CN115896353A - 用于甲型流感病毒检测的核酸序列、产品、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列、产品、方法及应用，涉及生物检测技术领域。本发明实施例针对四种常见甲型流感病毒：H1N1、H3N2、H5N1、H7N9，各自的H基因及N基因特异序列设计了八套MCDA扩增引物，对针对H基因和N基因的扩增引物设计了不同的荧光标记物，且采用多交叉恒温扩增反应，从而可以仅在一个温度条件下，得到H基因和N基因的扩增产物，并利用横向测流生物传感条同时对待检测病毒样品的基因组H基因及N基因进行检测。采用本发明实施例提供的核酸序列进行甲流病毒的检测，具备快速的检测速度，且具有优秀的特异性，能够准确的鉴别4种甲型流感病毒亚型，适宜于推广至甲型流感病毒的临床检测。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列、产品、方法及应用。
背景技术
流感病毒分为甲、乙、丙、丁四型，甲型流感病毒还有各种亚型。其中，引起季节性流行性疾病的是甲型和乙型流感病毒，引起四次流感大流行的均是甲型流感病毒。目前正在人际间传播的甲型流感病毒是H1N1和H3N2亚型，还有部分散发病例是被禽流感病毒甲型H7N9及H5N1亚型感染所致。监测环境及流感散发病例的甲流病毒，明确其型别，可为及时发现病毒变异，应对流感流行提供基础数据。
相关技术中，通常在实验室利用病毒分离、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测流感特异性RNA或直接流感病毒表面抗原检测等方法确认流感病毒。分离鉴定流感病毒株是确认病毒型别的金标准，但因对实验室及操作人员要求极高，基层医院很少开展。在临床上可使用胶体金法快速流感诊断试验检测流感抗原，但与RT-PCR方法相比灵敏度较低。而以RT-PCR为基础的检测技术，虽然已经应用于流感病毒的检测和分型，但也因其依赖于特殊而昂贵的仪器设备及熟练的操作人员,在基层单位或条件落后的实验室难以推广，一定程度上限制了技术更为广泛的应用，也对流感的及时监测造成了一定困难。
由此可见，目前亟需一种新的用于甲型流感病毒检测的策略，以方便快捷地对甲型流感病毒进行检测。
发明内容
本发明实施例提供一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列、产品、方法及应用，以更加方便快捷地对甲型流感病毒进行检测。
本发明实施例第一方面提供了一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列，所述核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQ ID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ IDNo.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQID No.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQ ID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
可选的，SEQ ID No.2、SEQ ID No.22、SEQ ID No.42、SEQ ID No.62、所示引物序列的5’端连接有异硫氰酸荧光素；SEQ ID No.12、SEQ ID No.32、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.72、所示引物序列的5’端连接有地高辛；SEQ IDNo.3、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23、SEQID No.33、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.63、SEQ ID No.73所示引物序列的5’端连接有生物素。
本发明实施例第二方面提供了一种用于甲型流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQ ID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ IDNo.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQID No.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQ ID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
可选的，SEQ ID No.2、SEQ ID No.22、SEQ ID No.42、SEQ ID No.62、所示引物序列的5’端连接有异硫氰酸荧光素；SEQ ID No.12、SEQ ID No.32、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.72、所示引物序列的5’端连接有地高辛；SEQ IDNo.3、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23、SEQID No.33、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.63、SEQ ID No.73所示引物序列的5’端连接有生物素。
可选的，所述试剂盒中还包括：
甜菜碱、MgSO4，NTP，10×Bst DNA聚合酶缓冲液、链置换DNA聚合酶。
本发明实施例第三方面提供了一种用于甲型流感病毒检测的检测体系，所述检测体系包括：试剂盒、横向测流生物传感条；所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQ ID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ IDNo.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQID No.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQ ID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
可选的，所述横向测流生物传感条包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板，所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有：检测线1、检测线2及控制线，其中，在金标垫位置包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、在检测线1位置及检测线2位置分别包被有抗异硫氰酸荧光素抗体和抗地高辛抗体、在控制线位置包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
本发明实施例第四方面提供了一种用于甲型流感病毒检测的检测方法，所述方法包括：
提取待检测病毒样品的基因组；
基于核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.21至SEQ ID No.40所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.41至SEQ IDNo.60所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ IDNo.61至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列，使用待检测病毒样品基因组作为模板进行多交叉恒温扩增反应，得到扩增产物；
采用横向测流生物传感条对所述扩增产物进行检测。
可选的，所述多交叉恒温扩增反应的反应体系中引物浓度分别为：交叉引物CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度均为10pmol，扩增引物R1、R2、D1*和D2的浓度均为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度均为20pmol。
可选的，所述多交叉恒温扩增反应的反应体系中还包括10mM的甜菜碱，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的待检测白色念珠菌样品基因组模板，补去离子水至25μL。
本发明实施例针对四种常见甲型流感病毒：H1N1、H3N2、H5N1、H7N9，各自H基因及N基因特异序列设计了八套MCDA扩增引物，本发明实施例中，为了鉴定甲型流感的具体型别，可以同时检测H基因及N基因，由此，本发明实施例中，对针对H基因和N基因的扩增引物设计了不同的荧光标记物，且采用多交叉恒温扩增反应，从而可以仅在一个温度条件下，得到H基因和N基因的扩增产物，并利用横向测流生物传感条同时对待检测病毒样品的基因组H基因及N基因进行检测。
采用本发明实施例提供的核酸序列进行甲流病毒的检测，具备快速的检测速度，不需要变温设备，节约实验室购置PCR扩增仪的成本，且具有优秀的特异性，能够准确的鉴别4种甲型流感病毒亚型。该检测方案便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至甲型流感病毒的临床检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1对应的检测结果图；
图2是本发明实施例2对应的检测结果图；
图3是本发明实施例3中H1N1-MCDA-LFB对应的检测结果图；
图4是本发明实施例3中H3N2-MCDA-LFB对应的检测结果图；
图5是本发明实施例3中H5N1-MCDA-LFB对应的检测结果图；
图6是本发明实施例3中H7N9-MCDA-LFB对应的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
多交叉置换扩增(multi-cross displacement amplification，MCDA)技术是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增技术。该技术摆脱了PCR需要使用昂贵变温设备的问题，与PCR技术相比，具有恒温、高效、特异、不需要特殊仪器的优点。MCDA基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。目前，该技术已经成功用于多种细菌、真菌及病毒等病原体的检测。
基于MCDA技术，发明人针对目前常见的四种甲型流感病毒型别，开发了MCDA技术快速检测甲型流感病毒并对其分型的方案。
具体的，本发明实施例提供了一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列，所述核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQ ID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ IDNo.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQID No.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQ ID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
本发明实施例中，针对四种常见甲型流感病毒—H1N1，H3N2，H5N1，H7N9，各自H基因及N基因特异序列设计了八套MCDA扩增引物，本发明实施例中，为了鉴定甲型流感的具体型别，可以同时检测H基因及N基因，由此，本发明实施例针对H基因和N基因设计了不同的荧光标记物，以便同时对甲型流感病毒的H基因和N基因进行检测。
本发明实施例中，可以标记的引物有CP1，CP2，D1，C1，R1，D2，C2和R2的5’端。以标记D1和C1为例：对于H基因，在引物D1的5’端标记半抗原异硫氰酸荧光素(FITC)，在引物C1的5’端标记生物素(Biotin)；对于N基因，在引物D1的5’端标记半抗原地高辛(Dig)，在引物C1的5’端仍标记生物素(Biotin)。标记的引物均加星号以示区别。本发明实施例中，具体的引物序列及修饰，如下表1-表8所示：
表1：
表2：
| 序列编号 | N1引物 | 序列(5'-3')280bp | 修饰 |
| SEQ ID No.11 | F1 | CAGGGATAACTGGCATGGCT | |
| SEQ ID No.12 | D1* | ATCCCACTGCATATGTATCCTATC | 5’-Dig |
| SEQ ID No.13 | C1* | TTAGGGCGTGGATTGTCTCC | 5’-Biotin |
| SEQ ID No.14 | R1 | GGACCACAACTGCCTGTCTT | |
| SEQ ID No.15 | R2 | GGAGCAAATGGAGTAAAAGGGTT | |
| SEQ ID No.16 | C2 | ACGGCAATGGTGTTTGGATAG | |
| SEQ ID No.17 | D2 | ACGGTTTTGAGATGATTTGGGA | |
| SEQ ID No.18 | F2 | TCCCGCTATATCCTGACCAC | |
| SEQ ID No.19 | CP1 | TTAGGGCGTGGATTGTCTCC-GAATCGACCGTGGGTGTCTT | |
| SEQ ID No.20 | CP2 | ACGGCAATGGTGTTTGGATAG-TGTCCCAGTCCATCCGTTCG |
表3：
表4：
| 序列编号 | N2引物 | 序列(5'-3')280bp | 修饰 |
| SEQ ID No.31 | F1 | CATCTGGGGACCAAGCAAGT | |
| SEQ ID No.32 | D1* | TGCAGCCATGCTTTTCCAT | 5’-Dig |
| SEQ ID No.33 | C1* | TGCATTTTTATCATCCCCCGTT | 5’-Biotin |
| SEQ ID No.34 | R1 | CTATCTACAAGCCTCCCATTGT | |
| SEQ ID No.35 | R2 | TTCATGGTCCAAAGAAATCCTCA | |
| SEQ ID No.36 | C2 | CCCAGGAGTCAGAATGCGT | |
| SEQ ID No.37 | D2 | GTAATGACTGATGGGAGTGCTT | |
| SEQ ID No.38 | F2 | CACTTCCTGACAATGTGCTAGT | |
| SEQ ID No.39 | CP1 | TGCATTTTTATCATCCCCCGTT-ATGGTCCAGCTCAAGTTGTCA | |
| SEQ ID No.40 | CP2 | CCCAGGAGTCAGAATGCGT-AACGATTTTCCCCTCCTCAATG |
表5：
表6：
| 序列编号 | N1引物 | 序列(5'-3')280bp | 修饰 |
| SEQ ID No.51 | F1 | TCAACACCAAACTGAACCAATC | |
| SEQ ID No.52 | D1* | GCAAAGAGATGAATTGCCAGAT | 5’-Dig |
| SEQ ID No.53 | C1* | TGTGTACAGCCCATCCTCTA | 5’-Biotin |
| SEQ ID No.54 | R1 | ATCCCCTTTGGACCCAATCC | |
| SEQ ID No.55 | R2 | AGAGAGCCGTTCATCTCATGCT | |
| SEQ ID No.56 | C2 | ACTTTCTTTTTGACTCAGGGAGC | |
| SEQ ID No.57 | D2 | GAATGACAAGCACTCCAACGG | |
| SEQ ID No.58 | F2 | GTTGTATGGGGAGGGAGCCT | |
| SEQ ID No.59 | CP1 | TGTGTACAGCCCATCCTCTA-CTGAGAACGCTGTGGCTTCA | |
| SEQ ID No.60 | CP2 | ACTTTCTTTTTGACTCAGGGAGC-TGAGGGCTCCTGTCTTTGAC |
表7：
表8：
| 序列编号 | N9引物 | 序列(5'-3')280bp | 修饰 |
| SEQ ID No.71 | F1 | CGACCCAGATGAATGCAGGT | |
| SEQ ID No.72 | D1* | CCGTTTGAGTGTTTCCCTCTG | 5’-Dig |
| SEQ ID No.73 | C1* | GCGCGATACTGGGACCTATC | 5’-Biotin |
| SEQ ID No.74 | R1 | TGTGGGCGGTGATGATAGTG | |
| SEQ ID No.75 | R2 | GTGTACAACAGCAGGGTGGA | |
| SEQ ID No.76 | C2 | CATTGGGTGGTCAAGTACT | |
| SEQ ID No.77 | D2 | GATGGCAAATCCAGGATGTCA | |
| SEQ ID No.78 | F2 | CAACAGGCCTTCTGTTGTACC | |
| SEQ ID No.79 | CP1 | GCGCGATACTGGGACCTATC-GCTCTCAGCCAAGGAACAAC | |
| SEQ ID No.80 | CP2 | CATTGGGTGGTCAAGCACT-TGCATTGTTGTTTGGTCCTG |
其中，SEQ ID No.2、SEQ ID No.22、SEQ ID No.42、SEQ ID No.62、所示引物序列的5’端连接有异硫氰酸荧光素；SEQ ID No.12、SEQ ID No.32、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.72、所示引物序列的5’端连接有地高辛；SEQ ID No.3、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23、SEQ ID No.33、SEQ ID No.43、SEQ ID No.53、SEQ ID No.63、SEQ ID No.73所示引物序列的5’端连接有生物素。
本发明实施例中，MCDA反应体系含有10条引物，识别靶序列的10个区域，包括：2条交叉内引物：CP1和CP2(Cross Primer，CP)，CP1包含Cls(C1区域的互补序列)和P1，即5′-Cls-P1，CP2包含C2s(C2区域的互补序列)和P2，即5′-C2s-P2，两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；2条置换引物：F1和F2，在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；6条扩增引物：D1，C1，R1，D2，C2和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量。
本发明实施例中，还提供了一种用于甲型流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒中包含有上述核酸扩增试剂。
具体的，本发明实施例中，所述试剂盒中还包括：
甜菜碱、MgSO4，NTP，10×Bst DNA聚合酶缓冲液、链置换DNA聚合酶。
本发明实施例中，还提供了一种用于甲型流感病毒检测的检测体系，所述检测体系包括：上述试剂盒、横向测流生物传感条。
所述横向测流生物传感条包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板，所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有：检测线1、检测线2及控制线，其中，在金标垫位置包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、在检测线1位置及检测线2位置分别包被有抗异硫氰酸荧光素抗体和抗地高辛抗体、在控制线位置包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
本发明实施例中，横向测流生物传感条具体为：双通道生物检测器(LFB)，具体的，LFB包含五个部分，样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板。首先将样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)包被在金标垫位置，anti-FITC(抗异硫氰酸荧光素抗体)和anti-DIG(抗地高辛抗体)分别包被在检测线1及检测线2位置，B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)包被在控制线(CL)位置，待干燥后包装上塑料外壳即可使用。
基于上述用于甲型流感病毒检测的检测体系，本发明实施例还提供了一种用于甲型流感病毒检测的非诊断目的检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1，提取待检测病毒样品的基因组；
S2，基于核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.21至SEQ ID No.40所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ IDNo.61至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列，使用待检测病毒样品基因组作为模板进行多交叉恒温扩增反应，得到扩增产物；
S3，采用横向测流生物传感条对所述扩增产物进行检测。
其中，所述多交叉恒温扩增反应的反应体系中引物浓度分别为：交叉引物CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度均为10pmol，扩增引物R1、R2、D1*和D2的浓度均为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度均为20pmol。
具体的，所述多交叉恒温扩增反应的反应体系中还包括：10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板(待检测病毒样品的基因组)，补加去离子水至25μ。所述多交叉恒温扩增反应的反应条件为：恒温在65℃下反应30min即可得到扩增产物。
本发明实施例中，经过实验探索，确定同时对H基因和N基因进行多交叉恒温扩增反应的最佳反应温度为65℃，并且，本发明实施例中，多交叉恒温扩增反应在65℃恒温反应，无需进行变温，在一个温度条件下，即可得到H基因和N基因的扩增产物。
本发明实施例中，可以分别利用4组多交叉置换扩增反应引物序列(核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQID No.21至SEQ ID No.40所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ IDNo.41至SEQ ID No.60所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ IDNo.61至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列)，使用待检测病毒样品基因组作为模板进行多交叉恒温扩增反应，分别得到4组扩增产物。
再采用横向测流生物传感分别对4组扩增产物进行检测，从而实现四种甲型流感病毒的检测和分型鉴定。
具体的，所述步骤S3包括：将MCDA产物10μL直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将100μL的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即异硫氰酸荧光素标记端或地高辛标记端)与检测线1区域或检测线2区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线上。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应。如果MCDA产物中包括携带两种标记的产物，那么检测线1及检测线2均可显色，从而实现MCDA产物的双通道可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与CL(质控线)区域的B-BSA(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。
本发明实施例中，还提供了上述核酸序列在甲型流感病毒检测中的非诊断目的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所涉及的脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒，一次性横向测流生物传感条(#2)及特异性核酸扩增检测试剂购于天津汇德鑫科技发展有限公司。核酸提取试剂盒购于德国Qiagen公司。DL1000DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
本发明实施例中使用的主要仪器：PCR仪为QuantStudio 3，美国thermo公司产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。恒温扩增使用PCR仪实现。
本发明实施例中所用菌株来自于首钢医院检验科临床分离培养鉴定后的保存菌株，或者购自美国模式培养物保藏所的传代菌株，所用病毒株来自于市售质控产品。
实施例1：MCDA-LFB检测甲型流感病毒四种亚型的可行性验证：
分别将4种病毒的目的基因经MCDA扩增之后，用双通道生物传感器(LFB)检测，检测结果如图1所示，其中，I，II，III，VI分别代表：仅H基因扩增产物，仅N基因扩增产物，H基因及N基因混合扩增产物，阴性空白对照产物。从图1可见，不管采用哪种甲型流感病毒基因组作为模板，相应的MCDA引物均能扩增出目的片段，并且对于H基因及N基因均阳性的扩增产物，双通道的LFB均能检测到(如图1中第III块LFB所示)。
实施例2：MCDA-LFB检测甲型流感病毒四种亚型的灵敏度验证：
将连续稀释好的甲型流感病毒基因组进行标准的MCDA扩增反应，采用两种检测方法用于甲型流感病毒四种亚型MCDA扩增结果判别，判别结果如图2所示。
首先，采用可视染料法检测MCDA扩增结果。在反应混合物中加入特异性核酸扩增检测试剂，如反应液从无色变为蓝色为阳性反应，仍保持原来的无色则为阴性反应。检测显示：甲型流感病毒四种亚型H1N1，H3N2，H5N1，H7N9的检测下限分别依次为1fg，1fg，10fg，1pg，阳性扩增管变为蓝色。当反应体系中各甲型流感病毒基因组含量低于上述检测下限时，或加入的模板为双蒸水(DW)时，反应液不出现颜色变化，仍然为无色，表示阴性结果。
其二，运用双通道LFB检测MCDA产物。结果显示：甲型流感病毒四种亚型H1N1，H3N2，H5N1，H7N9的检测下限分别依次为1fg，1fg，10fg，1pg，LFB在TL1、TL2及CL区域均出现红色线。当反应体系中各甲型流感病毒基因组含量低于上述检测下限时，或加入的模板为双蒸水(DW)时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果。
实施例3：MCDA-LFB检测甲型流感病毒四种亚型的特异度验证：
以常见的病毒、支原体、衣原体以及细菌为模板评价MCDA-LFB检测甲型流感病毒四种亚型的特异性(菌株信息详见表9)。检测结果如图3-6所示，其中，图3、4、5、6分别为H1N1-MCDA-LFB、H3N2-MCDA-LFB、H5N1-MCDA-LFB和H7N9-MCDA-LFB技术分别检测甲型流感病毒四种亚型的特异性结果。
其中，H1N1-MCDA-LFB技术指的是利用检测甲型流感病毒H1N1的多交叉置换扩增反应引物序列进行多交叉置换扩增反应，并利用横向测流生物传感条检测扩增反应产物。H3N2-MCDA-LFB技术指的是利用检测甲型流感病毒H3N2的多交叉置换扩增反应引物序列进行多交叉置换扩增反应，并利用横向测流生物传感条检测扩增反应产物。H5N1-MCDA-LFB技术指的是利用检测甲型流感病毒H5N1的多交叉置换扩增反应引物序列进行多交叉置换扩增反应，并利用横向测流生物传感条检测扩增反应产物。H7N9-MCDA-LFB技术指的是利用检测甲型流感病毒H7N9的多交叉置换扩增反应引物序列进行多交叉置换扩增反应，并利用横向测流生物传感条检测扩增反应产物。
在图3-6中，1-4为甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1和H7N9四种亚型模板，5-39为非甲型流感病毒模板(其中乙型流感病毒、人副流感3型病毒、呼吸道合胞病毒A/B模板为RNA基因逆转录产物)，40为加入同等体积的蒸馏水作为阴性对照。由结果可以看出，MCDA-LFB技术在检测甲型流感病毒四种亚型方面具有高度特异性。
表9、菌株信息及MCDA-LFB检测方法的特异性结果：
以上对本发明所提供的一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列、产品、方法及应用，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种用于甲型流感病毒检测的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有SEQ IDNo.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ ID No.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQ IDNo.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，SEQ ID No.2、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.62、所示引物序列的5’端连接有异硫氰酸荧光素；SEQ ID No.12、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.52、SEQ ID No.72、所示引物序列的5’端连接有地高辛；SEQ ID No.3、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.33、SEQ ID No.43、SEQ ID No.53、SEQ ID No.63、SEQ ID No.73所示引物序列的5’端连接有生物素。
3.一种用于甲型流感病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ ID No.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQ IDNo.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID No.2、SEQ IDNo.22、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.62、所示引物序列的5’端连接有异硫氰酸荧光素；SEQ ID No.12、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.52、SEQ ID No.72、所示引物序列的5’端连接有地高辛；SEQ ID No.3、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.33、SEQ ID No.43、SEQ ID No.53、SEQ ID No.63、SEQ ID No.73所示引物序列的5’端连接有生物素。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
甜菜碱、MgSO4，NTP，10×Bst DNA聚合酶缓冲液、链置换DNA聚合酶。
6.一种用于甲型流感病毒检测的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：试剂盒、横向测流生物传感条；所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ IDNo.1至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.20用于检测甲型流感病毒H1N1，SEQ ID No.21至SEQID No.40用于检测甲型流感病毒H3N2，SEQ ID No.41至SEQ ID No.60用于检测甲型流感病毒H5N1，SEQ ID No.61至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒H7N9；
其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10、SEQ ID No.21至SEQ ID No.30、SEQ ID No.41至SEQ ID No.50、SEQ ID No.61至SEQ ID No.70用于检测甲型流感病毒的H基因；SEQ IDNo.11至SEQ ID No.20、SEQ ID No.31至SEQ ID No.40、SEQ ID No.51至SEQ ID No.60、SEQID No.71至SEQ ID No.80用于检测甲型流感病毒的N基因。
7.根据权利要求6所述的检测体系，其特征在于，所述横向测流生物传感条包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板，所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有：检测线1、检测线2及控制线，其中，在金标垫位置包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、在检测线1位置及检测线2位置分别包被有抗异硫氰酸荧光素抗体和抗地高辛抗体、在控制线位置包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
8.一种用于甲型流感病毒检测的非诊断目的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提取待检测病毒样品的基因组；
基于核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.21至SEQ ID No.40所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ ID No.41至SEQ IDNo.60所示的多交叉置换扩增反应引物序列、或者核酸序列具有SEQ IDNo.61至SEQ ID No.80所示的多交叉置换扩增反应引物序列，使用待检测病毒样品基因组作为模板进行多交叉恒温扩增反应，得到扩增产物；
采用横向测流生物传感条对所述扩增产物进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多交叉恒温扩增反应的反应体系中引物浓度分别为：交叉引物CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度均为10pmol，扩增引物R1、R2、D1*和D2的浓度均为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度均为20pmol。
10.根据权利要求1所述的核酸序列在甲型流感病毒检测中的非诊断目的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN114540548A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-27 | 贵州安康医学检验中心有限公司 | 一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器 |
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