CN107164541A - Audg介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术 - Google Patents

Audg介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记半抗原，在扩增系统中引入南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶和生物素化的脱氧尿嘧啶，以多交叉置换扩增技术为基础，结合高分子纳米生物传感检测扩增产物。所述方法针对HPV16型的E7基因或者HPV18型的L1基因的扩增产物能被高分子纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

AUDG介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术
技术领域
本发明公开了一种AUDG介导的多交叉置换扩增结合生物传感检测微生物目的基因的方法，属于微生物和分子生物学技术领域。
背景技术
在现代医学和生物学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，广泛运用于基础研究、临床诊断、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，PCR是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，现已被广泛运用于生物相关领域。然而，PCR进行核酸扩增时，受实验室的条件限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。此外，PCR产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展简单、快速、敏感的核酸扩增方法。
为了克服PCR扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。较PCR技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。
为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。
类似于环介导恒温扩增(LAMP)和交叉扩增(CPA)，MCDA的技术瓶颈在结果的判读，即扩增产物的检测。到目前为止，最常见的检测手段主要包括颜色指示剂、电泳、实时浊度。这三种产物检测技术仅仅适用于单一基因靶标检测，颜色指示剂判读时会出现模拟两可的结果，电泳判读结果时耗时较长，容易出现交叉污染，不适合于现场检测，实时浊度判读时需要特殊的仪器设备。为了克服这三种产物检测技术的劣势，使MCDA技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，发明人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple CrossDisplacement Amplification label-based gold Nanoparticles Lateral FlowBiosensor,MCDA-LFB)，相关内容公开于CN201610872509.4；CN201610942289.8；CN201610982015.1；该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。
为了将扩增产物适用于生物传感技术，传统的策略是在扩增体系中同时添加两条标记的引物，一条引物在5’端标记半抗原，另一条引物在5’端标记生物素。当扩增完毕，双标的扩增产物被构建(该双标的产物起源于两条标记的引物)，一端标记半抗原，另一端标记生物素。然而，传统策略构建双标记的产物容易导致假阳性结果，甚至不需要扩增就能导致假阳性结果。该假阳性结果来源于标记引物之间的杂交。因此，为了克服传统标记策略的劣势，本发明设计了一种新的检测策略，该技术只需一条标记的引物就能构建双标的扩增产物，从而将扩增产物适用于生物传感技术。此外，为了将扩增产物适用于生物传感技术的检测，打开反应管是一个必须的步骤，该步骤会导致大量的扩增产物以气溶胶的形式挥发，从而导致交叉污染。为了克服交叉污染和传统策略导致的假阳性结果，在本发明中，发明人旨在利用单标记的引物和南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)，以MCDA技术为基础，开发南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶介导的多交置换扩增结合高分子纳米生物传感的核酸检测技术(Antarctic thermal sensitive uracil-DNA-glycosylase-supplementedmultiple cross displacement amplification label-based nanoparticles lateralflow biosensor for simultaneous elimination of carryover contamination anddetection of nucleic acid sequence,AUDG-MCDA-LFB)。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种AUDG介导的多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法(AUDG-MCDA-LFB)，为了验证AUDG-MCDA-LFB技术的可行性，两个高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)HPV 16的E7基因和HPV 18的L1基因被应用于AUDG-MCDA-LFB技术，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供针对HPV 16的E7基因的第一套引物：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:6所示；同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ IDNO:8所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示，和/或
提供针对HPV 18的L1基因的第二套引物：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:13所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:14所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:15所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:18所示；同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO:19所示，引物C2的序列如SEQID NO:20所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:21所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:22所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:23所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:24所示；
(4)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、常规的dNTP，以及生物素化的脱氧尿嘧啶存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(5)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。
在一个优选的技术方案中，两套引物中的所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记的半抗原彼此不同；当在一条所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记荧光素时，则在另一条所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记地高辛。
在一个更为优选的技术方案中，所述高分子纳米生物传感器包括一背板1，在所述背板1上依次设置装有样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4及吸水垫5，在所述硝酸纤维素膜4上依次设置检测线41、检测线42及控制线43，在金标垫3、检测线41、检测线42及控制线43区域依次包被有色基团修饰的亲和素化的高分子纳米粒子6、抗荧光素抗体7、抗地高辛抗体8及生物素偶联的牛血清蛋白9。
在另一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。
在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在63℃的环境中进行的。
优选地，所述目的基因为HPV16型的E7基因或者HPV18型的L1基因。
在一个优选的技术方案中，在所述第一套引物中的交叉引物CP1的5’端标记有荧光素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:5所示，或者在所述第二套引物中的交叉引物CP1的5’端标记有地高辛的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:17所示。
本发明还提供了一组用于恒温扩增HPV16型的E7基因的引物序列，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:6所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:7所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时还提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*。
本发明还提供了一组用于恒温扩增HPV18型的L1基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:13所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:14所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:15所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:18所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:19所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:20所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:21所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:22所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:23所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:24所示的扩增引物R2，同时还提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*。
在一个优选的技术方案中，在交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记的半抗原为荧光素或者地高辛。
本发明所提供的方法针对HPV16型的E7基因或者HPV18型的L1基因的扩增产物能被高分子纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。本发明整个反应扩增时间仅为40分钟，而且针对HPV16和HPV18，无论是单一检测还是多重检测下限都为5×100拷贝/微升，具有极高的灵敏度。在本发明中，无论是针对单一还是多重MCDA产生的污染子，AUDG的降解能达1×10-15克/微升。因此本发明中的AUDG-MCDA方法能够有效的消除污染子。以常见的HPV型别(6，11，31，33，35，39，45，51，52，56，66，73，81，82，83)的基因组核酸为模板评价AUDG-MCDA-LFB技术的特异性。AUDG-MCDA-LFB技术能准确的HPV16和HPV18，说明AUDG-MCDA-LFB方法的特异性良好。
附图说明
图1.MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；
图2.高分子纳米生物传感器结构及工作示意图；
图3.AUDG-MCDA-LFB扩增原理示意图；
图4.AUDG-MCDA-LFB消除污染子原理示意图；
图5.MCDA-LFB检测结果示意图谱；
图6.AUDG-MCDA引物验证结果图谱；
图7.E7基因标准AUDG-MCDA最佳反应温度测试结果图谱；
图8.L1基因标准AUDG-MCDA最佳反应温度测试结果图谱；
图9.AUDG-MCDA检测HPV16和HPV18的灵敏度结果图谱；
图10.ET-MCDA检测HPV16和HPV18的灵敏度结果图谱；
图11.多重AUDG-MCDA-LFB同时检测HPV16和HPV18的灵敏度结果图谱；
图12.AUDG消除单一MCDA交叉污染的评价；
图13.AUDG消除多重MCDA交叉污染的评价；
图14.AUDG-MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试结果图谱；
图15.AUDG-MCDA-LFB技术的特异性检测评价图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明中所涉及的材料方法
1.试剂：
背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。抗荧光素抗体(anti-FITC)、抗地高辛抗体(anti-Dig)、生物素化的牛血清蛋白(B-BSA)购于Abcam公司。有色基团(紫红色)修饰的、亲和素化的高分子纳米粒子(Dye streptavidin coated polymernanoparticles,SA-DNPs,129nm)购买于Bangs Laboratories。DNA提取试剂盒(QIAamp DNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。恒温扩增试剂和显色剂(Hydroxynaphthol,HNB)购买自北京海泰正元生物科技有限公司。生物素化的脱氧尿嘧啶(Biotin-11-dUTP)购买自Thermo Scientific公司。南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG),脱氧胞嘧啶(dCTP)，脱氧胸腺嘧啶(dTTP)，脱氧腺嘌呤(dATP)和脱氧鸟嘌呤(dGTP)购买自New England Biolabs公司。DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR，美国Bio-Rad产品。
2.引物设计
为了验证、评价AUDG-MCDA-LFB技术及建立针对HPV16和HPV18病原体的快速、敏感和特异的AUDG-MCDA-LFB检测体系。本发明针对HPV16的特异基因E7和HPV的特异基因L1分别设计两套MCDA扩增引物，旨在验证AUDG-MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。
E7基因存在于HPV16型中，其特异性好，可以将HPV16型与其他密切相近的HPV型别区分开。L1基因存在于所有的HPV18型中，其特异性好，可以将HPV18型与其他密切相近的HPV型别区分开。利用引物设计软件PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的两套完整MCDA扩增引物，一套引物针对HPV16型检测，另一套引物针对HPV18型检测。引物设计的位置和方向见图1，序列及修饰见表1。
表1引物序列及修饰
a16，HPV 16；18，HPV18；
16-E-CP1，该引物用于多重ET-MCDA检测体系，根据ET-MCDA检测体系的结果，用于调配多重AUDG-MCDA-LFB检测体系中的引物浓度。
16-CP1*，该引物用于AUDG-MCDA-LFB检测体系，在5’端标记荧光素(FITC)；
18-E-CP1，该引物用于多重ET-MCDA检测体系，根据ET-MCDA检测体系的结果，用于调配多重AUDG-MCDA-LFB检测体系中的引物浓度。
18-CP1*，该引物用于AUDG-MCDA-LFB检测体系，在5’端标记地高辛(Dig)。
bSEQ ID.NO.5与SEQ ID.NO.3和SEQ ID.NO.4(该引物在5'端多了一个酶切位点序列TGCAATG)的核苷酸序列相同，区别在于在其5’端标记荧光素；SEQ ID.NO.17与SEQID.NO.15和SEQ ID.NO.16(该引物在5'端多了一个酶切位点序列TGCAATG)的核苷酸序列相同，区别在于在其5’端标记地高辛；
cmer，monomeric unit(单体单元)；nt，nucleotide(核苷酸)。
3.生物传感检测器(LFB)的设计
生物检测器(LFB)的设计见图2。LFB含有一背板1，在所述背板1上设置有样品垫2、金标垫3、硝酸纤维膜4及吸水垫5。首先将样品垫2、金标垫3、纤维膜4及吸水垫5依次组装在背板上。然后将有色基团(紫红色)修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子(SA-DNPs)6包被在金标垫3上，将抗荧光素抗体7、抗地高辛抗体8及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)9分别包被在硝酸纤维膜4上，分别作为检测线41(即TL1)、检测线42(即TL2)及控制线43(即CL)，待干燥后备用。
LFB的检测原理(图2)：将MCDA产物滴加到LFB的样品垫区域，然后将缓冲液滴加到LFB的样品垫区域。MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与亲和素化的高分子纳米粒子(SA-DNPs)6反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即半抗原标记端)与检测线41或检测线42区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线41(生物素和荧光素同时标记的MCDA扩增子71的靶标一)或检测线42(生物素和地高辛同时标记的MCDA扩增子81的靶标二)区域。随着产物在检测线41或检测线42区域的积累，通过另一端的亲和素化的高分子纳米粒子(SA-DNPs)6进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的亲和素化的高分子纳米粒子(SA-DNPs)6可与控制线43区域的B-BSA反应，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。
LFB结果的判读(图5)：仅控制线43区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(IV)；控制线43及检测线41区域出现红色条带，表示针对靶标一的检测为阳性结果(II)；控制线43及检测线42区域出现红色条带，表示针对靶标二的检测为阳性结果(III)；控制线43、检测线41和检测线42区域出现红色条带，表示生物素和荧光素同时标记的MCDA扩增子71(靶标一)和生物素和地高辛同时标记的MCDA扩增子81(靶标二)的检测都为阳性结果；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；当检测线41和/或检测线42出现红色条带时，控制线43无红色条带,代表结果不可信，需要重新检测。
实施例1.MCDA扩增
1.通过MCDA扩增构建可检测产物
MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物(Displacement Primer)，即F1和F2，6条扩增引物(Amplification primer)，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，选择10条引物中任意一条引物，在5’端标记半抗原(荧光素或者地高辛)，新标记的引物被命名为F1*，F2*，CP1*，CP2*，C1*，C2*，D1*，D2*，R1*和R2*。在本发明中，以CP1*为例子阐明本发明的原理。
在既定的恒温条件下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1*引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成(图3)。在DNA的合成过程中，生物素化的脱氧尿嘧啶(Biotin-11-dUTP)被Bst酶整合到扩增子。随着MCDA扩增的进行，形成大量的双标产物(一端标记半抗原，产物中标记生物素)，双标产物起源于标记的CP1*引物和掺入到扩增子中生物素化的脱氧尿嘧啶(Biotin-11-dUTP)。该双标的产物能被高分子纳米生物传感器检测，从而进行可视检测。当针对不同靶标设计的CP1*引物进行不同半抗原标记时，可实现多重检测。详细的MCDA扩增原理见申请人的中国发明专利CN104946744A。
标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP1*的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol,扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，2M的Betain，8mM的MgSO4，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1.4mM的dATP，1.0mM的dTTP，0.4mM的biotin-11-dUTP,1.4mM的dCTP，1.0mM的dGTP，10U的链置换DNA聚合酶，0.5U的南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时，80℃5min终止反应。
2.南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)去除交叉污染
在反应体系中(图4)，由于加入了生物素化的脱氧尿嘧啶(Biotin-11-dUTP)，随着MCDA扩增的进行，所有的扩增产物都被掺入脱氧尿嘧啶(dUTP)。当扩增产物(掺入脱氧尿嘧啶的扩增子)进入扩增体系时，AUDG在常温条件下(如室温)移除单链或双链中脱氧尿嘧啶，从而使单链或双链DNA出现缺口。由于天然的模板不包含脱氧尿嘧啶，因此AUDG对天然的DNA无催化作用。当进行MCDA扩增时，温度较高(大于60℃)，带有缺口的单链或双链DNA在热力作用下降解，因此不能作为模板进行扩增，从而消除了反应体系的污染产物，达到去除交叉污染的目的。此外，AUDG在温度大于50℃时，会立即失活，从而不能降解新合成的扩增产物，即使扩增产物中包含脱氧尿嘧啶。因此本发明中选择的AUDG既能用于消除交叉污染，又不影响MCDA的正常扩增。
3.验证两套MCDA引物的可行性
MCDA扩增之后，三种检测方法被用于MCDA扩增产物判别。首先，在反应混合物中加入可视染料(如HNB试剂)，阳性反应管的颜色从紫色变为天蓝色，阴性反应管则保持原来的紫色。其次，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过LFB对产物进行检测。
可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够与反应体系中的镁离子结合，形成不可溶的物质，从而改变溶液的pH值，使反应混合的颜色发生改变。可以通过可视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从紫色变为天蓝色，阴性反应保持紫色不变，见图6的A和B。A表示针对HPV16的MCDA引物的验证，A1表示阳性扩增(反应管中加入5×104拷贝的pMD18-T-HPV16质粒模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入5×104拷贝的pMD18-T-HPV18质粒模板，作为阴性对照，测定是否存在交叉反应)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的HPV6模板，作用阴性对照)，A4表示阴性扩增(反应管中加入10pg的HPV11模板，作为阴性对照)，A5表示阴性扩增(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对HPV16E7基因设计的检测HPV16的MCDA引物可用。
图6的B表示针对HPV18的MCDA引物的验证，B1表示阳性扩增(反应管中加入5×104拷贝的pMD18-T-HPV18质粒模板，作为阳性对照)，B2表示阴性扩增(反应管中加入5×104拷贝的pMD18-T-HPV16质粒模板，作为阴性对照，测定是否存在交叉反应)，B3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的HPV6模板，作用阴性对照)，B4表示阴性扩增(反应管中加入10pg的HPV11模板，作为阴性对照)，B5表示阴性扩增(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对L1基因设计的检测HPV18的MCDA引物可用。
电泳检测法：将图6的A和B的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图6的C和D。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，能够用于靶序列扩增检测。
LFB检测：将图6的A和B的产物进行LFB检测，由于针对HPV16检测的MCDA引物标记的半抗原为荧光素(FITC)，因此，当检测线TL1和控制线CL出现红色条带时表示为HPV16检测阳性。由于HPV18检测的MCDA引物标记的半抗原为Dig，因此，当检测线TL2和CL出现红色条带时表示为HPV18检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图6的E和F)。
实施例2.测定MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入针对HPV16及HPV18DNA模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为5×104拷贝/微升。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图7和图8。61-64℃被推荐作为两套MCDA引物的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择63℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图7表示针对E7基因设计的检测HPV16的MCDA引物温度动态曲线图；图8表示针对L1基因设计的检测HPV18的MCDA引物温度动态曲线图。
实施例3.AUDG-MCDA-LFB检测单一靶标的灵敏度
运用连续稀释好的质粒(pMD18-T-HPV16：5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100和5×10-1拷贝/微升)进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示结果。针对HPV16检测，MCDA-LFB的检测范围为5×105～5×100拷贝/微升，LFB在TL1和CL区域出现红色线(图9A中的1-6)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图9A中的7-8)。图9的A为运用LFB可视化读取MCDA扩增结果：图9A中1到6表示pMD18-T-HPV16的模板量为5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝/微升，图9A中的7-8分别表示pMD18-T-HPV16的模板量为5×10-1拷贝/微升和空白对照(1微升双蒸水)。
运用连续稀释好的质粒(pMD18-T-HPV18：5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100和5×10-1拷贝/微升)进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示结果。针对HPV18检测，MCDA-LFB的检测范围为5×105～5×100拷贝/微升，LFB在TL2和CL区域出现红色线(图9D中的1-6)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图9D中的7-8)。图9的D为运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图9D中的1-6表示pMD18-T-HPV18的模板量为5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝/微升，图9D中的7-8分别表示pMD18-T-HPV16的模板量为5×10-1拷贝/微升和空白对照(1微升双蒸水)。
其他检测方法确认检测结果：将图9的A和D的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图9的C和F。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了MCDA-LFB的检测灵敏度。此外，LFB和电泳确认的检测结果与实时浊度的检测结果一致(见图9的B和E)。
实施例4.ET-MCDA-LFB同时检测多个靶标的灵敏度
为了实现AUDG-MCDA-LFB技术同时检测多个靶标，内切酶介导的实时多重MCDA技术(ET-MCDA)被用于调节多重MCDA的反应体系(ET-MCDA技术详见申请人的专利CN201610219350.6)。在上述描述的多重ET-MCDA扩增条件下，HPV16和HPV18在同一反应中能够被同时检测(图10)。
多重ET-MCDA反应体系：置换引物16-F1和16-F2的浓度为10pmol,扩增引物16-C1和16-C2的浓度为10pmol，扩增引物16-R1，16-R2，16-D1和16-D2的浓度为20pmol，交叉引物16-CP1和16-E-CP1的浓度为20pmol,16-CP2的浓度为40pmol，置换引物18-F1和18-F2的浓度为10pmol,扩增引物18-C1和18-C2的浓度为10pmol，扩增引物18-R1，18-R2，18-D1和18-D2的浓度为10pmol，交叉引物18-CP1和18-E-CP1的浓度为10pmol,18-CP2的浓度为20pmol，2M的Betain，8mM的MgSO4，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1.4mM的dATP，1.0mM的dTTP,0.4mM的biotin-11-dUTP，1.4mM的dCTP，1.0mM的dGTP，10U的链置换DNA聚合酶，1U的南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，15U Nb.BsrDI的内切酶，HPV16及HPV18各1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时。
图10的A和B实时扩增曲线被同时产生，来自不同的荧光通道。此外多重ET-MCDA针对HPV16和HPV18的检测下限也为5×100拷贝/微升。图10的A1/B1到A6/B6表示pMD18-T-HPV16/pMD18-T-HPV18的模板量为5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝/微升，A7/B7和A8/7B8,分别表示pMD18-T-HPV16/pMD18-T-HPV18的模板量为5×10-1拷贝/微升和空白对照(1微升双蒸水)。
实施例5.多重MCDA-LFB同时检测多个靶标的灵敏度
为了实现MCDA-LFB能够同时检测多个靶标，首先要保证AUDG-MCDA-LFB技术在扩增步骤能实现在一个反应体系中同时扩增多个目的序列。多重MCDA扩增体系根据多重ET-MCDA体系相似，仅仅用相同量的16-CP1*和18-CP1*代替16-E-CP1和18-E-CP1，这样保证多重MCDA体系能够同时扩增多个目的序列在同一反应体系中。
多重MCDA反应体系：置换引物16-F1和16-F2的浓度为10pmol,扩增引物16-C1和16-C2的浓度为10pmol，扩增引物16-R1，16-R2，16-D1和16-D2的浓度为20pmol，交叉引物16-CP1和16-CP1*的浓度为20pmol,16-CP2的浓度为40pmol，置换引物18-F1和18-F2的浓度为10pmol,扩增引物18-C1和18-C2的浓度为10pmol，扩增引物18-R1，18-R2，18-D1和18-D2的浓度为10pmol，交叉引物18-CP1和18-CP1*的浓度为10pmol,18-CP2的浓度为20pmol，2M的Betain，8mM的MgSO4，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1.4mM的dATP，1.0mM的dTTP，0.4mM的biotin-11-dUTP，1.4mM的dCTP，1.0mM的dGTP，10U的链置换DNA聚合酶，0.5U的南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，HPV16及HPV18各1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时，80℃5min终止反应。
运用连续稀释好的pMD18-T-HPV16和pMD18-T-HPV18DNA模板进行多重MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示(图11)：AUDG-MCDA-LFB技术在检测多个靶标时，检测下限仍然为5×100拷贝/微升，LFB在TL1，TL2和CL区域出现红色线(LFB1-LFB6)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝/微升以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB7-LFB8)。图10为运用LFB可视化读取多重MCDA扩增结果：LFB1到LFB6表示pMD18-T-HPV16和pMD18-T-HPV18DNA模板量为5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝，LFB7表示pMD18-T-HPV16和pMD18-T-HPV18DNA模板量为5×10-1拷贝，LFB8表示空白对照(2微升双蒸水)。
实施例6.AUDG消除MCDA交叉污染评价
为了证实AUDG能够作为有效的工具消除dUTP掺入的扩增产物，HPV 16-MCDA，HPV18-MCDA及Multiplex MCDA反应的扩增产物分别被连续稀释(1×10-14，1×10-15，1×10-16，1×10-17，1×10-18，1×10-19和1×10-20克/微升)。这三个稀释度的扩增产物分别被用作模板，用于HPV16-MCDA,HPV18-MCDA和Multiplex MCDA反应。在反应体系中无AUDG存在的情况下，HPV 16-MCDA能够检测污染子的能力为1×10-19克/微升(图12的A)；在反应体系中AUDG存在的情况下，HPV 16-MCDA能够检测污染子的能力为1×10-15克/微升(图12的C)。在反应体系中无AUDG存在的情况下，HPV 18-MCDA能够检测污染子的能力为1×10-19克/微升(图12的B)；在反应体系中AUDG存在的情况下，HPV 18-MCDA能够检测污染子的能力为1×10-15克/微升(图12的D)。在反应体系中无AUDG存在的情况下，多重MCDA能够检测污染子的能力为1×10-18克/微升(图13的A)；在反应体系中AUDG存在的情况下，多重MCDA能够检测污染子的能力为1×10-15克/微升(图13的B)。在常规情况下，扩增产物导致的，能够产生交叉反应的污染子浓度通常为1×10-18克/微升。本发明中，无论是针对单一还是多重MCDA产生的污染子，AUDG的降解能达1×10-15克/微升。因此本发明中的AUDG-MCDA方法能够有效的消除污染子。
实施例7.测定AUDG-MCDA-LFB技术的最佳反应时间
在多重反应体系条件下，同时加入针对HPV16及HPV18的质粒DNA模板(即连续稀释好的HPV16及HPV18的质粒DNA模板)及所设计的对应的两套MCDA引物。反应在恒温条件下进行(63℃)，恒温时间分别20分钟、30分钟、40分钟和50分钟。运用LFB检测显示：MCDA-LFB技术在检测多个靶标时，最佳反应时间为40分钟(图14)。当多重MCDA体系在扩增步骤恒温40分钟时，检测限水平的模板能够被检出(图14的C)。图14的C中，LFB检测范围为5×105拷贝～5×100拷贝，LFB在TL1，TL2和CL区域出现红色线(LFB1-LFB6)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB7-LFB8)。图14为运用LFB可视化读取多重MCDA体系从20分钟到50分钟的扩增结果：LFB1到LFB7表示HPV16和HPV18的模板量为5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100和5×10-1拷贝；LFB8表示空白对照(2微升双蒸水)。
实施例8.测定AUDG-MCDA-LFB技术的特异性
以常见的HPV型别(6，11，31，33，35，39，45，51，52，56，66，73，81，82，83)的基因组核酸为模板评价AUDG-MCDA-LFB技术的特异性。AUDG-MCDA-LFB技术能准确检测到HPV16和HPV18，说明AUDG-MCDA-LFB方法的特异性良好，见图15。LFB1：阳性对照(pMD18-T-HPV16/pMD18-T-HPV18的模板量为5×104拷贝/微升)；LFB2-9：HPV16模板；LFB10-17：HPV18模板；LFB18-30：HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV66，HPV73，HPV81，HPV82，HPV83。结果表明，AUDG-MCDA-LFB能够正确的检测靶序列，通过TL1和TL2可视线可将不同靶序列鉴别开。
序 列 表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> AUDG介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 1
ttaaatgaca gctcagagga 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 2
tggtttctga gaacagatg 19
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 3
aggttacaat attgtaatgg gctctggagg atgaaataga tggtcc 46
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 4
tgcaatgagg ttacaatatt gtaatgggct ctggaggatg aaatagatgg tcc 53
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 5
aggttacaat attgtaatgg gctctggagg atgaaataga tggtcc 46
<210> 6
<211> 43
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<213> Human papillomavirus type 16
<400> 6
acaaagcaca cacgtagaca ttcgacaatt cctagtgtgc cca 43
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 7
aggttacaat attgtaatgg gctct 25
<210> 8
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<212> DNA
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<400> 8
acaaagcaca cacgtagaca ttcg 24
<210> 9
<211> 18
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<213> Human papillomavirus type 16
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ggttctgctt gtccagct 18
<210> 10
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<213> Human papillomavirus type 16
<400> 10
tactttggaa gacctgtta 19
<210> 11
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agagtcacac ttgcaacaa 19
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acgcttcggt tgtgcgt 17
<210> 13
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tatgcgtgct tcacctgg 18
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atcatattcc tcaacatgtc tg 22
<210> 15
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<213> Human papillomavirus type 18
<400> 15
accctgtgcc ttatgtaacc aatatgtatt ctccctctcc aagtg 45
<210> 16
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<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 16
tgcaatgacc ctgtgcctta tgtaaccaat atgtattctc cctctccaag tg 52
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<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 17
accctgtgcc ttatgtaacc aatatgtatt ctccctctcc aagtg 45
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
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accactcgca gtaccaattt aactgcttaa atttggtagc atca 44
<210> 19
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<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 19
accctgtgcc ttatgtaacc aatat 25
<210> 20
<211> 23
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<213> Human papillomavirus type 18
<400> 20
accactcgca gtaccaattt aac 23
<210> 21
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<213> Human papillomavirus type 18
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agtcagaggt aacaatagag 20
<210> 22
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acacagtctc ctgtacct 18
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tgccagcaaa caccattgt 19
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<213> Human papillomavirus type 18
<400> 24
caattatttg ttactgtggt aga 23

Claims (10)

1.一种多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供第一套引物：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:6所示；同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示，和/或
提供第二套引物：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:13所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:14所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:15所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:18所示；同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO:19所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:20所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:21所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:22所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:23所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:24所示；
(4)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、常规的dNTP，以及生物素化的脱氧尿嘧啶存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(5)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，两套引物中的所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记的半抗原彼此不同；当在一条所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记荧光素时，则在另一条所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记地高辛。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板(1)，在所述背板(1)上依次设置装有样品垫(2)、金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)及吸水垫(5)，在所述硝酸纤维素膜(4)上依次设置检测线(41)、检测线(42)及控制线(43)，在金标垫(3)、检测线(41)、检测线(42)及控制线(43)区域依次包被有色基团修饰的亲和素化的高分子纳米粒子(6)、抗荧光素抗体(7)、抗地高辛抗体(8)及生物素偶联的牛血清蛋白(9)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在63℃的环境中进行的。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述目的基因为HPV16型的E7基因或者HPV18型的L1基因。
7.根据权利要求6的所述的方法，其特征在于，在所述第一套引物中的交叉引物CP1的5’端标记有荧光素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ IDNO:5所示，或者在所述第二套引物中的交叉引物CP1的5’端标记有地高辛的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ IDNO:17所示。
8.一组用于恒温扩增HPV16型的E7基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:6所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:7所示的扩增引物C1，如SEQ IDNO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时还提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*。
9.一组用于恒温扩增HPV18型的L1基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQID NO:13所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:14所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:15所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:18所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:19所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:20所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:21所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:22所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:23所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:24所示的扩增引物R2，同时还提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*。
10.根据权利要求8或9所述的引物序列，其特征在于，在交叉引物CP1*或CP2*的5’端标记的半抗原为荧光素或者地高辛。
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