CN107574232A - 人eml4‑alk融合基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种人EML4‑ALK融合基因检测方法，其在EML4E2‑ALKE20、EML4E3‑ALK E20、EML4E6‑ALK E20、EML4E13‑ALK E20、EML4E14‑ALK E20、EML4E15‑ALK E20、EML4E17‑ALK E20、EML4E18‑ALKE20、EML4E20‑ALK E20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman‑MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4‑ALK融合类型的检测。

Description

人EML4-ALK融合基因检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种人EML4-ALK融合基因检测方法。

背景技术

EML4-ALK融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23)，其5’端为EML4的片段，3’端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。EML4基因可在多个位点发生断裂，断开后的氨基末端片段取代了ALK的胞外域及跨膜域，直接与位于ALK第20外显子的胞内催化域相连，形成多种EML4-ALK融合基因突变体。EML4-ALK的信号转导通路为PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK和PLC-γ/PIP2等，这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达，引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，ALK重排的阳性率大约为3～5％，在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4-ALK融合的几率更高。2011年，美国食品和药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于治疗间变型淋巴瘤激酶(ALK)基因重排的非小细胞肺癌(NSCLC)。克唑替尼是一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR，c-Met)和ROS1。EML4-ALK融合基因阳性患者不能从EGFR-TKI的基础治疗中受益，表现为原发耐药。而针对EML4-ALK融合基因阳性的患者，使用克唑替尼等针对ALK基因的小分子抑制剂可以获得良好的临床治疗效果。因此在使用针对ALK基因的小分子抑制剂前，需进行EML4-ALK融合基因突变的检测。

目前对人EML4-ALK融合基因的检测方法主要有：荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization,FISH)、免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、荧光定量PCR等。虽然FISH是目前EML4-ALK融合基因检测的金标准，但是FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定结果才具有可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。IHC通过检测ALK蛋白的过表达来检测融合，但是由于ALK蛋白的差异表达水平较低，其敏感性和重复性较差，而且不同实验室间没有标准的操作流程，同样的检测结果会存在不同的解释。FISH和IHC不能用于肿瘤组织外的其他样本。荧光定量PCR检测灵敏度高，成本相对较低，通量高，周期短，而且适用的样本范围较广，除可检测组织样本外，还可检测液体样本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有人EML4-ALK融合基因检测方法所存在的上述技术问题而提供一种采用实时荧光PCR方法,能够检出EML4-ALK的以下9种融合类型的人EML4-ALK融合基因检测方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，在EML4E2-ALK E20、EML4E3-ALKE20、EML4E6-ALK E20、EML4E13-ALK E20、EML4E14-ALK E20、EML4E15-ALK E20、EML4E17-ALK E20、EML4E18-ALK E20、EML4E20-ALK E20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman-MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4-ALK融合类型的检测。

在本发明的一个优选实施例中，所述引物和探针如下：

在本发明的一个优选实施例中，具体步骤如下：

(1)RNA提取；

RNA提取使用离心柱型天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒；具体操作步骤如下：

(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；

注意:如果样品表面暴露于空气中,最初的2～3片弃掉不用。

(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；

(1.3)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；

(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。

(1.6)室温15-25℃，12000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.7)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀(用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇)；

(1.8)打开管盖，室温15-25℃或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；

注意:完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。

(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μl Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀；

(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min。

(1.11)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；

(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；

(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀)；

(1.14)转移7 0 0μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.15)重复步骤(1.15)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(1.16)DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；

(1.17)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(1.18)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RW1，室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.19)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.20)重复步骤(1.19)；

(1.21)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验；

(1.22)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液；

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存；配置胶用RNA专用系统；

(2)RNA反转录成cDNA；

RNA反转录使用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),按照试剂盒说明书操作。具体步骤如下：

(2.1)准备如下反应体系

(2.2)65℃孵育5min,然后立刻放回冰上；

(2.3)配制如下反应体系

温和的将上述体系混匀。

(2.4)然后按以下程序反应：

30℃ 10min

42℃ 60min

70℃ 15min

(2.3)结束后，立刻放回冰上(得到cDNA)。

(3)实时荧光定量PCR检测；

荧光定量PCR反应体系(20μL):

PCR反应程序：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)。

反应体系中每条引物的终浓度均为200nM,探针终浓度均为100nM。

每个反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)。

PC:以含EML4-ALK融合基因片段的质粒10-7ng为模板。

NC:用无菌ddH2O做阴性对照。

内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。

(4)若检测到阳性结果，测序验证。

分析阳性对照和阴性对照是否正常，判断检测结果是否有效。然后根据内参反应和检测反应的扩增曲线，判读样本的检测结果。

若检测到阳性结果，可将其PCR产物回收，用对应的R引物测序，测序结果进行序列比对，能找到哪一条正向引物的序列，为那一条引物所在外显子对应的EML4-ALK融合类型。

由于采用了如上的技术方案，本发明与现有技术相比存在如下优点：

1、检测灵敏度高，可准确检测到低至10个拷贝的融合基因；

2、用时短，只需2小时就可完成检测；

3、判读方便，特异性强，根据有无扩增信号判定结果；

4、准确性高，阳性结果通过测序验证，保证结果的准确性。

5、成本低，1个检测反应和1个内参反应检测9种EML4-ALK融合。

附图说明

图1是本发明实施例各样本检测结果图。其中，图1A为阴性对照的检测结果，图1B为阳性对照的检测结果，图1C为样本1的检测结果，图1D为样本2的检测结果。

图2是样本2的测序验证结果峰图。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不仅限于实施例。

实施例1：荧光定量PCR快速检测人EML4-ALK融合基因

步骤一：按上述RNA提取步骤提取样本RNA。

步骤二：按上述反转录步骤将提取的RNA反转录成cDNA。

步骤三：荧光定量PCR反应体系配置

荧光定量PCR反应体系(20μL):

EML4-ALK融合检测反应和内参RNase P反应分2管配置。每个样品都要进行这2个反应，同时每一批次设置一个阳性对照和一个阴性对照。

步骤四：荧光定量PCR反应进行

将步骤三中配置的反应液在Stepone Plus荧光定量PCR仪中按以下程序反应：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)。

其中样本如下：

样本1：已知EML4-ALK融合阴性样本cDNA；

样本2：已知EML4-ALK融合阳性(EML4E13-ALK E20)样本cDNA；

步骤五：结果判定

阴性对照的结果见图1A，检测反应和内参反应均无扩增信号，说明反应体系无污染。

阳性对照的结果见图1B，检测反应和内参反应均有扩增信号，说明反应体系正常。

样本1的结果见图1C，内参反应有扩增信号，检测反应无扩增信号，说明样本合格，检测结果可靠，为EML4-ALK融合阴性。

样本2的结果见图1D，内参反应和检测反应均有扩增信号，说明样本合格，检测结果可靠，为EML4-ALK融合阳性。PCR产物测序验证，用Chromas软件打开测序峰图结果，在Edit菜单中点击Reverse+Complement显示反义链，能找到引物RT-EML4-E13-F的序列(见图2)，与该样本已知融合类型一致。

由以上的实验数据可以看出，实验检测结果与实际相符。通过对检测结果扩增信号的分析，可以准确的检测出EML4-ALK融合基因。

Claims (3)

1.一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，在EML4 E2-ALK E20、EML4 E3-ALKE20、EML4 E6-ALK E20、EML4 E13-ALK E20、EML4 E14-ALK E20、EML4 E15-ALK E20、EML4E17-ALK E20、EML4 E18-ALK E20、EML4 E20-ALK E20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman-MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4-ALK融合类型的检测。

2.如权利要求1所述的一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，所述引物和探针如下：

3.如权利要求1或2所述的一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)RNA提取；

RNA提取使用离心柱型天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒；具体操作步骤如下：

(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；

注意:如果样品表面暴露于空气中,最初的2～3片弃掉不用。

(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；

(1.3)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；

(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。

(1.6)室温15-25℃，12000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.7)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀(用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇)；

(1.8)打开管盖，室温15-25℃或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；

注意:完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。

(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μl Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀；

(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min。

(1.11)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；

(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；

(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀)；

(1.14)转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.15)重复步骤(1.15)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(1.16)DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；

(1.17)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(1.18)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RW1，室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.19)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.20)重复步骤(1.19)；

(1.21)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验；

(1.22)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液；

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存；配置胶用RNA专用系统；

(2)RNA反转录成cDNA；

RNA反转录使用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),按照试剂盒说明书操作。具体步骤如下：

(2.1)准备如下反应体系

(2.2)65℃孵育5min,然后立刻放回冰上；

(2.3)配制如下反应体系

温和的将上述体系混匀。

(2.4)然后按以下程序反应：

30℃ 10min

42℃ 60min

70℃ 15min

(2.3)结束后，立刻放回冰上(得到cDNA)。

(3)实时荧光定量PCR检测；

荧光定量PCR反应体系(20μL):

PCR反应程序：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)。

反应体系中每条引物的终浓度均为200nM,探针终浓度均为100nM。

每个反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(Negative Control，NC)。

PC:以含EML4-ALK融合基因片段的质粒10-7ng为模板。

NC:用无菌ddH2O做阴性对照。

内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。

(4)若检测到阳性结果，测序验证。

分析阳性对照和阴性对照是否正常，判断检测结果是否有效。然后根据内参反应和检测反应的扩增曲线，判读样本的检测结果。

若检测到阳性结果，可将其PCR产物回收，用对应的R引物测序，测序结果进行序列比对，能找到哪一条正向引物的序列，为那一条引物所在外显子对应的EML4-ALK融合类型。