cggagtcggg agagcgaaag 20

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

taaaactacc gaattaacgc aaattact 28

<210> 78

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

ttgggagagt gaaaggagag gggatt 26

<210> 79

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

tcctcgatta actcctaaat accccgcc 28

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

tgaggagacg gtcgatagtt tgg 23

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

acgaacaacg acgactacga aaact 25

<210> 82

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gagatggttg atagtttggt ttttgttgtt tg 32

<210> 83

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

taaaaaaccc gcttcactta aaacaccg 28

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gagacggaaa gttagcgggt aaac 24

<210> 85

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

caaaacgcga tcgacgttaa ct 22

<210> 86

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

atggaaagtt agtgggtaaa tgaagatatg g 31

<210> 87

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

tactccctaa aaacgctcta aataataccc ttct 34

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gcgtatagag gaatttaaag tgtgg 25

<210> 89

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acgccttttt atttacgacg acttaac 27

<210> 90

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

ttatttacaa caacttaact taaaaaacaa tattccacc 39

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

tattccgcct acgcccgctc g 21

<210> 92

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

gaattttttt atgcgagttg tttgagg 27

<210> 93

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

ttccgaatac gttccgaatc ctacc 25

<210> 94

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

ttatgtgagt tgtttgagga ttgggatgtt gag 33

<210> 95

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

aacaaaccct actcgaatcg ctcgcg 26

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tgggaatttt tcgtttcggt t 21

<210> 97

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

acacgtaaac tattaatctt tttcccaac 29

<210> 98

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

cataaactat taatcttttt cccaacccca aatc 34

<210> 99

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

tcatttacca ttttccaaac ttactcgacc 30

<210> 100

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

aaggaagggt aaggcg 16

<210> 101

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

cgaacgaaac cacaaaac 18

<210> 102

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

gtgggggggg ttttgtgag 19

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

aaccccgact tcaacgcctc 20

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ttgttagcgt ttaaagttag c 21

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

taaaattaca cgcgataccc 20

<210> 106

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

agtgtttaaa gttagtgaag tatgggtt 28

<210> 107

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

acacgctcca accgaatacg acc 23

<210> 108

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

tcgtttttag ttcgcgg 17

<210> 109

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

ttaactaccc cttccgct 18

<210> 110

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

tagtttgtgg ggtttgttat gtatatgt 28

<210> 111

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

acaaaccttt acgcacgacg ccc 23

<210> 112

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

ttcggtcgtt tgggtttgc 19

<210> 113

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

caaaaacgaa tcccgtatcc g 21

<210> 114

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

ttgtttgggt ttgtgatttg gatttattta g 31

<210> 115

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

tccaaaccta cacaacgccg aattaaac 28

<210> 116

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

ttagttcggt tattatcgcg ggt 23

<210> 117

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

cgcgcaaccc tcgaaacat 19

<210> 118

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

tggttattat tgtgggtagt gtgttttggg t 31

<210> 119

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

tacgccaata acgaccaaaa ccaaacc 27

<210> 120

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

tcgcggtttg gtttatagcg t 21

<210> 121

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

taaaactcga accacgacct aaacg 25

<210> 122

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

tggtttggtt tatagtgtat ttagggtttt tagttg 36

<210> 123

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

cgcccgcaat atcactaaac cgact 25

<210> 124

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

gtgatggagg aggtttagta agt 23

<210> 125

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

ccaataaaac ctactcctcc ctt 23

<210> 126

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (10)

1.一种用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；

所述引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒，其特征在于：

所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的2种或2种以上；

优选地，所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的5种或5种以上；

优选地，所述乳腺癌状态为乳腺癌I期或II期，所述生物标志物基因为APC和/或RASSF1A；

优选地，所述乳腺癌状态为非浸润性癌，所述生物标志物基因为RARB和/或RASSF1A；

优选地，所述乳腺癌状态为浸润性导管癌，所述生物标志物基因为APC、CCND2和/或RASSF1A；

优选地，所述乳腺癌状态为浸润性小叶癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RASSF1A；

优选地，所述乳腺癌状态为其它浸润性癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RARB；

优选地，所述癌前病变状态为非典型性增生，所述生物标志物基因为BRCA1和/或RARB。

3.根据权利要求1所述的用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒，其特征在于：

所述引物对包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组、第十三引物组、第十四引物组、第十五引物组、第十六引物组、第十七引物组、第十八引物组、第十九引物组、第二十引物组、第二十一引物组、第二十二引物组、第二十三引物组、第二十四引物组、第二十五引物组、第二十六引物组、第二十七引物组和第二十八引物组中的一组或多组；每个引物组都包括上游引物、下游引物、封闭引物和探针；

其中，所述第一引物组包括序列表中序列12-15所示的DNA组成的引物；所述第二引物组包括序列表中序列16-19所示的DNA组成的引物；所述第三引物组包括序列表中序列20-23所示的DNA组成的引物；所述第四引物组包括序列表中序列24-27所示的DNA组成的引物；所述第五引物组包括序列表中序列28-31所示的DNA组成的引物；所述第六引物组包括序列表中序列32-35所示的DNA组成的引物；所述第七引物组包括序列表中序列36-39所示的DNA组成的引物；所述第八引物组包括序列表中序列40-43所示的DNA组成的引物；所述第九引物组包括序列表中序列44-47所示的DNA组成的引物；所述第十引物组包括序列表中序列48-51所示的DNA组成的引物；所述第十一引物组包括序列表中序列52-55所示的DNA组成的引物；所述第十二引物组包括序列表中序列56-59所示的DNA组成的引物；所述第十三引物组包括序列表中序列60-63所示的DNA组成的引物；所述第十四引物组包括序列表中序列64-67所示的DNA组成的引物；所述第十五引物组包括序列表中序列68-71所示的DNA组成的引物；所述第十六引物组包括序列表中序列72-75所示的DNA组成的引物；所述第十七引物组包括序列表中序列76-79所示的DNA组成的引物；所述第十八引物组包括序列表中序列80-83所示的DNA组成的引物；所述第十九引物组包括序列表中序列84-87所示的DNA组成的引物；所述第二十引物组包括序列表中序列88-91所示的DNA组成的引物；所述第二十一引物组包括序列表中序列92-95所示的DNA组成的引物；所述第二十二引物组包括序列表中序列96-99所示的DNA组成的引物；所述第二十三引物组包括序列表中序列100-103所示的DNA组成的引物；所述第二十四引物组包括序列表中序列104-107所示的DNA组成的引物；所述第二十五引物组包括序列表中序列108-111所示的DNA组成的引物；所述第二十六引物组包括序列表中序列112-115所示的DNA组成的引物；所述第二十七引物组包括序列表中序列116-119所示的DNA组成的引物；所述第二十八引物组包括序列表中序列120-123所示的DNA组成的引物。

4.根据权利要求1所述的用于鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括内参基因ACTB引物组，所述内参基因ACTB引物组用于以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

所述内参基因ACTB引物组包括序列表中序列124-126所示的DNA组成的引物；

优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂，所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠；

优选地，所述试剂盒还包括阐述所述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备鉴定乳腺癌状态或乳腺癌前病变产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述乳腺癌状态或乳腺癌前病变包括乳腺癌易感性，乳腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。

7.一种采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种基因及其片段的甲基化的方法，其特征在于，包括步骤：

S1：采集受试者的生物样品；

S2：采用所述试剂盒检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平；其中，所述生物标志物基因包括APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的一种或多种；

S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

还包括在所述受试者接受医疗处理后，重复步骤S1和S2，然后将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中乳腺癌状态或乳腺癌前病变的变化情况。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

S1中，所述生物样品选自受试者的血液、血清、血浆、乳腺导管液、淋巴、脑脊液、尿和组织活检中的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

S2中，包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平的步骤，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。