CN107541550A - 人ros1融合基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种人ROS1融合基因检测方法，其在CD74 E6‑ROS1 E32，CD74 E6‑ROS1 E34，SLC34A2 E13‑ROS1 E32，SLC34A2 E4‑ROS1 E32，SLC34A2 E4‑ROS1 E34，SDC4 E2‑ROS1 E32，SDC4 E4‑ROS1 E32，SDC4 E4‑ROS1 E34，TPM3 E8‑ROS1 E35，EZR E10‑ROS1 E34，LRIG3 E16‑ROS1 E35的ROS1融合partner基因的融合外显子上各设计一条引物，在ROS1的32、34、35外显子上各分别设计一条引物和Taqman‑MGB探针；检测反应分3管进行，融合到ROS1的E32、E34、E35的融合类型分别检测，同时设置一个内参反应。本发明采用实时荧光PCR方法,能够检出ROS1的以下11种融合类型。

Description

人ROS1融合基因检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种人ROS1融合基因检测方法。

背景技术

ROS1基因编码一种受体酪氨酸激酶，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，ROS1重排的阳性率大约为1～2％,当ROS1与CD74、SLC34A2、SDC4等基因发生融合后，会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及其下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，进而引起肿瘤的发生。2011年，美国食品和药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。克唑替尼是一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR，c-Met)和ROS1。克唑替尼(Crizotinib)对于ROS1融合阳性的非小细胞肺癌(NSCLC)患者也有显著疗效，因此ALK融合阴性时，检测ROS1基因的融合状态可以筛选能够从克唑替尼治疗中获益的患者。

目前对人ROS1融合基因的检测方法主要有：荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization,FISH)、免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、荧光定量PCR等。FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定结果才具有可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。IHC通过检测ROS1蛋白的过表达来检测融合，其敏感性和重复性较差，而且不同实验室间没有标准的操作流程，同样的检测结果会存在不同的解释。FISH和IHC不能用于肿瘤组织外的其他样本。荧光定量PCR检测灵敏度高，成本相对较低，通量高，周期短，而且适用的样本范围较广，除可检测组织样本外，还可检测液体样本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有人ROS1融合基因检测方法所存在的上述技术问题而提供一种采用实时荧光PCR方法,能够检出ROS1的以下11种融合类型的人ROS1融合基因检测方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种人ROS1融合基因检测方法，其特征在于，在CD74E6-ROS1E32，CD74E6-ROS1E34，SLC34A2E13-ROS1E32，SLC34A2E4-ROS1E32，SLC34A2E4-ROS1E34，SDC4E2-ROS1E32，SDC4E4-ROS1E32，SDC4E4-ROS1E34，TPM3E8-ROS1E35，EZR E10-ROS1E34，LRIG3E16-ROS1E35的ROS1融合partner基因的融合外显子上各设计一条引物，在ROS1的32、34、35外显子上各分别设计一条引物和Taqman-MGB探针。检测反应分3管进行，融合到ROS1的E32、E34、E35的融合类型分别检测，同时设置一个内参反应。

在本发明的一个优选实施例中，所述引物和探针如下：

在本发明的一个优选实施例中，具体步骤如下：

(1)、RNA提取；

RNA提取使用天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒(离心柱型)；按照试剂盒说明书操作；具体操作步骤如下：

(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；

注意:如果样品表面暴露于空气中,最初的2～3片弃掉不用；

(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；

(1.3)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；

(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀；

(1.6)室温(15-25℃)，12000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.7)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀(用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇)；

(1.8)打开管盖，室温(15-25℃)或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；

注意:完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响；

(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μlProteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀；

(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min；

(1.11)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；

(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；

(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀)；

(1.14)转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.15)重复步骤(1.13)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.16)DNase I工作液的配制：取10μlDNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；

(1.17)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(1.18)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RW1，室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.19)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.20)重复步骤(1.19)；

(1.21)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验；

(1.22)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液；

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存；配置胶用RNA专用系统；

(2)RNA反转录成cDNA；

RNA反转录使用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),按照试剂盒说明书操作；具体步骤如下：

(2.1)准备如下反应体系

(2.2)65℃孵育5min,然后立刻放回冰上；

(2.3)配制如下反应体系

温和的将上述体系混匀；

(2.4)然后按以下程序反应：

30℃ 10min

42℃ 60min

70℃ 15min

(2.5)结束后，立刻放回冰上(得到cDNA)；

(3)实时荧光定量PCR检测；

荧光定量PCR反应体系(20μL):

PCR反应程序：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)；

反应体系中每条引物的终浓度均为200nM,探针终浓度均为100nM；

每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；

PC:以含ROS1融合基因片段的质粒10-7ng为模板；

NC:用无菌ddH2O做阴性对照；

内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够；

(4)结果分析

分析阳性对照和阴性对照是否正常，判断检测结果是否有效。然后根据内参反应和检测反应的扩增曲线，判读样本的检测结果。若检测到阳性结果，可将其PCR产物回收，用对应的R引物测序，序列比对，能找到哪一条正向引物的序列，为那一条引物所在外显子对应的ROS1融合类型。

由于采用了如上的技术方案，本发明与现有技术相比存在如下优点：

1、检测灵敏度高，可准确检测到低至10个拷贝的融合基因；

2、用时短，只需2小时就可完成检测；

3、判读方便，特异性强，根据有无扩增信号判定结果；

4、准确性高，阳性结果通过测序验证，保证结果的准确性；

5、成本低，3个检测反应和一个内参反应检测11种ROS1融合类型。

附图说明

图1是本发明实施例各样本检测结果图。其中，图1A为阴性对照的检测结果，图1B为阳性对照的检测结果，图1C为样本1的检测结果，图1D为样本2的检测结果。

图2是样本2的测序验证结果峰图。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不仅限于实施例。

实施例1：荧光定量PCR快速检测人ROS1融合基因

步骤一：按上述RNA提取步骤提取样本RNA。

步骤二：按上述反转录步骤将提取的RNA反转录成cDNA。

步骤三：荧光定量PCR反应体系配置

荧光定量PCR反应体系(20μL):

ROS1同一外显子上的融合类型合在一管检测，ROS1融合检测反应分3管配置，分别为E32、E34、E35反应；内参RNase P反应1管配置。每个样品都要进行这4个反应，同时每一批次设置一个阳性对照和一个阴性对照。

步骤四：荧光定量PCR反应进行

将步骤三中配置的反应液在ABI SteponePlus荧光定量PCR仪中按以下程序反应：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)。

其中样本如下：

样本1：已知ROS1融合阴性样本cDNA；

样本2：已知ROS1融合阳性(SLC34A2E4-ROS1E32)样本cDNA；

步骤五：结果判定

阴性对照的结果见图1A，内参反应和检测反应均无扩增信号，说明反应体系无污染。

阳性对照的结果见图1B，内参反应和检测反应均有扩增信号，说明反应体系正常。

样本1的结果见图1C，内参反应有扩增信号，检测反应无扩增信号，说明样本合格，检测结果可靠，为ROS1融合阴性。

样本2的结果见图1D，内参反应和E32检测反应均有扩增信号，说明样本合格，检测结果可靠，为ROS1融合阳性，且ROS1融合外显子为32号外显子。PCR产物测序验证，用Chromas软件打开测序峰图结果，在Edit菜单中点击Reverse+Complement显示反义链，能找到引物SLC34A2-F2的序列(见图2)，该引物对应SLC34A2E4-ROS1E32融合类型，与该样本已知融合类型一致。

由以上的实验数据可以看出，实验检测结果与实际相符。通过对检测结果扩增信号的分析，可以准确的检测出ROS1融合基因。

Claims (3)

1.一种人ROS1融合基因检测方法，其特征在于，在CD74 E6-ROS1 E32，CD74 E6-ROS1E34，SLC34A2 E13-ROS1 E32，SLC34A2 E4-ROS1 E32，SLC34A2 E4-ROS1 E34，SDC4 E2-ROS1E32，SDC4 E4-ROS1 E32，SDC4 E4-ROS1 E34，TPM3 E8-ROS1 E35，EZR E10-ROS1 E34，LRIG3E16-ROS1 E35的ROS1融合partner基因的融合外显子上各设计一条引物，在ROS1的32、34、35外显子上各分别设计一条引物和Taqman-MGB探针；检测反应分3管进行，融合到ROS1的E32、E34、E35的融合类型分别检测，同时设置一个内参反应。

2.如权利要求1所述的一种人ROS1融合基因检测方法，其特征在于，所述引物和探针如下：

3.如权利要求1或2所述的一种人ROS1融合基因检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)、RNA提取；

RNA提取使用天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒；具体操作步骤如下：

(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；

(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；

(1.3)室温，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；

(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀；

(1.6)室温，12000rpm(～13,400×g)离心2min；

(1.7)用枪头吸除上清；

(1.8)打开管盖，室温或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；

(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μlProteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀；

(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min；

(1.11)室温，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；

(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；

(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀；

(1.14)转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.15)重复步骤(1.13)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.16)DNase I工作液的配制：取10μlDNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；

(1.17)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min；

(1.18)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RW1，室温，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(1.19)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

(1.20)重复步骤(1.19)；

(1.21)室温，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(1.22)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液；

(2)RNA反转录成cDNA；

RNA反转录使用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),按照试剂盒说明书操作；具体步骤如下：

(2.1)准备如下反应体系

(2.2)65℃孵育5min,然后立刻放回冰上；

(2.3)配制如下反应体系

温和的将上述体系混匀；

(2.4)然后按以下程序反应：

30℃ 10min

42℃ 60min

70℃ 15min

(2.5)结束后，立刻放回冰上，得到cDNA；

(3)实时荧光定量PCR检测；

荧光定量PCR反应体系(20μL):

PCR反应程序：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)；

反应体系中每条引物的终浓度均为200nM,探针终浓度均为100nM；

每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；

PC:以含ROS1融合基因片段的质粒10-7ng为模板；

NC:用无菌ddH2O做阴性对照；

内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够；

(4)结果分析

分析阳性对照和阴性对照是否正常，判断检测结果是否有效。然后根据内参反应和检测反应的扩增曲线，判读样本的检测结果。若检测到阳性结果，可将其PCR产物回收，用对应的R引物测序，序列比对，能找到哪一条正向引物的序列，为那一条引物所在外显子对应的ROS1融合类型。