CN108342479A - 一种ros1基因检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1 PCR扩增检测试剂由7‑9μL双蒸馏水、3‑4μL 5×Q solution、2‑3μL 25mM MgCl2、2‑3μL 10×buffer、2‑3μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、35外显子的Taqman‑MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；本发明提出了一种试剂盒，能够方便对ROS1进行基因检测，其制备简单，使用方便，成本低、易于实施。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种ROS1基因检测的试剂盒。
背景技术
ROS1基因编码一种受体酪氨酸激酶，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，ROS1重排的阳性率大约为1～2％,当ROS1与CD74、SLC34A2、SDC4等基因发生融合后，会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及其下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，进而引起肿瘤的发生。
2011年，美国食品和药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。克唑 替尼是一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR， c-Met)和ROS1。克唑替尼(Crizotinib)对于ROS1融合阳性的非小细胞肺癌(NSCLC)患者也 有显著疗效，因此ALK融合阴性时，检测ROS1基因的融合状态可以筛选能够从克唑替尼治疗 中获益的患者。
目前对人ROS1融合基因的检测方法中FISH和IHC不能用于肿瘤组织外的其他样本。荧光定量PCR检测灵敏度高，成本相对较低，通量高，周期短，而且适用的 样本范围较广，除可检测组织样本外，还可检测液体样本。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种ROS1基因检测的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1 PCR扩增检测试剂由7-9μL双蒸馏水、3-4μL 5×Q solution、2-3μL 25mM MgCl2、2-3μL 10×buffer、2-3μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
优选的，特异性引物组包括所列检测引物的其中四种。
优选的，特异性引物组包括所列检测引物的其中六种。
优选的，特异性引物组包括所列检测引物的全部八种。
优选的，每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
优选的，其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
优选的，PCR反应的程序为：40-50℃反应5min，1个循环；90-100℃反应5min，1个循环；90-100℃反应30s，55-62℃反应45s，共10个循环；92-98℃ 反应15s，55-62℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
本发明提出的一种ROS1基因检测的试剂盒，有益效果在于：本发明提出了一种试剂盒，能够方便对ROS1进行基因检测，其制备简单，使用方便，成本低、易于实施。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1PCR扩增检测试剂由7μL双蒸馏水、3μL 5×Q solution、2μL 25mM MgCl2、2μL 10×buffer、2μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
特异性引物组包括所列检测引物的其中四种。
每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
PCR反应的程序为：40℃反应5min，1个循环；90℃反应5min，1个循环；90℃反应30s，55℃反应45s，共10个循环；92℃ 反应15s，55℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
实施例2
一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1PCR扩增检测试剂由8μL双蒸馏水、3.5μL 5×Q solution、2.5μL 25mM MgCl2、2.5μL 10×buffer、2.5μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
特异性引物组包括所列检测引物的其中六种。
每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
PCR反应的程序为：48℃反应5min，1个循环；98℃反应5min，1个循环；98℃反应30s，60℃反应45s，共10个循环；95℃ 反应15s，60℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
实施例3
一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1PCR扩增检测试剂由8μL双蒸馏水、3.8μL 5×Q solution、2.8μL 25mM MgCl2、2.8μL 10×buffer、2.8μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
特异性引物组包括所列检测引物的其中六种。
每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
PCR反应的程序为：48℃反应5min，1个循环；98℃反应5min，1个循环；98℃反应30s，60℃反应45s，共10个循环；97℃ 反应15s，61℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
实施例4
一种ROS1基因检测的试剂盒，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1PCR扩增检测试剂由9μL双蒸馏水、4μL 5×Q solution、3μL 25mM MgCl2、3μL 10×buffer、3μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
特异性引物组包括所列检测引物的全部八种。
每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
PCR反应的程序为：50℃反应5min，1个循环；100℃反应5min，1个循环；100℃反应30s，62℃反应45s，共10个循环；98℃ 反应15s，62℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括ROS1 PCR扩增检测试剂和PCR产物纯化试剂，ROS1 PCR扩增检测试剂由7-9μL双蒸馏水、3-4μL 5×Q solution、2-3μL 25mMMgCl2、2-3μL10×buffer、2-3μL2mM dNTP、0.4μL 20μM特异性引物组、分别针对ROS1的32、34、 35外显子的Taqman-MGB探针、0.2μL Taq 酶组成；
探针如下：
探针1：FAM-GCCGCCACAGAGCGAATGGGAGTTTAG-MGB
探针2：FAM-CCATTTGCACTTTGAGGGAGTGTGGAG-MGB
探针3：FAM-TTAGTTCGAATTTTTATTCGTCTAG-MGB
特异性引物组包括以下检测引物的一组或多组：
引物1：CTTCGAATCGTAGTATACGGACA
引物2：TCACCACATATATCGTATTTTGCT
引物3：TGCAAATCAGTCGTCTATTTGCT
引物4：CATATTTGACGCTAATTTGTTGCTGTCTGCT
引物5：AATGTGTGGCAGTTGCCACATTGGTCT
引物6：CATATTTGTATCGTGTACCCGCCAGCATTG
引物7：AGTAGCTAGACTCGACAGGAGCTATG
引物8：GATATTATGCTATCTATGCCTATTG
PCR产物纯化试剂4mol/L醋酸铵和10×PCR缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，特异性引物组包括所列检测引物的其中四种。
3.根据权利要求1所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，特异性引物组包括所列检测引物的其中六种。
4.根据权利要求1所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，特异性引物组包括所列检测引物的全部八种。
5.根据权利要求1所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针 以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
6.根据权利要求1所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，其使用方法如下：
S1、ROS1 DNA提取：取目标细胞组织，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；
S2、PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、ROS1 PCR扩增检测试剂，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
S3、PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积PCR产物纯化试剂后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，置4℃冰箱备用；
S4、纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测；
每个检测反应均设置阳性对照(Positive Control,PC)和阴性对照(NegativeControl，NC)，同时设置内控(Internal Control，IC)；
PC:以含ROS1融合基因片段的质粒为模板；
NC:用无菌ddH2O做阴性对照；
内控IC:以cDNA为模板，扩增RNase P基因片段，检验提取及反转录是否正常，反应样本量是否足够。
7.根据权利要求6所述的一种ROS1基因检测的试剂盒，其特征在于，PCR反应的程序为：40-50℃反应5min，1个循环；90-100℃反应5min，1个循环；90-100℃反应30s，55-62℃反应45s，共10个循环；92-98℃ 反应15s，55-62℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
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| Title |
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| LUKAS BUBENDORF等: "Testing for ROS1 in non-small cell lung cancer: a review with recommendations", 《VIRCHOWS ARCH》 * |
| 黄杰等: "ROS1融合基因检测方法的建立", 《药物分析杂志》 * |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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