CN109022581A - Eml4-alk融合基因荧光定量pcr检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种EML4‑ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，包括：反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物混合液I、引物混合液II、引物混合液III、引物混合液IV、引物混合液V、引物混合液VI、引物混合液VII、引物混合液VIII、DNA聚合酶、纯化水、阳性质控品，以上引物和探针浓度均为10umol，每个混合液中引物与探针的体积比例为2.5:1。试剂盒的扩增反应体系包括：DNA聚合酶：0.2ul，引物混合液：1.2ul，样本/阳性质控品/纯化水：2ul，纯化水：12.1ul，MgCl2:2ul，10*buffer:2ul，dNTP:0.5ul，本发明检测灵敏度高，特异性好，分别针对EML4‑ALK融合基因7种变异体设计了特异性引物和荧光探针，相关反应液分管进行检测，可以排除各引物间的干扰，比将采用混合反应液的情形更能极大地提高检测特异性和灵敏度，且假阳性低。

Description

EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒。
背景技术
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升。1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年。肺癌的病因至今尚不完全明确，医学统计表明肺癌的致病因素主要为吸烟(包括二手烟)，80％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸烟造成的，此外与石绵、氡、砷、电离辐射、卤素烯类、多环性芳香化合物、镍等工业致癌物的接触，种族、家属史对肺癌的发病均有影响。
肺癌分小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等。NSCLC占所有肺癌病例的80％—90％，严重威胁人类健康。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。手术治疗是NSCLC最佳治疗方法，但当NSCLC发现时，仅20％—30％的病例有手术指征，且术后复发和转移率仍高达50％以上。分子靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点，越来越成为非小细胞肺癌治疗的热点。靶向治疗为肺癌的治疗增添了一个新的领域，也为肺癌的治疗带来了新的希望。
分子靶向治疗是一种针对肿瘤发生、发展过程的细胞信号传导及其他生物学途径的治疗手段，其特点是能选择性地作用于肿瘤细胞，定向阻断癌细胞的增殖、转移、信号传导，阻止肿瘤新生血管的生成，破坏癌细胞的新陈代谢，故特异性高，不良反应小，拥有良好的发展前景。肺癌靶向治疗涉及肿瘤细胞生长的多个重要环节，目前研究较为成熟且应用于临床的主要有两个作用点，一个是血管内皮生长因子受体(VEGFR)，另一个为表皮生长因子受体(EGFR)。此外，还有最新发现的棘皮动物微管结合蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like4，EML4-ALK)融合基因。已有研究提示该融合基因可能存在于肺癌在内的多种实体肿瘤，但以NSCLC的检出率最高，同时因其与EGFR突变、K-ras突变的不共存现象以及含有EML4-ALK基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。EML4-ALK的发现定义了NSCLC的一个新亚型，堪称近年来NSCLC研究史上一个里程碑式的事件。编码EML4的基因位于2号染色体短臂的21号基因座位，而编码ALK的基因位于2号染色体23号基因座位，两者在染色体上相隔约1270万个碱基对，且转录方向相反。基因融合时，EML4基因在染色体上发生断裂，形成不同长度的外显子拼接片段，调转方向，插人位置相对保守的ALK基因19、20外显子之间，从而形成长度不等的各种EML4-ALK融合变体，目前，至少已经发现了9种变异亚型，分别为亚型1(E13；A20)(这种命名法指的是EML4的13号外显子与ALK的20号外显子发生融合)、亚型2(E20；A20)、亚型3(E6a/b；A20)、亚型4(E14；A20)、亚型5(E2a/b；A20)、亚型6(E13；A20)(注：亚型6为EML4的第13外显子加上一个49bp的小片段再与ALK的第20外显子相连)、亚型7(E14；A20)、亚型8(E15；A20)、亚型9(E18；A20)。最常见的融合变体为亚型1(E13；A20)，其次为亚型3(E6a/b；A20)，经检测，这两种变体在EML4-ALK融合基因NSCLC患者的发生率分别为33％和29％。所有这些融合基因均有生物学功能，表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶。EML4-ALK融合变异日前已经被鉴定为NSCLC，特别是肺腺癌的一个独特的分子亚型，EML4-ALK融合基因阳性患者有其独特的临床病理特征。针对这一靶点的检测，将有助于筛选EGFR-TKI合适的治疗人群并开启NSCLC靶向治疗的新领域。
目前国际上检测EML4-ALK融合基因常见的技术方法有：逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)等。RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
RT-PCR可能是确认NSCLC存在ALK融合基因的一种快速诊断方法，理论上，这种技术的优势在于其检测突变转录本的高敏感性，如发现扩增产物则意味着ALK融合基因。但在临床实践中，该技术面临诸多挑战：(1)引物多元化，研究需要设计多个引物检测9个变异体和2个非EMIA易位；(2)福尔马林固定石蜡包埋的组织DNA高度片段化，不利于检测；(3)PCR结果常出现假阳性，很难作为常规临床检测方法。
FISH是用特定荧光标记探针与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。FISH是检测ALK融合基因更加特异的方法，其优势在于可商业开发系列探针，应用于肺腺癌检测ALK融合基因。虽然FISH是检测肺腺癌ALK融合基因的一种敏感和特异的方法，但也并非万无一失的，而且不能鉴别不同的EML4-ALK融合基因变体。不同数量断裂信号的治疗策略以及结果判读目前仍无统一标准。
IHC是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。IHC的最大优势是检测肿瘤特异性抗原的表达而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征。对于活检组织切片使用组织染色来检测ALK蛋自表达，结果可能是微弱和局部的，同时IHC方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。此外IHC同样不能鉴定ALK融合患者具体属于那种变体亚型。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，包括：反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物混合液I、引物混合液II、引物混合液III、引物混合液IV、引物混合液V、引物混合液VI、引物混合液VII、引物混合液VIII、DNA聚合酶、纯化水、阳性质控品，以上引物和探针浓度均为10umol，每个混合液中引物与探针的体积比例为2.5:1。
所述引物混合液I包含：Y1F：GTTCTTACTGGAGACTCAGGTGG；Y1R:TAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液II包含：Y2F：CATCACACACCTTGACTGGTCC；Y2R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA，P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液III包含：Y3F：CGAAAATACCTTCAACACCCA；Y3R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液IV包含：Y4F：ATGGCAGTGTGTTCACACTTT；Y4R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液V包含：Y5F：TGTGGCCTCAGTGAAAAAAT；Y5R:GCCCAGACCCCGAATGA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液VI包含：Y6F：GGCACAATCAGAGCTGTAGCA；Y6R:GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液VII包含：Y7F：GGTGGTTTGTTCTGGATG；Y7R:AGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述引物混合液VIII包含：Y8F：TGCAGAGCCCTGAGTACAAG；Y8R：GTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
所述试剂盒的扩增反应体系包括：DNA聚合酶：0.2ul，引物混合液：1.2ul，样本/阳性质控品/纯化水：2ul，纯化水：12.1ul，MgCl2:2ul，10*buffer:2ul，dNTP:0.5ul。
所述试剂盒的扩增反应程序为：95℃环境下5min，95℃环境下20sec；60℃环境下40sec，50个循环，40℃环境下10sec。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：
1.检测灵敏度高，特异性好：本发明分别针对EML4-ALK融合基因7种变异体设计了特异性引物和荧光探针，相关反应液分管进行检测，可以排除各引物间的干扰，比将采用混合反应液的情形更能极大地提高检测特异性和灵敏度，且假阳性低
2.线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；
3.操作简单，自动化程度高，Q-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率；
4.结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观；
6.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害；
7.没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
8.本发明提供的特异性检测试剂盒能一次性筛查EML4-ALK融合基因7种变异体，快速简便。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以两个元件内部的连通，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，包括：反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物混合液I、引物混合液II、引物混合液III、引物混合液IV、引物混合液V、引物混合液VI、引物混合液VII、引物混合液VIII、DNA聚合酶、纯化水、阳性质控品，以上引物和探针浓度均为10umol，每个混合液中引物与探针的体积比例为2.5:1。
具体的，引物混合液I包含：Y1F：GTTCTTACTGGAGACTCAGGTGG；Y1R:TAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液II包含：Y2F：CATCACACACCTTGACTGGTCC；Y2R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA，P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液III包含：Y3F：CGAAAATACCTTCAACACCCA；Y3R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液IV包含：Y4F：ATGGCAGTGTGTTCACACTTT；Y4R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液V包含：Y5F：TGTGGCCTCAGTGAAAAAAT；Y5R:GCCCAGACCCCGAATGA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液VI包含：Y6F：GGCACAATCAGAGCTGTAGCA；Y6R:GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液VII包含：Y7F：GGTGGTTTGTTCTGGATG；Y7R:AGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，引物混合液VIII包含：Y8F：TGCAGAGCCCTGAGTACAAG；Y8R：GTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1:5'-FAM-CAAGCTCCGCACCT-MGB-3'。
具体的，试剂盒的扩增反应体系包括：DNA聚合酶：0.2ul，引物混合液：1.2ul，样本/阳性质控品/纯化水：2ul，纯化水：12.1ul，MgCl2:2ul，10*buffer:2ul，dNTP:0.5ul。
具体的，试剂盒的扩增反应程序为：95℃环境下5min，95℃环境下20sec；60℃环境下40sec，50个循环，40℃环境下10sec。
本发明能够能快速、准确、高敏感度地检测7种最常见的EML4-ALK融合基因变体，包括亚型1(E13；A20)、亚型2(E20；A20)、亚型3(E6；A20)、亚型4(E14；A20)、亚型5(E2；A20)、亚型6(E15；A20)、亚型7(E18；A20)7种融合变体，从而建立检测7种最常见EML4-ALK融合基因变体的实时荧光定量PCR体系。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括：反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物混合液I、引物混合液II、引物混合液III、引物混合液IV、引物混合液V、引物混合液VI、引物混合液VII、引物混合液VIII、DNA聚合酶、纯化水、阳性质控品，以上引物和探针浓度均为10umol，每个混合液中引物与探针的体积比例为2.5:1。
2.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液I包含：Y1F：GTTCTTACTGGAGACTCAGGTGG；Y1R: TAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1: 5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
3.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液II包含：Y2F：CATCACACACCTTGACTGGTCC；Y2R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA，P1: 5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
4.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液III包含：Y3F：CGAAAATACCTTCAACACCCA；Y3R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1: 5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
5.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液IV包含：Y4F：ATGGCAGTGTGTTCACACTTT；Y4R：GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC；P1:5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
6.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液V包含：Y5F：TGTGGCCTCAGTGAAAAAAT；Y5R: GCCCAGACCCCGAATGA；P1: 5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
7.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液VI包含：Y6F：GGCACAATCAGAGCTGTAGCA；Y6R: GTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1: 5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
8.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液VII包含：Y7F：GGTGGTTTGTTCTGGATG；Y7R: AGTTGGGGTTGTAGTCGGTC ；P1:5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
9.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述引物混合液VIII包含：Y8F：TGCAGAGCCCTGAGTACAAG；Y8R：GTTGGGGTTGTAGTCGGTCA；P1:5'-FAM- CAAGCTCCGCACCT -MGB-3'。
10.根据权利要求1所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的扩增反应体系包括：DNA聚合酶：0.2ul，引物混合液：1.2ul，样本/阳性质控品/纯化水：2ul，纯化水：12.1ul， MgCl2 :2ul，10*buffer:2ul，dNTP:0.5ul；所述试剂盒的扩增反应程序为：95℃环境下5min，95℃环境下20sec；60℃环境下40sec，50个循环，40℃环境下10sec。
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